Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Маркелова Е.В. 1 Кириенко А.В. 1 Чикаловец И.В. 2 Догадова Л.П. 1

---

1 ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет Минздрава России»

2 ФГБУН «Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения РАН»

Обследованы пациенты с первичной открытоугольной глаукомой (ПОУГ) I-III стадиями (133 человека) и закрытоугольной глаукомой I-III стадиями (27 человек). Определение содержания цитокинов (IL-1β, IL-6, IL-2, IL-2pp, IL-17, IFN-γ, IL-10, IL-4, TGF-b1, TGF-b2) в сыворотке крови и в слезной жидкости у пациентов с ПОУГ и ПЗУГ разных стадий проведено методом твердофазного ИФА с применением специфических реактивов «R&D DiagnosticsInc.» (USA) согласно прилагаемым инструкциям. Для определения достоверности различий использовалась непараметрическая статистика (медиана, нижний и верхний квартиль, критерий Манна–Уитни Вилконсона, χ2), с использованием программы SPSSv 16. У пациентов ПОУГ и ПЗУГ выявлены существенные различия в цитокиновом профиле сыворотки крови и слезной жидкости. Показана существенная роль IL-17 в патогенезе ПОУГ и оценке ее степени тяжести. Установлен Тh I тип иммунного ответа при ПОУГ и Th I/Th II тип при ПЗУГ. Изменения локального цитокинового профиля сопряжены со стадией глауком. При ПОУГ I стадии выявлен Th 17/Th II тип иммунного ответа. При ПОУГ II стадии зарегистрирован Th I тип ответа с угнетением противовоспалительной активности клеток врожденного иммунитета. Третья стадия ПОУГ характеризовалась Th II типом иммунного ответа.

Статья в формате PDF

371 KB

цитокины

открытоугольная глаукома

закрытоугольная глаукома

1. Еричев В.П. Изменение некоторых иммунологических показателей слезной жидкости при избыточном рубцевании после антиглаукоматозных операций у пациентов с первичной открытоугольной глаукомой / В.П. Еричев, Л.В. Ганковская, Л.В. Ковальчук, О.А. Ганковская, А.Е. Дугина // Вестн. офтальмологии. – 2010. – № 3. – С. 25–29.

2. Земсков А.М. Клиническая иммунология / А.М. Земсков, В.М. Земсков, А.В. Караулов. – М.: Гоэтар-Медиа, 2008. – 432 с.

3. Иммунологические аспекты первичной открытоугольной глаукомы / Д.А. Рукина, Л.П. Догадова, Е.В. Маркелова и др. // РМЖ. Офтальмология. – 2011. – № 4. – С. 162–165.

4. Кетлинский С.А. Цитокины / С.А. Кетлинский, А.С. Симбирцев – СПб.: Фолиант, 2008. – 552 с.

5. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Мешкова Р.Я. Клиническая иммунология и аллергология. – М.: Гоэтар-Медиа, 2011. – 640 с.

6. Маркелова Е.В. Патогенетическая роль нарушений в системе цитокинов при инфекционно-воспалительных заболеваниях / Е.В. Маркелова, А.В. Костюшко, В.Е. Красников // Тихоок. мед. журнал. – 2008. – № 3. – С. 24–29.

7. Фрейдлин И.С. Иммунная система и противовирусный иммунитет / И.С. Фрейдлин. – Вопросы общей вирусологии / под ред. О.И. Киселева – СПб.: СПбГМА им. И.И. Мечникова, 2007. – С. 65–129.

8. Черных В.В. Особенности патогенеза начальной стадии первичной открытоугольной глаукомы, значимость иммуновоспалительного процесса / В.В. Черных, Н.С. Ходжаев, Е.Х. Тахчидзе, О.М. Горбенко, А.П. Шваюк, О.О. Обухова, А.Н. Трунова // Офтальмохирургия. – 2011. – № 2. – С. 50–53.

9. Ярилин А.А. Иммунология / А.А. Ярилин – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. – 752 с.

10. Balaiya S. Tumor necrosis factor-alpha (TNF-a) levels in aqueous humor of primary open angle glaucoma / S. Ba­laiya, J. Edwards, T. Tillis et al. // Clin. Ophthalmol. – 2011. – Vol. 5. – P. 553–556.

11. Chua J. Expression profile of inflammatory cytokines in aqueous from glaucomatous eyes / Chua J., Vania M., Cheung C.M.G. et al. // Molecular Vision. – 2012. – Vol.18. – P. 431–438.

12. Fuchshofer R. The role of TGF-β in the pathogenesis of primary open-angle glaucoma / R. Fuchshofer, E.R. Tamm // Cell Tissue Res. – 2012. – Vol. 347. – Р. 279–290.

13. Scglötzer-Schrehardt U. Role of transforming growth factor-beta1 and its latent form binding protein in pseudoexfoliation syndrome / U. Schlötzer-Schrehardt, M. Zenkel, M. Küchle et al. // Exp. Eye Res. – 2001. – Vol. 73. – P. 765–780.

Глаукома является одной из наиболее актуальных медико-социальных проблем, что обусловлено значительным ее распространением, трудностями ранней диагностики и неблагоприятного прогноза. Несмотря на большое количество научных публикаций, посвященных изучению патогенеза глаукомы, до настоящего времени до конца не выяснена роль иммунных механизмов в патогенезе развития первичных открытоугольной и закрытоугольной глауком [1, 10, 12].

Цитокины – ключевые гуморальные факторы воспаления, необходимые для реализации защитных функций, прежде всего, врожденного иммунитета. Для цитокиновой сети характерен ряд свойств [5, 9]. Основными из них являются: индуцибельность синтеза большинства самих цитокинов и их рецепторов, избыточность (перекрывание спектров действия разных цитокинов), их взаимосвязи и взаимодействия и преимущественно локальность действия [2, 4, 11]. В многочисленных работах показано, что ни один из цитокинов не существует и не проявляет своей биологической активности изолированно. Результаты их взаимодействия могут приводить к синергизму, антогонизму, а иногда быть неожиданными [6, 7]. В литературе представлены публикации с неоднозначными суждениями о направленности, степени изменений про- и противовоспалительных цитокинов у пациентов с глаукомой как на системном, так и на локальном уровне. Отсутствуют исследования по сравнительной оценке состояния цитокиновой сети у пациентов с открытоугольной и закрытоугольной глаукомами. Это и определило цель настоящего исследования

Цель: оценить локальный и системный уровень про- и противовоспалительных цитокинов у пациентов с первичной открытоугольной и первичной закрытоугольной глаукомами.

Материалы и методы исследования

Были обследованы пациенты с первичной открытоугольной глаукомой (ПОУГ) I-III стадиями (133 человека) и закрытоугольной глаукомой I-III стадиями (27 человек). Определение содержания цитокинов (IL-1β, IL-6,IL-2, IL-2pp, IL-17, IFN-γ,IL-10, IL-4, TGF-b1, TGF-b2) в сыворотке крови и в слезной жидкости у пациентов с ПОУГ и ПЗУГ разных стадий проведено методом твердофазного ИФА с применением специфических реактивов «R&D DiagnosticsInc.» (USA). Контролем служили данные, полученные при обследовании 50 практически здоровых добровольцев. Для определения достоверности различий использовалась непараметрическая статистика (медиана, нижний и верхний квартиль, критерий Манна–Уитни-Вилкоксона, χ2), с использованием программы SPSSv 16.

Результаты исследования и их обсуждение

При анализе цитокинового профиля сыворотки крови пациентов с глаукомой было установлено, что содержание большинства исследованных провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-6, IL-2, IL-17) повышалось (табл. 1). Исключение составили: IFNγ – уровень которого в сыворотке крови не отличался от контрольных величин и растворимый рецептор IL-2, количество последнего, напротив, было снижено (р < 0,01).

Таблица 1

Содержание цитокинов в сыворотке крови обследованных с глаукомой и контрольной группах

Примечания: статистическая достоверность различий показателей с группой контроля: р < 0,05 – *; р < 0,01 – **; р < 0,001 – ***.

При оценке уровня противовоспалительных цитокинов не зафиксировано достоверных различий в содержании IL-10 и TGFβ1 в общей группе пациентов с глаукомой, но установлен низкий уровень IL-4 по сравнению с контролем (р < 0,05). Тогда как концентрация TGFβ2 статистически значимо повышалась у пациентов с глаукомой (252,43 (201,21;276,15) пг/мл против 163,21 (83,67; 231,23) пг/мл; р < 0,05).

При анализе цитокинового профиля сыворотки крови у пациентов с ПОУГ и ПЗУГ разных стадий выявлены существенные различия (табл. 2), позволяющие считать ПОУГ заболеванием, характеризующимся развитием системной воспалительной реакции, что подтверждает сосудистую и метаболическую теории патогенеза ПОУГ. Установлено, что уже при начальной стадии ПОУГ в крови возрастает содержание IL-6 и, особенно, IL-17, определяется дефицит противовоспалительных медиаторов – IL-4, TGFβ1 и SRIL-2.

При второй стадии ПОУГ уровень провоспалительных цитокинов увеличивался в несколько раз. У пациентов этой группы определена гиперцитокинемия IL-17, IL-2, IL-1β; возрастал уровень IL-6, IFNγ, TGFβ2. При сохранении низких значений IL-4, определен дефицит IL-10.

Таблица 2

Содержание цитокинов в сыворотке крови у пациентов с ПОУГ и ПЗУГ разных стадий

Примечания: статистическая достоверность различий между группами: р – с группой контроля: р < 0,05 – *;р < 0,01 – **;р < 0,001 – ***; р1,2,3 – сравниваемые группы; # – р < 0,05 между группами пациентов с разными клиническими формами глаукомы (ПОУГ и ПЗУГ); • – n = чел./глаз.

В продвинутой (III стадии) ПОУГ эти закономерности сохраняются, но возрастала уровень SRIL-2 и относительно повышается (по сравнению со II стадией) IL-10 содержание в сыворотке крови (табл. 2).

При анализе цитокинового профиля сыворотки крови пациентов с I стадией ПЗУГ большинство исследованных цитокинов не отличалось от референсных величин за исключением низкого уровня SRIL-2 (табл. 2). При сравнительной оценке с аналогичными показателями у пациентов с ПОУГ зафиксировано статистически значимое различие в содержании IL-17 (χ2 = 4,86 против р < 0,05 2-й степени свободы). Что позволяет считать уровень IL-17, превышающий 30,00 пг/мл, дополнительным дифференциально-диагностическим признаком І стадии ПОУГ.

Таблица 3

Содержание цитокинов в слезной жидкости у пациентов с ПОУГ и ПЗУГ разных стадий

Примечания: статистическая достоверность различий между группами: р – с группой контроля: р < 0,05 – *;р < 0,01 – **;р < 0,001 – ***; р1,2,3 – сравниваемые группы; # – р < 0,05 между группами пациентов с разными клиническими формами глаукомы (ПОУГ и ПЗУГ); • – n = чел./глаз.

У пациентов со II стадией ПЗУГ цитокиновый профиль сыворотки крови также мало отличался от референсных величин. У них определено умеренное увеличение IL-17 по сравнению с контролем, но значения IL-17 были в среднем в 2 раза ниже, чем у пациентов с ПОУГ. Концентрация IL-17, превышаюшая 60,00 пг/мл, определена как стабильный признак развитой стадии ПОУГ (χ2 = 5,84 при р < 0,01; 1-й степени свободы).

При III стадии ПЗУГ выявлен целый ряд изменений в цитокиновом профиле: повышение содержания IL-6, IL-17, IL-10, TGFβ1 и снижение количества TGFβ2 по сравнению с группой контроля.

Сравнительный анализ цитокинового профиля крови пациентов с ПОУГ и ПЗУГ II-III стадии выявил, что ПОУГ характеризуется увеличением IL-1β, IL-2, IL-17, IFNγ и TGFβ при одновременном снижении IL-10, IL-4 и TGFβ1.

Для более полного представления о цитокиновом профиле сыворотки крови у пациентов с глаукомой нами был рассчитан удельный вес каждого из них (рисунок).

Оценка удельного веса основных про- и противовоспалительных цитокинов наглядно демонстрирует увеличение доли провоспалительных цитокинов и дефицита противовоспалительных IL-4, IL-10 при ПОУГ.

При ПЗУГ удельный вес провоспалительных цитокинов повышался незначительно за исключением уровня IL-17 и IL-6. Доля противовоспалительных медиаторов (IL-4 и IL-10), напротив, была достоверно выше по сравнению с ПОУГ, но ниже, чем в контроле.

Оценка удельного веса цитокинов в профиле сыворотки крови как пациентов с ПОУГ, так и ПЗУГ свидетельствует о значительной роли IL-17 в патогенезе глаукомы, что подтверждает мнение ряда авторов [1, 8] и может косвенно свидетельствовать о значении аутоиммунных механизмов при глаукомах.

Цитокиновый профиль сывороток крови пациентов с разными клинико-лабораторными проявлениями глаукомы

Расчет коэффициента, отражающего поляризацию иммунного ответа, позволил сделать заключение, что при ПОУГ регистрируется Th I тип иммунного ответа, а при ПЗУГ – смешанный Th1/Th2 тип (10,00 ± 0,20 против 1,5 ± 0,04 при ПЗУГ и 1,35 ± 0,02 у здоровых).

Отдельно проведена сравнительная оценка концентраций трансформирующих ростовых факторов (TGFβ1 и TGFβ2) в сыворотке крови больных с ПОУГ и ПЗУГ и установлен разнонаправленный характер их изменений. Выявлено, что при II и III стадиях ПЗУГ уровень TGFβ1 существенно выше, чем у пациентов с ПОУГ, тогда содержание TGFβ2, напротив, значимо повышено у пациентов с ПОУГ. Это подтверждает патогенетическую роль TGFβ2 при первичной открытоугольной глаукоме [12], вероятно, стимулированный им фиброз вносит вклад в нарушение оттока внутриглазной жидкости и повышение ВГД. Наши исследования подтвердили данные ряда авторов [12, 13]. В то же время не зафиксировано увеличения в крови TGFβ1 при ПОУГ, а при I и III стадиях было определено снижение его уровня по сравнению с контрольной группой. Эти результаты согласуются с данными, полученными Д.А. Рукиной с соавт. (2011) [3]. Не до конца понятен механизм этих различий, но полученные результаты позволяют разработать дополнительный дифференциально диагностический признак ПОУГ II–III стадий: увеличение TGFβ2 в сыворотке крови выше 205 пг/мл сопряжено с ПОУГ II стадии (χ2 = 4,26, р < 0,05 при 2 ст. свободы) и ПОУГ III стадии (χ2 = 5,86, р < 0,01 при 2 ст. свободы).

Как известно, оценка локального уровня цитокинов, продуцируемых в органе-мишени, позволяет более точно выявить изменения, происходящие в органе зрения, в том числе при глаукоме. Результаты проведенных нами исследований констатируют гиперцитокинемию большинства протестированных медиаторов в общей когорте пациентов за исключением – IL-10, TGFβ1. Наиболее нарастал уровень IL-2 (в 7,5 раза), IL-17 (в 7 раз), IL-1β (в 5 раз), несколько меньше увеличивалось содержание IFNγ и IL-4 (в 2 раза), SRIL-2 (в 1,6 раза), TGF β2 (в 1,5 раза). Концентрация IL-10 в среднем была в пределах референсных величин, а содержание TGF β1 снижалось.

Анализ локального содержания цитокинов в зависимости от стадии процесса позволил выявить целый ряд закономерностей, которые в целом свидетельствуют о разных патогенетических механизмах ПОУГ и ПЗУГ (табл. 3). У пациентов с ПОУГ уже на ранней стадии зарегистрирована гиперпродукция IL-17 и IL-10, умеренное увеличение IL-1β, TGFβ2, SRIL-2 на фоне дефицита IFNγ и снижения TGFβ1. Расчет соотношения IFNγ к IL-4 позволил констатировать, что у этой категории пациентов превалирует Th 2 тип иммунного ответа на фоне гиперактивации Th 17 типа. При II стадии ПОУГ отмечено увеличение локального уровня Th 1 маркерного цитокина – IFNγ, повышение содержания IL-1β, IL-2 и его растворимого рецептора. Сохраняется увеличение TGFβ2 и IL-17, но значения последнего достоверно ниже, чем при I стадии болезни. Выявлен пониженный уровень TGFβ1 (не отличающийся от I стадии ПОУГ), определен дефицит IL-10. Проводя комплексную оценку локального уровня цитокинов при II стадии ПОУГ, выявлен Th 1 тип ответа с угнетением противовоспалительной активности клеток врожденного иммунитета.

В продвинутой стадии ПОУГ зафиксировано нарастание как ранних, так поздних провоспалительных цитокинов – IL-1β и IL-6 и повышенный уровень (не отличающийся от II стадии) IL-17 и IFNγ. Выявлено относительное снижение (до референсных величин) локальной концентрации IL-2 и его растворимого рецептора, что может свидетельствовать об истощении их продукции или повышенном образовании соответствующих комплексов.

Оценка противовоспалительных медиаторов у пациентов с III стадией ПОУГ показала изменение баланса в сторону усиления продукции и секреции большинства из них: в 4 раза увеличился уровень IL-4, статистически значимо (по сравнению с контролем и I стадией ПОУГ) нарастало содержание TGFβ2, концентрация IL-10 умеренно повышалась (по сравнению со II стадией ПОУГ). Отличительным признаком ПОУГ ІІІ стадии был локальный дефицит TGFβ1 (табл. 3). Увеличение IFNγ и IL-4 с превалированием уровня последнего, характеризует Th 2 тип иммунного ответа при ПОУГ III стадии.

Таким образом, при анализе цитокинового профиля установлено, что в сыворотке крови пациентов с глаукомой определяется повышение уровня IL-1β, IL-6, IL-2, IL-17 и TGFβ2 и снижение количества IL-4, при этом в целом при ПОУГ регистрируется Тh I тип иммунного ответа при ПОУГ и Th I/Th II тип при ПЗУГ.

У пациентов с ПОУГ зарегистрированы различия системного и локального цитокинового профиля, зависящие от стадии болезни. Показана существенная роль IL-17 в патогенезе ПОУГ и оценке ее степени тяжести. Изменения локального цитокинового профиля сопряжены со стадией глауком. При ПОУГ I стадии выявлен Th 17/Th II тип иммунного ответа. При ПОУГ II стадии зарегистрирован Th I тип ответа с угнетением противовоспалительной активности клеток врожденного иммунитета. Третья стадия ПОУГ характеризовалась Th II типом иммунного ответа.

При I стадии ПЗУГ локально большинство цитокинов было в пределах референсных значений, за исключением умеренного повышения SRIL-2 и относительного увеличения TGFβ2. В сыворотке крови у этих пациентов также не выявлено существенных колебаний исследованных цитокинов. Зафиксировано умеренное повышение IL-4 и сниженный уровень SRIL-2.

У пациентов со II стадией ПЗУГ зафиксировано умеренное увеличение IL-1β, IL-17 и TGFβ1. Цитокиновый профиль слезной жидкости при II стадии ПЗУГ имел больше отличий: определены гиперпродукция IL-2, SRIL-2, IL-17, повышение IL-1β.

При III стадии ПЗУГ сывороточный профиль цитокинов характеризовался выраженным увеличением TGFβ1, недостаточностью TGFβ2, повышением уровня IL-6 и IL10. Особенностью локального цитокинового профиля при III стадии ПЗУГ было увеличение TGFβ1, IFNγ и относительное повышение IL-10.

Рецензенты:

Запорожец Т.С., д.м.н., главный научный сотрудник лаборатории иммунологии, ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова» СО РАМН, г. Владивосток;

Просекова Е.В., д.м.н., профессор, заведующая кафедрой клинической лабораторной диагностики, общей и клинической иммунологии, ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Владивосток.

Работа поступила в редакцию 04.02.2014.

Библиографическая ссылка