Многочисленные исследования посвящены изучению свойств и функций внеклеточной ДНК (вкДНК), циркулирующей в крови. Было показано, что вкДНК в крови является регулятором целого ряда физиологических процессов, а также может выступать в качестве маркера различного рода заболеваний [10; 13]. Однако о вкДНК, присутствующей в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ), информации очень мало. Между тем имеющиеся на настоящий момент данные представляют значительный практический интерес, поскольку последние годы появляется все больше информации об участии вкДНК в развитии патологических процессов и о связи биологической активности вкДНК с ее молекулярными свойствами и концентрацией [9; 12]. Так, Родес и соавт. было показано, что при наличии опухолей в нервной системе в ликворе детектируется вкДНК с опухолеспецифичными геномными изменениями, источником которой являются раковые клетки [15]. Также было показано, что в ЦСЖ пациентов с болезнью Паркинсона обнаруживается вкДНК, и ее состав и концентрация существенно отличаются от таковых вкДНК, циркулирующей в крови [1]. Известен также факт обнаружения вкДНК плода в ЦСЖ женщин в предродовой период [7], что свидетельствует о возможности существования механизмов проникновения вкДНК через гистогематические барьеры.
Ранее Коноровой И.Л. было показано, что при стрессорной нагрузке концентрация вкДНК в крови возрастает [2]. Однако вопрос о том, происходит ли в стрессовых условиях изменение концентрации вкДНК в ЦСЖ, остается по-прежнему актуальным и открытым. Целью данной работы являлось исследование уровня вкДНК в ЦСЖ крыс с различной эмоциональной резистентностью в норме и условиях иммобилизационной стрессорной нагрузки.
Материалы и методы исследования
В работе были использованы 22 самца крыс линии Вистар массой 200–220 г. Исследования проводили в соответствии с международными правилами «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals». Индивидуальную эмоциональную реактивность крыс определяли в тесте «открытое поле» с использованием компьютерной программы регистрации параметров двигательной активности «Open Field Sequentional Test V.2» и расчетом индекса двигательной активности (ИА) как отношения суммы пересеченных периферических и центральных секторов к сумме латентных периодов первого движения и выхода в центр. К прогностически устойчивым к стрессу (активным) особям были отнесены 9 животных со значением ИА менее 0,8, к предрасположенным (пассивным) – 10 крыс с ИА более 1,5 [3]. Была также определена группа из 3 амбивалентных крыс со средними значениями коэффициента – от 0,8 до 1,5.
Забор ЦСЖ осуществляли под анестезией хлоралгидратом из большой цистерны головного мозга двукратно с интервалом в 10 дней по ранее разработанной методике [4]. При этом вторую пункцию проводили после эмоционального стресса (ЭС), индуцированного иммобилизацией крыс на плоской платформе за четыре конечности в течение 2,5 часов. Полученные образцы ликвора быстро замораживали и хранили при –20 °С.
ЦСЖ доводили физиологическим раствором до объема 400 мкл, а затем проводили выделение вкДНК фенольным методом, как было описано ранее [1]. Концентрацию вкДНК определяли на флуориметре EnspireTM 2300 (Perkin Elmer) по флуоресценции Picogreen (Invitrogen, США) при длинах волн возбуждения 480 нм и эмиссии 520 нм.
Статистический анализ полученных данных осуществляли с помощью программного пакета Statistica 6.0. Для проверки гипотезы о различии независимых выборок использовали U-тест Манна‒Уитни. Результаты представляли в виде медианы значений и межквартильного интервала Ме [25 %; 75 %]. Для исследования связи признаков использовали непараметрический анализ по Спирмену.
Результаты исследования и их обсуждение
Медианы концентраций вкДНК в ликворе предрасположенных, устойчивых к стрессу и амбивалентных животных в норме составили 27, 68 и 20 нг/мл соответственно (табл. 1). Несмотря на то, что нами не было обнаружено статистически значимых различий между группами, в группе устойчивых к стрессу животных наблюдалась тенденция к большему уровню вкДНК по сравнению с остальными двумя. Объем ликвора, который в норме удавалось отобрать, был примерно одинаков для всех групп животных.
Таблица 1
Уровень вкДНК и объем ликвора в большой цистерне мозга у крыс с различной эмоциональной резистентностью в норме и ЭС
Группы животных |
||||||
Предрасположенные к стрессу n = 10 |
Устойчивые к стрессу n = 9 |
Амбивалентные n = 3 |
||||
контроль |
стресс |
контроль |
стресс |
контроль |
стресс |
|
Концентрация вкДНК, нг/мл |
27 [23;56] |
32 [24;73] |
68 [25;80] |
46 [28;60] |
20 [20;22] |
23 [23;26] |
Объем ЦСЖ, мкл |
86 [81;90] |
86 [81;87] |
88 [76;89] |
84 [78;139] |
93 [93;107] |
91 [74;100] |
Общее количество ДНК в пробе, нг |
2,1 [2.0;6.3] |
2,7 [2.0;6.4] |
6,1 [2.2;6.5] |
6,2 [2.1;6.8] |
2,1 [1.9;2.1] |
2,1 [1.9;2.3] |
Статистический анализ концентраций вкДНК в ликворе по группам после эмоционального стресса показал отсутствие различий между группами устойчивых и предрасположенных к стрессу животных. Однако медианы концентраций вкДНК в ликворе предрасположенных, устойчивых к стрессу и амбивалентных животных после иммобилизационного стресса составили 32, 46 и 23 нг/мл соответственно. Как следует из оценки соответствующих верхних границ межквартильных интервалов, после ЭС концентрация вкДНК в ЦСЖ устойчивых к стрессу животных демонстрировала тенденцию к снижению, а у предрасположенных – наоборот, к повышению.
После стрессорной нагрузки изменения содержания вкДНК были выявлены у 5 из 9 устойчивых к эмоциональному стрессу животных (табл. 2). При этом у 4 крыс уменьшение концентрации вкДНК сопровождалось увеличением объема аликвот отбираемого ликвора. У 5-й активной особи концентрация вкДНК увеличивалась, а объем ЦСЖ снижался. Среди пассивных животных изменения концентрации вкДНК в ЦСЖ после стрессорной нагрузки были выявлены у 6 животных из 10: у четырех из них увеличение концентрации вкДНК сопровождалось снижением объема ликвора, у двух наблюдалось уменьшение концентрации вкДНК, причем в одном случае объем ликвора после стресса возрастал, а в другом – не изменялся. У амбивалентных животных концентрация и объем отбираемого ликвора до и после ЭС оставалась на том же уровне.
Таблица 2
Индивидуальные данные по концентрациям вкДНК и объемам аликвот ликвора у крыс с различной эмоциональной резистентностью при ЭС
Группа животных |
Номер крысы |
Контроль |
ЭС |
И.А. |
Отношение параметров при ЭС и в контроле |
Общ. кол-во ДНК в пробе, нг |
Эффект |
||
контр |
ЭС |
||||||||
Устойчивые к стрессу |
1 |
мкл |
103 |
157 |
1,52 |
7,0 |
7,2 |
ув.V/ум.С |
|
нг/мл |
68 |
46 |
0,68 |
||||||
2 |
мкл |
88 |
171 |
1,94 |
7,0 |
7,5 |
ув.V/ум.С |
||
нг/мл |
80 |
44 |
0,55 |
||||||
3 |
мкл |
101 |
94 |
0,93 |
6,1 |
6,2 |
|||
нг/мл |
60 |
66 |
1,1 |
||||||
4 |
мкл |
78 |
72 |
0,92 |
6,2 |
6,2 |
|||
нг/мл |
80 |
86 |
1,08 |
||||||
5 |
мкл |
49 |
139 |
2,84 |
6,5 |
6,8 |
ув.V/ум.С |
||
нг/мл |
133 |
49 |
0,37 |
||||||
6 |
мкл |
45,2 |
84,1 |
3,07 |
1,86 |
5,1 |
2,4 |
ув.V/ум.С |
|
нг/мл |
113 |
28 |
0,25 |
||||||
7 |
мкл |
88,7 |
78,2 |
2,9 |
0,88 |
2,1 |
1,8 |
||
нг/мл |
24 |
23 |
0,96 |
||||||
8 |
мкл |
88,9 |
81,2 |
4,2 |
0,91 |
2,2 |
1,9 |
||
нг/мл |
25 |
24 |
0,96 |
||||||
9 |
мкл |
76,3 |
35,7 |
2,08 |
0,47 |
1,9 |
2,1 |
ум.V/ув.С |
|
нг/мл |
25 |
60 |
2,4 |
||||||
Предрасположенные к стрессу |
10 |
мкл |
91 |
89,4 |
0,98 |
6,6 |
6,5 |
||
нг/мл |
72 |
73 |
1,01 |
||||||
11 |
мкл |
113 |
90 |
0,8 |
6,3 |
6,4 |
ум.V/ув.С |
||
нг/мл |
56 |
71 |
1,27 |
||||||
12 |
мкл |
81 |
58,9 |
0,73 |
7,6 |
6,1 |
ум.V/ув.С |
||
нг/мл |
94 |
103 |
1,1 |
||||||
13 |
мкл |
51,9 |
73,2 |
0,33 |
1,41 |
2,6 |
1,9 |
ув.V/ум.С |
|
нг/мл |
50 |
26 |
0,52 |
||||||
14 |
мкл |
90,2 |
86 |
0,22 |
0,95 |
2,1 |
2,7 |
ум.V/ув.С |
|
нг/мл |
23 |
31 |
1,35 |
||||||
15 |
мкл |
103 |
83,7 |
0,53 |
1,03 |
2,0 |
2,7 |
||
нг/мл |
68 |
32 |
1,28 |
||||||
16 |
мкл |
88 |
86,3 |
0,45 |
0,97 |
2,1 |
2,1 |
||
нг/мл |
80 |
24 |
1,04 |
||||||
17 |
мкл |
101 |
87,4 |
0,46 |
1,03 |
2,0 |
2,0 |
||
нг/мл |
60 |
23 |
0,96 |
||||||
18 |
мкл |
78 |
80,9 |
0,35 |
1,11 |
2,0 |
1,8 |
ув.V/ум.С |
|
нг/мл |
80 |
22 |
0,79 |
||||||
19 |
мкл |
49 |
86,2 |
0,33 |
0,98 |
2,0 |
7,9 |
не изм.V/ув.С |
|
нг/мл |
133 |
92 |
4 |
||||||
20 |
мкл |
45,2 |
100 |
1,07 |
2,1 |
2,3 |
|||
нг/мл |
113 |
23 |
1,05 |
||||||
21 |
мкл |
88,7 |
90,9 |
0,98 |
1,9 |
2,1 |
|||
нг/мл |
24 |
23 |
1,15 |
||||||
22 |
мкл |
88,9 |
74,2 |
0,7 |
2,1 |
1,9 |
|||
нг/мл |
25 |
26 |
1,3 |
Как в группе устойчивых, так и в группе предрасположенных к ЭС животных нами была выявлена обратная корреляционная зависимость между изменением объема аликвот ликвора, которые удавалось отобрать до и после ЭС, и изменением концентрации вкДНК в данных аликвотах. Коэффициент корреляции Спирмена (R) составил –0,73 и –0,78 при р < 0,05 для предрасположенных (n = 10) и устойчивых (n = 9) животных соответственно.
Интересно отметить, что все изучаемые животные как в норме, так и после ЭС статистически достоверно (р < 0,005, U-тест) разделялись на 2 группы – с повышенным 6,5 [6,2; 7] (n = 9) и низким 2,1 [2; 2,1] (n = 13) общим количеством вкДНК (в нг) в пробе (табл. 1 и 2). При этом в норме среди устойчивых к ЭС крыс всего 33 % животных имели низкое количество вкДНК в ЦСЖ, в то время как доля таких животных среди предрасположенных к стрессу составила 70 % (табл. 2). Низкое количество вкДНК в ЦСЖ было обнаружено и у всех изучаемых амбивалентных животных. После ЭС эта закономерность сохранялась. В группе устойчивых к стрессу крыс общее количество вкДНК в пробе оставалось постоянным до и после ЭС у 8-ми из 9 животных. У одной крысы наблюдалось снижение общего количества вкДНК в ЦСЖ после стресса. Среди предрасположенных к стрессу животных постоянство общего количества вкДНК было отмечено у 8 из 10 животных, а у двух крыс наблюдали прирост и снижение количества вкДНК соответственно (табл. 2).
В данной работе впервые была проведена оценка концентрации вкДНК в ЦСЖ из большой цистерны головного мозга животных с различной эмоциональной резистентностью. При стрессорных нагрузках у каждого животного могут проявляться различные реакции со стороны гормональных, биохимических и вегетативных показателей организма [6], тест открытого поля оценивает лишь вероятную резистентность особи к эмоциональным нагрузкам. Поскольку у отдельных животных могут проявляться индивидуальные варианты динамики физиологических показателей, нам представлялось важным помимо анализа животных по группам резистентности к ЭС на основе ИА также проводить оценку индивидуальных изменений исследуемых параметров у каждого животного.
Выявленная нами тенденция к большему уровню вкДНК у группы устойчивых к стрессу животных согласуется с результатами, полученными ранее при исследовании вкДНК в плазме крови крыс с разной индивидуальной эмоциональной устойчивостью [11]. Концентрация вкДНК в плазме крови устойчивых к стрессу животных также превышала таковую у предрасположенных, но в крови это различие было выражено более явно.
Поскольку в работе [11] определение концентрации вкДНК в плазме крови крыс проводилось тем же методом, что и в данном исследовании, интересным представлялось провести сравнительную оценку концентраций вкДНК в крови и ЦСЖ в норме у крыс с различной эмоциональной резистентностью. Значения концентраций вкДНК в плазме крови предрасположенных и устойчивых к стрессу животных составили соответственно 60 [52;69] (n = 17) и 155 [134;174] (n = 11) нг/мл. Таким образом, очевидно, что концентрация вкДНК в ЦСЖ крыс была ниже, чем в плазме крови в 2,1 и 3,0 раза для предрасположенных и устойчивых к стрессу животных соответственно. Рассчитанные соотношения имеют один порядок с ранее полученными результатами на людях – концентрация вкДНК в ЦСЖ пациентов с болезнью Паркинсона оказалась в 3,3 ниже, чем в плазме крови [1].
Источниками вкДНК, циркулирующей в биологических жидкостях, являются некротические и апоптотические клетки, а также процессы активной секреции из жизнеспособных клеток [16]. Известно, что ЭС индуцирует неспецифический окислительный стресс (ОС) в организме, сопровождающийся массовой гибелью клеток, что в свою очередь приводит к изменению концентрации и свойств вкДНК, циркулирующей в крови [2]. В мозге стрессовые воздействия индуцируют эксайтотоксичность и нейровоспаления, также приводящие к клеточной гибели [17], а, следовательно, к выбросу вкДНК в экстраклеточное пространство. Кроме того, ранее в работе Строуна и Анкера была показана возможность проникновения вкДНК в мозг через гемато-энцефалический барьер [8]. Поэтому в данной работе нам представлялось интересным проверить, происходят ли изменения концентрации вкДНК, циркулирующей в ЦСЖ при ЭС.
Мы не выявили статистически достоверных изменений концентрации вкДНК в ЦСЖ после ЭС, индуцированного 2,5 ч иммобилизацией за 4 конечности, в группах предрасположенных, устойчивых и амбивалентных к стрессу животных. Также не удалось установить связь между резистентностью животных к ЭС и изменением концентрации вкДНК в ЦСЖ после стресса. Полученный нами результат может быть объяснен несколькими причинами. Возможно, значительное изменение уровня вкДНК в ЦСЖ происходит лишь в случае развития хронических патологий мозга – болезней Паркинсона, Альцгеймера, злокачественных новообразований [1; 14; 15]. Острые расстройства, такие как ЭС, могут не вызывать существенных изменений, поскольку вкДНК, выбрасываемая в экстраклеточное пространство при гибели клеток мозга, может поглощаться соседними клетками и расщепляться внеклеточными эндонуклеазами, не успевая попасть в желудочки. Другими возможными причинами отсутствия достоверных различий могут служить малый объем выборок животных, сравнительно небольшая длительность стрессорного воздействия, а также наложение процессов расщепления, появления свежей вкДНК в ЦСЖ и изменения скорости локального мозгового кровотока после стресса.
Как следует из полученных нами данных, содержание вкДНК в ЦСЖ отдельных крыс в пределах групп предрасположенных и устойчивых к стрессу животных изменялось не одинаково. Данный факт может быть связан с тем, что тестирование поведения в открытом поле позволяет прогностически оценить степень устойчивости к стрессорным нагрузкам, которая наиболее ярко проявляется в популяционной совокупности животных. При этом индивидуальная устойчивость отдельной особи в группе устойчивых или предрасположенных может варьироваться в широких пределах. У крыс со средним уровнем поведенческой активности изменений в содержании вкДНК и объема полученной ЦСЖ не выявлялись. Такой результат, возможно, был связан с небольшим количеством животных в группе.
По общему количеству ДНК в образцах все животные статистически достоверно разделялись на 2 группы – с низким и высоким общим количеством вкДНК в ЦСЖ. Причем в группе устойчивых к стрессу животных преобладали особи с высоким общим количеством вкДНК в ликворе, а среди предрасположенных и амбивалентных к стрессу – наоборот, с низким. Полученный нами результат свидетельствует о том, что вкДНК, циркулирующая в биологических жидкостях, в перспективе может быть использована в качестве уникального показателя предрасположенности животного к стрессорным воздействиям.
Выявленная нами обратная корреляционная зависимость между изменениями объема аликвот ликвора и концентрации в них вкДНК при ЭС как у предрасположенных, так и у устойчивых к стрессу животных при сохранении общего количества вкДНК в пробе постоянным может свидетельствовать о существовании механизма жесткой регуляции уровня вкДНК в желудочках мозга. Такой механизм может являться одной из форм адаптации организма и, в частности, мозга к стрессовым воздействиям. В настоящее время неясно, несет ли выявленный нами феномен постоянства общего количества вкДНК в аликвотах ликвора какую-либо физиологическую функцию. Для ответа на этот вопрос необходимы дальнейшие исследования.
Заключение
Полученные нами данные свидетельствуют о том, что предрасположенные, амбивалентные и устойчивые к стрессу животные в норме различаются по концентрации и общему количеству вкДНК в ЦСЖ желудочков мозга. Среди устойчивых крыс преобладают особи с высоким уровнем вкДНК в ликворе, среди предрасположенных и амбивалентных – с низким. При ЭС у устойчивых и предрасположенных к стрессу крыс происходят изменения объема отбираемых аликвот ликвора и уровня вкДНК в них, а также активируются механизмы, препятствующие изменению общего количества ДНК в ликворе. Выявленные нами закономерности могут являться частью механизма адаптации мозга к стрессирующим воздействиям и требуют дальнейшего более тщательного исследования. Данные, полученные в настоящей работе, свидетельствуют о перспективности исследования вкДНК в ЦСЖ животных с различной эмоциональной резистентностью и позволяют надеяться, что вкДНК, циркулирующая в биологических жидкостях, в перспективе может быть использована в качестве уникального показателя предрасположенности животных к стрессорным воздействиям.
Рецензенты:
Стрельников В.В., д.б.н., доцент, главный научный сотрудник, ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН, г. Москва;
Лосева Е.В., д.б.н., главный научный сотрудник, ФГБУН «Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН», г. Москва.
Работа поступила в редакцию 20.09.2013.
Библиографическая ссылка
Григорчук О.С., Глебова К.В., Вейко Н.Н., Умрюхин П.Е. ВНЕКЛЕТОЧНАЯ ДНК В ЛИКВОРЕ КРЫС ПРИ СТРЕССОРНОЙ НАГРУЗКЕ // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 9-4. – С. 621-626;URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=32482 (дата обращения: 27.09.2024).