Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,674

УЧАСТИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНА G И ЕГО СУБКЛАССОВ В РАЗВИТИИ И ТЕЧЕНИИ АУТОИММУННОЙ ПУЗЫРЧАТКИ

Махнева Н.В. 1, 2 Давиденко Е.Б. 1, 2 Зайденов В.А. 3 Белецкая Л.В. 3
1 Московский научно-практический центр дерматовенерологии и косметологии Департамента здравоохранения города Москвы
2 Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского
3 ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова»
Аутоиммунная пузырчатка – это группа аутоиммунных буллезных дерматозов кожи и слизистых оболочек, где основная патогенетическая роль принадлежит циркулирующим аутоантителам иммуноглобулина класса G (IgG). Влияние IgG на развитие аутоиммунной пузырчатки не вызывает сомнений. Однако роль субклассов IgG в патогенезе аутоиммунной пузырчатки все еще до конца не ясна. Поскольку субклассы IgG ассоциируются с различными функциональными и антигенными свойствами, то и вопрос изучения их роли в развитии и течении пузырчатки остается до сих пор актуальным. С помощью прямого и непрямого методов иммунофлюоресценции нами были обследованы 57 больных аутоиммунной пузырчаткой в различные периоды развития патологического процесса. Выявлена вариабельность частоты выявления циркулирующих аутоантител и фиксированных иммунных комплексов в зависимости от периода развития аутоиммунной пузырчатки, продемонстрирована поликлональность гуморального ответа. В ходе проведения исследования было выявлено, что основную патогенетическую роль в развитии и течении этого буллезного дерматоза играют IgG4 и/или IgG1-аутоантитела, что совпадает с мнением ряда авторов.
аутоиммунная пузырчатка
патогенез
иммуноглобулин G
субклассы иммуноглобулина G
1. Белецкая Л.В., Гнездицкая Э.В. Реакция сывороток больных вульгарной пузырчаткой с антигенами склеивающей субстанции телец Гассаля тимуса человека и животных // Бюллетень экспертной биологии. – 1974. – № 6. – С. 87–90.
2. Белецкая Л.В., Данилова Т.А. Метод иммунофлюоресценции в иммунопатологии / В кн. Иммунолюминесценция в медицине / Под ред. Левиной Е.Н. – М.: Медицина, 1977. – С. 145–183
3. Белецкая Л.В., Махнева Н.В. Меченые антитела в нормальной и патологической патологии (атлас). – М.: МНИПИ, 2000. – 108 с.
4. Лейси А. Флюорохромы //Световая микроскопия в биологии. – М.: Мир, 1992. – С. 235.
5. Махнева Н.В. Клинические и патогенетические аспекты иммуноморфологических исследований материала больных пузырчаткой и другими буллезными дерматозами: дис. … канд. мед. наук: 14.00.11., 14.00.36. – М., 1997. – 183 с.
6. Махнева Н.В., Белецкая Л.В. Иммунофлюоресценция в клинике аутоиммунных буллезных дерматозов: Пособие для врачей. – М.: Академия Естествознания, 2010. – 44 с.
7. Машкиллейсон А.Л. Поражение слизистой оболочки полости рта и губ при кожных болезнях / В рук-ве для врачей «Дифференциальная диагностика кожных болезней» / под ред. Беренбейна Б.А., Студницина А.А. – М.: Медицина, 1989. – С. 582–616.
8. Самцов А.В., Белоусова И.Э. Буллезные дерматозы: монография. – СПб.: ООО «Изательско-полиграфическая компания «КОСТА», 2012. – 144 с.
9. Bhol K., Mohimen A., Ahmed A.R. Correlation of subclasses of IgG with disease activity in pemphigus vulgaris // Dermatology. – 1994. – Vol. 189. – Suppl. 1. – P. 85–89.
10. Bhol K., Natarajan K., Nagarwalla N., Mohimen A., Aoki V., Ahmed R.A. Correlation of peptide and IgG subclass with pathogenic and nonpathogenic autoantibodies in pemphigus vulgaris: A model for autoimmunity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1995. –Vol. 92. – P. 5239–5243.
11. Kanwar А.J., Gurvinder P.T., Gursharan K.B. IgG subclasses in pemphigus vulgaris // Indian J. Dermatol. Venereol. Leprol. – 1997. – Vol. 63. – P. 20–21.
12. Michael D., Varda K., Bilhah H., Albert B.C., Miriam S. Determination of IgG subclasses in patients with pemphigus with active disease and in remission // Arch. Dermatol. – 1989. – Vol. 125. – P. 787–790.
13. Sam W.H., Sehur P.H. Studies of antibodies in pemphigoid and pemphigus // J. Lab. Clin. Med. – 1973. – Vol. 82. – P. 249–254.
14. Schur P.H. IgG subclasses – a review // Ann. Allergy. – 1987. – Vol. 58. – P. 89–96.
15. Warren S.J.P., Arteaga L., Rivitti E.A., Aoki V., Hans-Filho G., Qaqish B.F. The role of IgG subclass switch in the pathogenesis of fogo selvage // J. Invest. Dermatol. – 2003. – Vol. 120. – P. 104–108.

Аутоиммунная пузырчатка – это группа опасных для жизни аутоиммунных буллезных дерматозов, основным механизмом развития которых является потеря связи (адгезии) между кератиноцитами (акантолиз) с последующим образованием внутриэпидермальных пузырей [7, 8]. Акантолиз при аутоиммунной пузырчатке возникает в результате воздействия аутоантител к антигенам межклеточной связывающей субстанции многослойного плоского эпителия. Аутоантитела относятся к классу иммуноглобулина G (IgG), и они не реагируют ни с одним из антигенов тканей других органов, кроме антигенов межклеточной субстанции многослойного плоского эпителия и телец Гассаля тимуса человека и животных [1, 3, 6]. Патогенетическая роль этих аутоантител была подтверждена экспериментально на животных. Клинические признаки заболевания были воспроизведены путем внутриперитонеального введения сывороток, содержащих IgG-антитела, от больных пузырчаткой [13].

Несмотря на то, что патогенетическая роль IgG-аутоантител при аутоиммунной пузырчатке не вызывает сомнений, роль его субкласcов в развитии заболевания до сих пор остается спорным вопросом. Многие авторы при исследовании пациентов с пузырчаткой обнаружили, что в сыворотке у большинства пациентов были выявлены все 4 субкласса IgG. Было предположено, что IgG-антитела пузырчатки содержат 4 вида субклассов [11]. При дальнейшем изучении этого вопроса было отмечено, что в образцах сыворотки пациентов с пузырчаткой распределение субклассов IgG все-таки различно [10]. Во многих исследованиях было показано, что у пациентов в активной стадии аутоиммунной пузырчатки выявляются высокие титры IgG1 и IgG4, что свидетельствует об их патогенетической роли при данном заболевании [9, 15]. Другие авторы свидетельствуют о том, что гуморальный ответ в активной стадии аутоиммунной пузырчатки обусловлен чаще субклассом IgG4, а в стадии ее ремиссии – IgG1 [9, 12].

Цель исследования ‒ изучение роли IgG и его субклассов в разные периоды развития аутоиммунной пузырчатки.

Материалы и методы исследования

Были изучены образцы сывороток крови и биоптатов клинически интактных участков кожи 57 больных аутоиммунной пузырчаткой с использованием прямого и непрямого методов иммунофлюоресценции. При этом у 34 пациентов аутоиммунная пузырчатка была диагностирована впервые, у 13 наблюдалось обострение заболевания, у 10 других отмечена стадия ремиссии.

С целью выявления фиксированных антител (иммуноглобулинов) и полных иммунных комплексов исследовали образцы клинически интактной кожи 54 больных аутоиммунной пузырчатки в разные периоды ее развития (в клинически пораженной коже может наблюдаться полная дезорганизация ткани, что не позволит провести адекватное исследование). У 33 больных диагноз аутоиммунной пузырчатки был поставлен впервые, 12 других больных были обследованы в период обострения патологического процесса и 9 больных – в стадии клинической ремиссии болезни. Применяли классический прямой метод иммунофлюоресценции [2] с использованием моноспецифических люминесцирующих сывороток против основных классов иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM) (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. М.Ф. Гамалеи АМН РФ; ИМТЕК, Москва), люминесцирующих сывороток против С3 компонента комплемента (CHEMICON, Австралия) и фибриноген/фибрина (DAKO CYTOMATION, Дания). Использовали моноклональные антитела к субклассам иммуноглобулина (Ig) G (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) (SIGMA-ALDRICH, USA).

Серийные криостатные срезы помещали на предметное стекло, подсушивали в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем срезы промывали сменяемым физиологическим раствором с фосфатным буфером (РВS), рН 7,0-7,4, в течение 3–5 мин с целью удаления не связанных с тканями растворимых белков и обрабатывали люминесцирующей сывороткой (метка изотиоцианатом флюоресцеина) против иммуноглобулинов классов G, М, А, С3-компонента комплемента и фибриноген/фибрина в течение 30 мин. Затем вновь промывали РВS в течение 3–5 мин и заключали под покровное стекло в 60 % нейтральный глицерин. С целью предохранения срезов от выгорания в люминесцентном микроскопе в глицерин добавляли кристаллик пара-фенилендиамина [4]. Для контроля одновременно проводили изучение фиксированных 96 этанолом криостатных срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, в световом микроскопе.

В случаях обнаружения IgG в межклеточных пространствах эпидермиса дополнительно исследовали серийные криостатные срезы кожи этих пациентов с использованием антител к субклассам IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4). Применялся классический прямой метод иммунофлюоресценции, описанный выше.

Непрямым методом иммунофлюоресценции [2, 3, 5] с применением люминесцирующей сыворотки против иммуноглобулина класса G (IgG) (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. М.Ф. Гамалеи АМН РФ) человека мы исследовали образцы сывороток крови 36 больных аутоиммунной пузырчаткой в разные периоды ее развития, из них 18 больным диагноз аутоиммунной пузырчатки был поставлен впервые, 8 больных были обследованы в период обострения болезни и 10 больных – в период клинической ее ремиссии. В качестве субстрата использована кожа теленка. Диагнозы всех больных были подтверждены с помощью биоптатов кожи прямым методом иммунофлюоресценции.

Нефиксированные криостатные срезы кожи теленка толщиной 4–5 микрон тщательно промывали физиологическим раствором PBS (pH 7,0-7,4) в течение 10 минут. Затем срезы обрабатывали немеченой сывороткой больных. Эту сыворотку применяли в максимальном количестве разведений. Обработку срезов проводили во влажной камере в течение 45 минут. Далее срезы промывали в течение 3–5 минут с помощью PBS (pH 7,0–7,4), обрабатывали мечеными сыворотками против IgG человека и С3 компонента комплемента в течение 30 минут, вновь промывали в течение 3–5 минут PBS и заключали под покровное стекло в 60 % нейтральный глицерин. С целью предохранения срезов от выгорания в люминесцентном микроскопе в глицерин добавляли кристаллик пара-фенилендиамина [4]. Препараты исследовали с помощью люминесцентного микроскопа LABORLUX фирмы LEIKA с объективом х40. Учитывали максимальное количество разведений, при которых получена четкая положительная реакция.

В случае выявления циркулирующих IgG-аутоантител, сыворотки обследованных пациентов были исследованы с использованием моноклональных антител к субклассам IgG (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) человека (SIGMA-ALDRICH, USA) непрямым методом иммунофлюоресценции, описанным выше. В качестве субстрата также использованы серийные срезы кожи теленка.

Результаты исследования и их обсуждение

Процент выявления циркулирующих IgG-аутоантител к антигенам межклеточной связывающей субстанции в сыворотке больных аутоиммунной пузырчаткой составил 80,5 % (рисунок, а). Выявление фиксированного IgG в серийных криостатных срезах клинически интактных участков кожи больных прямым методом иммунофлюоресценции составило 94,4 % (рисунок, б).

pic_36.tif pic_37.tif

Иммуногистохимическое исследование материала больных аутоиммунной пузырчаткой. х400: a – криостатный срез кожи теленка. Обработка сывороткой больного аутоиммунной пузырчаткой. Непрямой метод иммунофлюоресценции. Реакция в межклеточной связывающей субстанции всех слоев эпидермиса; б – криостатный срез кожи больного аутоиммунной пузырчаткой. Обработка меченой сывороткой против IgG человека. Прямой метод иммунофлюоресценции. Фиксация IgG в межклеточной связывающей субстанции базального и шиповатого слоев эпидермиса

Анализ частоты выявления циркулирующих IgG-аутоантител к антигенам межклеточной связывающей субстанции многослойного плоского эпителия показал их вариабельность в зависимости от периода развития аутоиммунной пузырчатки. Так, циркулирующие IgG-аутоантитела чаще обнаруживаются при впервые выявленном заболевании (83,3 %) и в стадии его обострения (87,5 %), реже (70 %) они обнаруживаются у больных с аутоиммунной пузырчаткой в стадии клинической ремиссии. Анализ частоты выявления фиксированного IgG показал идентичную картину вариабельности фиксированного IgG в зависимости от периодов развития болезни. Так, в стадии активного процесса (впервые диагностируемая аутоиммунная пузырчатки и период ее обострения) фиксированный IgG выявлялся в 100 % случаях, в период клинической ремиссии – в 66,7 % случаях.

При изучении субклассовой характеристики циркулирующих IgG-аутоантител непрямым методом иммунофлюоресценции в разные периоды развития аутоиммунной пузырчатки было выявлено, что в сыворотке крови IgG1-аутоантитела обнаруживались в 60,1 % случаев. При этом при впервые выявленном заболевании циркулирующие IgG1-аутоантитела против антигенов межклеточной связывающей субстанции эпидермиса выявлялись в 75 % случаев, в стадии обострения – в 57,1 % случаев, в стадии клинической ремиссии – в 28,6 % случаев. Специфические IgG2-аутоантитела были обнаружены у всех (100 %) обследованных больных независимо от стадии патологического процесса. Специфические IgG3-аутоантитела были выявлены в 41,4 % случаях. При впервые выявленном заболевании циркулирующие IgG3-аутоантитела против антигенов межклеточной связывающей субстанции эпидермиса выявлялись в 40 % случаях, в стадии обострения – в 57,1 % случаях, в стадии клинической ремиссии – в 28,6 % случаях. Циркулирующие IgG4-аутоантитела к антигенам межклеточной связывающей субстанции выявлялись в 86,2 % случаях. При впервые выявленном заболевании циркулирующие IgG4-аутоантитела обнаружены в 93,3 % случаях, в стадии обострения – в 100 % случаях, в стадии клинической ремиссии – в 71,4 % случаях.

При изучении субклассовой характеристики фиксированного IgG в серийных криостатных срезах клинически интактных участков кожи больных прямым методом иммунофлюоресценции в разные периоды развития аутоиммунной пузырчатки было выявлено, что фиксированный IgG1 обнаруживался у 64,7 % больных. При впервые выявленном заболевании фиксированный IgG данного субкласса был обнаружен в 92,8 % случаях, при обострении патологического процесса – в 50 % случаях, в стадии клинической ремиссии – в 12,5 % случаев. Фиксированный IgG2 в межклеточной связывающей субстанции эпидермиса был обнаружен в 19,6 % случаев. При впервые выявленном заболевании фиксированный IgG данного субкласса был выявлен в 27,6 % случаях, при обострении патологического процесса – в 20 % случаях, в стадии клинической ремиссии – ни у одного обследуемого пациента. Фиксированный IgG3 в межклеточной связывающей субстанции эпидермиса не был обнаружен ни у одного обследуемого больного. Фиксированный IgG4 в межклеточной связывающей субстанции был обнаружен в 94,1 % случаев. При впервые выявленном заболевании фиксированный IgG данного субкласса был обнаружен в 92,9 % случаях, при обострении патологического процесса – в 100 % случаях, в стадии клинической ремиссии – 100 %.

Сравнительная характеристика данных, полученных методами иммунофлюоресценции, демонстрирует, что фиксированный IgG в межклеточной связывающей субстанции выявляется чаще, чем циркулирующие в крови IgG-аутоантитела (94,4 и 80,5 % соответственно). При этом фиксированный IgG в ткани обнаруживается чаще (66,7 %) в активный период болезни (впервые выявленная и стадия обострения), а циркулирующие IgG-аутоантитела в сыворотке крови – чаще (70 %) в стадии клинической ремиссии болезни. Это свидетельствует о наличии прочного гистогематического барьера между эпителием и кровотоком, который способствует уменьшению поступления аутоантител в большом количестве в кожу и создает условия для клинической ремиссии.

Наиболее часто (100 %) выявляемыми являются циркулирующие IgG2-аутоантитела. Эти аутоантитела присутствуют в сыворотке крови всех больных, страдающих пузырчаткой независимо от ее клинической формы и стадии развития. Вторыми по частоте встречаемости (86,2 %) являются IgG4-аутоантитела со 100 % их участием в стадии обострения патологического процесса и 93,3 % – в стадии первоначального развития болезни. Наличие циркулирующих IgG1-аутоантител установлено в 60,1 % случаях. При этом отмечена тенденция снижения их роли в развитии аутоиммунного процесса. Так, при первоначальном развитии аутоиммунной пузырчатки IgG1-аутоантитела встречаются в 75 % случаях, в стадии обострения – в 57,1 % случаях, в стадии клинической ремиссии – в 28,6 %. Циркулирующие IgG3-аутоантитела выявлялись в 41,4 % случаях с наибольшей (57,1 %) их активностью в стадии обострения болезни.

В тканях наиболее часто (94,1 %) выявлялся фиксированный IgG4. При этом отмечено его активное участие в стадии обострения и клинической ремиссии заболевания (100 %), реже – на первоначальном этапе развития (92,9 %) аутоиммунной пузырчатки. Вторым по частоте выявляемости (64,7 %) был фиксированный IgG1 с активным его участием на начальном этапе развития аутоиммунного процесса (92,8 %); реже данный субкласс фиксированного IgG встречался в периоды обострения (50 %) и клинической ремиссии (12,5 %) аутоиммунной пузырчатки. Фиксированный IgG2 в межклеточной связывающей субстанции встречался гораздо реже (19,6 %) и только в периоды активного иммунопатологического процесса: в стадии первоначального развития болезни (27,6 %) и ее обострения (20 %). Участие фиксированного IgG3, как выше было указано, в развитии и течении аутоиммунной пузырчатки не было выявлено ни в одном из обследуемых случаев.

Таким образом, специфические аутоантитела содержат одновременно два или более субкласса. При этом наиболее выраженная реакция отмечена с IgG4 и/или IgG1-аутоантителами, что подтверждает их основную патогенетическую роль в развитии и течении данного буллезного дерматоза. Преобладание IgG2/IgG4-антител свидетельствует о хронической антигенной стимуляции, преимущественно гликопротеиновой природы [14].

При анализе данных, полученных с помощью прямого метода иммунофлюоресценции, отмечено преобладание фиксированных IgG1 и IgG4 в межклеточной связывающей субстанции эпидермиса, что подтверждает мнение ряда авторов [9, 12] об основной патогенетической роли данных субклассов в развитии аутоиммунной пузырчатки. Интересно, что на первоначальном этапе развития аутоиммунной пузырчатки одинаково главенствующую роль играют фиксированные IgG1 и IgG4 (92,8 и 92,9 % соответственно). В дальнейшем процессе развития и течения аутоиммунной пузырчатки доминирующая роль остается за фиксированным IgG4. Последний выявляется в межклеточной связывающей субстанции эпидермиса в стадиях обострения (100 %) и клинической ремиссии (100 %) аутоиммунной пузырчатки. Аналогичная картина наблюдалась и при выявлении циркулирующих аутоантител. Так, на фоне высокой частоты выявления циркулирующих IgG4-аутоантител в течение всего периода развития аутоиммунной пузырчатки происходит снижение частоты выявления циркулирующих IgG1-аутоантител от первоначального развития (75 %) иммунопатологического процесса до периодов его обострения (57,1 %) и клинической ремиссии (28,6 %). Наличие IgG1/IgG4-аутоантител у больных с впервые выявленной аутоиммунной пузырчаткой и преобладание IgG4-аутоантител при обострении и в стадии клинической ремиссии патологического процесса говорит о возможном «переключении» синтеза субклассов IgG с IgG1 на IgG4. Это наблюдение может способствовать прогнозированию перехода аутоиммунной пузырчатки из стадии активного процесса (впервые выявленное заболевание) в стадию клинической ремиссии.

При проведении исследования было отмечено различие не только частоты выявления фиксированных и циркулирующих антител, но и различия антигенов-мишеней для них. Так, для циркулирующих IgG-аутоантител во всех 100 % случаях мишенью являлась межклеточная связывающая субстанция базального слоя с одновременным вовлечением в иммунопатологический процесс антигенов межклеточной связывающей субстанции шиповатого (86,7 %) и зернистого (58,6 %) слоев эпидермиса. При этом для циркулирующих IgG1-, IgG3- и IgG4-аутоантител в большинстве случаев (94,5; 91,7и 100 % случаев соответственно) антигенами-мишенями являлась межклеточная связывающая субстанция базального и шиповатого слоев эпидермиса. Для IgG2-аутоантител во всех (100 %) случаях мишенью служила межклеточная связывающая субстанция зернистого слоя эпидермиса.

При изучении биоптатов клинически интактных участков кожи больных прямым методом иммунофлюоресценции продемонстрировано, что в большинстве (97,8 %) случаев фиксированные иммунные комплексы обнаруживались в межклеточной связывающей субстанции базального и шиповатого слоев эпидермиса (см. рисунок, б). При этом межклеточная связывающая субстанция базального и шиповатого слоев эпидермиса являлась мишенью и для фиксированных IgG1, IgG2, IgG4 (90,1 %, 80 %, 68,75 % соответственно) без участия IgG3.

Заключение

Результаты иммунологического исследования при аутоиммунной пузырчатке продемонстрировали поликлональность гуморального ответа. Основную патогенетическую роль в развитии и течении этого дерматоза играют IgG4 и/или IgG1-аутоантитела с доминированием IgG4-аутоантител на всем протяжении развития иммунопатологического процесса. Преобладание IgG2/IgG4-антител свидетельствует о хронической антигенной стимуляции преимущественно гликопротеиновой природы.

Антигенами-мишенями для циркулирующих IgG-аутоантител и его субклассов независимо от клинической формы и стадии развития аутоиммунной пузырчатки являются компоненты межклеточной связывающей субстанции всех слоев эпидермиса. При этом межклеточная связывающая субстанция базального и шиповатого слоев эпидермиса является преимущественно мишенью для IgG1-, IgG3- и IgG4-аутоантител; межклеточная связывающая субстанция зернистого слоя – для IgG2-аутоантител.

Рецензенты:

Войлокова Р.Я., д.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории иммуногистохимии, ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Министерства здравоохранения РФ, г. Москва;

Снарская Е.С., д.м.н., профессор кафедры кожных и венерических болезней факультета последипломного образования врачей, ГБОУ ВПО «Первый московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава России, г. Москва.

Работа поступила в редакцию 29.10.2013.


Библиографическая ссылка

Махнева Н.В., Махнева Н.В., Давиденко Е.Б., Давиденко Е.Б., Зайденов В.А., Белецкая Л.В. УЧАСТИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНА G И ЕГО СУБКЛАССОВ В РАЗВИТИИ И ТЕЧЕНИИ АУТОИММУННОЙ ПУЗЫРЧАТКИ // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 11-1. – С. 79-84;
URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=33013 (дата обращения: 24.06.2024).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1,674