Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Фролов А.К. 1 Литвиненко Р.А. 1

---

1 ГВУЗ «Запорожский национальный университет» Министерства образования и науки Украины

Изучали динамику количественных и функциональных показателей лейкоцитов периферической крови больных под влиянием гирудотерапии. Исследовали венозную кровь 22 доноров и 25 больных с хронической патологией до и в разные строки после курса гирудотерапии. Анализировали показатели врожденного и адаптивного звена иммунитета. У больных в процессе гирудотерапии выявлены изменения функциональной активности лимфоцитов, которые проявлялись перераспределением соотношения цитоморфометрических классов лимфоцитов: на 1 неделе после гирудотерапии наблюдалось снижение доли малых и больших лимфоцитов, с противоположной динамикой на 3–4 неделе после гирудотерапии. Иммуномодулирующее действие гирудотерапии проявлялось в виде сдвига СD2-регуляторного индекса, активированного в сторону супрессорных механизмов, обеспечивающих противовоспалительное действие биологически активных веществ медицинской пиявки. Гирудотерапия способствовала повышению количества активированных иммунокомпетентных клеток врождённого (фагоциты, натуральные киллеры) и адаптивного (Т-лимфоциты) иммунитета и синтезированных ими цитокинов; индуцировала перераспределение иммунокомпетентных клеток в организме больного путём индукции микроциркуляторных процессов.

Статья в формате PDF

297 KB

гирудотерапия

лейкоциты

лимфоциты

цитоморфометрия

фагоцитоз

реакция бластной трансформации лимфоцитов

цитокины

1. Баскова И.П. Гирудотерапия / И.П. Баскова, Г.С. Исаханян. – М.: НВП «Гируд И.Н.», 2004. – 506 с.

2. Дранник Г.Н. Клиническая иммунология и аллергология: пособие / Г.Н. Дранник, А.Г. Дранник. – 5-е изд., доп. – Киев: Полиграф-плюс, 2011. – 561 с.

3. Каменев О.Ю. Лечение пиявками: теория и практика гирудотерапии: руководство для врачей / О.Ю. Каменев, А.Ю. Барановский. – СПб.: ИГ «Весь», 2006. – 304 с.

4. Назаренко Г.И. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований / Г.И. Назаренко, А.А. Кишкун. – М.: Медицина, 2000. – 544 с.

5. Количественная и функциональная характеристика состояния иммунной системы методами спонтанного и антителозависимого к СD-структурам розеткообразования с эритроцитами барана / Фролова Л.А., Копейка В.В., Федотов Е.Р., Фролов А.К. // Лаб. диагностика. – 2009. – № 3(49). – С. 6–12.

6. Динамика показателей фагоцитарной активности моноцитов периферической крови у больных с синдромом психоэмоционального выгорания при гирудотерапии / Фролов В.М., Гарник Т.П., Пересадин Н.А., Высоцкий А.А. // Український медичний альманах. – 2008. – Т.11, № 4. – С. 175–179.

7. Фролов О.К., Литвиненко Р.О., Копійка В.В., Федотов Є.Р. Спосіб отримання антигенів із медичної п’явки // Патент України № 80665. 2013. Бюл. № 11.

8. Патогенетичний аналіз імунної системи: основні принципи / О.К. Фролов, Є.Р. Федотов, В.В. Копійка, Л.О. Фролова // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. – 2004. – № 3 (27). – С. 14–21.

9. Фуштей І.М., Фролова Л.О., Фролов О.К. Спосіб визначення стану імунної системи людини // Патент України № 68274. 2012. Бюл. № 6.

10. Hildebrandt J.P. Small bite, large impact–saliva and salivary molecules in the medicinal leech, Hirudo medicinalis / J.P. Hildebrandt, S. Lemke // Naturwissenschaften. – 2011. – Vol. 98, № 12. – Р. 995–1008.

На современном научном этапе гирудотерапии (ГТ) принадлежит одно из ведущих мест среди методов традиционной медицины [1, 3]. Данный успех обусловлен широким спектром терапевтического действия комплекса биологически активных веществ (БАВ) медицинской пиявки (МП) на физиологические и морфогенетические состояния систем организма: гемостаз, сосудистый тонус, нервную и эндокринную системы, регенерационные процессы и др. [1, 3, 10]. Очевидно, что большинство из указанных профилактических и терапевтических эффектов прямо или косвенно опосредуются через участие иммунной системы, одной из основных функций которой является регуляция антигенструктурного гомеостаза организма соответственно его генотипу в процессе роста, развития и регенерации [2, 8]. Однако основные механизмы иммунотропного влияния ГТ мало изучены. Установлены лишь некоторые иммунологические сдвиги под влиянием ГТ: повышение фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН) и макрофагов крови [3, 6], проявление антикомплементарных свойств, особенно в отношении классического пути [1]. Поэтому целью работы было изучение динамики количественных и функциональных показателей лейкоцитов крови больных под влиянием ГТ.

Материал и методы исследования

Исследовали венозную кровь 22 условно здоровых доноров, интактных к БАВ МП (контроль, женщины, средний возраст – 29,3 ± 1,99 лет), и 25 больных (опыт, 13 женщин и 12 мужчин, средний возраст – 52,0 ± 2,55 лет) с различной хронической патологией (гипертоническая болезнь, варикозное расширение вен, тромбофлебит, сахарный диабет, остеохондроз и др.) в период ремиссии. Больным амбулаторно проводили стандартный курс ГТ, включающий постановку 25–35 МП аптечного вида (Hirudo verbana, Carena, 1820) на протяжении 3,5–4,5 недель. Обследование проводили до ГТ, на 1 неделе, а также спустя 3–4 недели после окончания курса ГТ. Забор крови осуществлялся из локтевой вены натощак, кровь стабилизировали кристаллическим гепарином (0,2 мг/мл, Спофа).

При оценке лейкоцитарного профиля крови подсчитывали общее количество лейкоцитов и лейкоформулу крови, с параллельной оценкой функциональной активности лимфоцитов в цитоморфометрическом тесте (с помощью окуляр- и обьект-микрометра, PZO, Польша). Выделяли малые, средние и большие классы лимфоцитов [8], из которых малые и большие считали активированными на момент обследования. Так, к малым лимфоцитам со средним диаметром 7,0 мкм и менее (КЛ ≤ 7,0 мкм) относятся: меньшая часть, характеризующая непродуктивный иммуногенез, – преапоптотические лимфоциты, первым признаком которого является карио- и цитопикноз, и большая часть – высоко мигрирующие постпролиферативные лимфоциты. К большим лимфоцитам (КЛ ≥ 11,5 мкм) принадлежат иммунобласты, активированные Т-лимфоциты и натуральные киллеры. К средним лимфоцитам (КЛ 7,5–11,0 мкм) относятся пролонгировано мигрирующие лимфоциты (клетки памяти), меньшая их часть может составлять активированные, как переходная цитоморфометрическая форма больших лимфоцитов.

Содержание СD2+, СD4+, СD8+, СD16+-лимфоцитов определяли с помощью эритроцитарного диагностикума (Витебск, Беларусь), при этом активированными считали высокоавидные лимфоциты, присоединившие 8 и более эритроцитов барана (ЭБ), конъюгированных соответствующими моноклональными антителами (КЛ ≥ 8ЭБ) [5]. Дополнительно вычисляли СD2-регуляторный индекс активированный (СD2-РИ А) по соотношению количества активированных CD4 к сумме активированных CD8 и CD16 [9]. Основанием для вычисления СD2-РИ вместо общепринятого Т-регуляторного индекса (CD4/CD8) является тот факт, что CD8 и CD16 субпопуляции обеспечивают сходную по молекулярно-клеточным механизмам негативную регуляцию иммуногенеза.

ФАН исследовали in vitro с использованием пекарских дрожжей с последующим цитологическим исследованием мазков крови. Изучали следующие показатели ФАН: фагоцитарный показатель (ФП); фагоцитарное число (ФЧ); количество активных фагоцитов (КАФ) – абсолютное число фагоцитирующих нейтрофилов в 1 л крови, которое вычисляли исходя из абсолютного содержания нейтрофилов (Нф) в мазке крови и процента фагоцитоза (ФП): КАФ = (ФП/100)×Нф (109/л); фагоцитарную емкость крови (ФЕК) – количество микробов, которое могут поглотить фагоциты 1 л крови: ФЕК = ФЧ×Нф (109/л) [4].

Определяли потенциальную пролиферативную активность лимфоцитов в микрометоде реакции бласттрансформации (РБТЛ) в вариантах: спонтанная, фитогемагглютинин (ФГА) стимулированная (доза 20 мкг/мл) [4] и антигенстимулированная тканевыми антигенами H. verbana [7] (доза 125 мкг/мл) культуры лимфоцитов с оценкой уровня РБТЛ через сутки, морфологическим методом.

Цитокиновый профиль – С–реактивный белок (СРБ), интерлейкин-1 β (ИЛ-1β), интерлейкин-8 (ИЛ-8) и фактор некроза опухолей-α (ФНО-α) определяли с помощью набора реактивов для количественного определения содержания цитокинов в плазме крови методом твердофазного иммуноферментного анализа производства ООО «УкрмедДон», г. Донецк, согласно стандартизированной методике, представленной производителем на автоматическом анализаторе «Chemwell-2910» (Awarenes Tech., США).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью пакета прикладных программ IBM SPSS Statistics 20,0. Проверку данных на нормальность распределения осуществляли с использованием одновыборочного теста Колмогорова–Смирнова, в случае нормального распределения статистическую значимость разницы между исследуемыми группами оценивали по критерию Стьюдента. Достоверными считали различия результатов при Р > 95 %, р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

У больных уже после 2–3 сеансов ГТ отмечались положительные клинические сдвиги, а к концу курса эта положительная тенденция закрепилась в виде стойких клинических улучшений. Изученные иммунологические показатели больных до и в разные строки после ГТ представлены в таблице.

У больных до и в разные сроки после ГТ общее количество лейкоцитов статистически значимо не отличалось от таковых показателей в контроле. У большинства больных ГТ сопровождалась иммуномодулирующим эффектом на количество лейкоцитов с приведением средних показателей к физиологическим значениям, характерным для данного периода обследования. У больных до ГТ по сравнению с контролем отличались все показатели лейкоформулы, за исключением моноцитов, отмечалось повышенное содержание эозинофилов, палочкоядерных нейтрофилов, лимфоцитов, сниженное содержание сегментоядерных нейтрофилов. Практически все показатели лейкоформулы, за исключением мононуклеаров, у больных зависимо от проведения курса ГТ не отличались. В отдалённые строки после ГТ (3–4 неделя) отмечалась нормализация ранее сниженного абсолютного содержания нейтрофилов, по сравнению с контролем. На 1 неделе после ГТ у больных отмечалась тенденция к снижению как относительного, так и абсолютного содержания лимфоцитов (р > 0,05) по сравнению с исходными показателями до ГТ, которая на 3–4 неделе по сравнению с 1 изменялась в обратную сторону – отмечалась тенденция к повышению относительного (р > 0,05) и абсолютного содержания лимфоцитов (р < 0,05). Снижение количества лимфоцитов у большинства больных на 1 неделе после ГТ, вероятно, связано с их депонированием в местах приставок МП и санации органов.

Динамика показателей иммунитета периферической крови больных в процессе гирудотерапии, (M ± m)

Примечания: Ед. – единицы измерения; КЛ – цитоморфометрические классы лимфоцитов; СП – спонтанная РБТЛ; АП – РБТЛ, стимулированная тканевыми антигенами аптечной пиявки; Акт. – активированные; ЦП – цитокиновый профиль; ГТ 1 – обследование больных на 1 неделе после курса ГТ; ГТ 2 – обследование больных на 3–4 неделе после ГТ; * – различия достоверны по сравнению с контролем при р < 0,05; ∆1 – различия между группой до ГТ и ГТ 1 достоверны при р < 0,05; ∆2 – различия между группой до ГТ и ГТ 2 достоверны при р < 0,05; ∆3 – различия между группой ГТ 1 и ГТ 2 достоверны при р < 0,05.

В процессе ГТ отмечены не только количественные, но и функциональные изменения показателей лимфоцитов периферической крови. Количество активированных малых лимфоцитов (КЛ ≤ 7,0 мкм) у больных до ГТ было незначительно ниже (19,5 ± 1,87 %, р > 0,05), чем в контроле (21,2 ± 1,35 %), а больших – статистически значимо больше (12,5 ± 1,21 %, р < 0,05), чем в контроле (9,1 ± 0,62 %). На 1 неделе после курса ГТ по сравнению с исходными показателями до ГТ отмечалась тенденция к снижению количества малых и больших лимфоцитов (р > 0,05) с обратной тенденцией на 3–4 неделе после ГТ: повышение количества малых и больших лимфоцитов (статистически значимо по сравнению с 1 неделей после ГТ, но незначимо по сравнению с исходными показателями). Невысокие уровни малых лимфоцитов в периферической крови больных с различной хронической патологией до и на 1 неделе после ГТ, вероятно, связаны с их депонированием в очагах воспаления. Незначительное повышение содержания больших лимфоцитов, которые также относятся к активированным, на 3–4 неделе после ГТ, вероятно, связано со стимуляцией БАВ МП морфогенетических гомеостатических реакций, контролируемых иммунной системой. Общее содержание активированных лимфоцитов у исследованного контингента лиц соответствовало конкретным иммунологическим ситуациям: до ГТ наблюдалась тенденция к повышению содержания активированных лимфоцитов по сравнению с контролем на 1 неделе после ГТ – незначительная тенденция к снижению, на 3–4 неделе – статистически значимое повышение содержания активированных лимфоцитов, по сравнению с контролем и 1 неделей после ГТ.

В процессе ГТ также выявлены изменения в популяционном и субпопуляционном составе лимфоцитов. Так, у больных до ГТ отмечено статистически значимое повышение содержания СD2+-лимфоцитов (Т-лимфоцитов), а также их активированной фракции (КЛ ≥ 8 ЭБ) по сравнению с контролем (р < 0,05). На 1 неделе после ГТ у больных отмечено статистически значимое снижение общего количества СD2+-лимфоцитов и их активированной фракции по сравнению с исходными значениями (р < 0,05), при этом показатели СD2+-лимфоцитов не отличались от контроля (р > 0,05). Данное снижение общего количества Т-лимфоцитов и их активированной фракции в периферической крови больных, вероятно, также связано с их депонированием в местах санации органов и приставок МП. Последующая активация иммунитета у больных в отдаленные сроки после ГТ (на 3–4 неделе), которая сопровождалась повышением содержания активированной фракции СD2+-лимфоцитов на фоне снижения общего количества Т-лимфоцитов по сравнению с исходными значениями до ГТ свидетельствует об адекватной активации иммунной системы, направленной на поддержание коррекции антигенструктурных нарушений в организме больных.

Действие ГТ также было направлено на специфическую перестройку регуляторных субпопуляций лимфоцитов. Так, у части больных, в крови которых было повышено исходное количество CD4+ (Т-хелперы) субпопуляции лимфоцитов, данный показатель снижался до физиологических значений. Одновременно с ингибицией CD4+ субпопуляции имело место повышение количества и функциональных показателей среди CD8+ (Т-киллеры/супрессоры) и CD16+ (натуральные киллеры). Оценка данных хелперно-супрессорных взаимоотношений субпопуляций при иммуногенезе представлена в табл. 1 в виде CD2-РИ А. У больных до ГТ он был повышен по сравнению с контролем (р < 0,05), что свидетельствует о напряжении иммунной системы и превышенной активности CD4+ (хелперной активации иммуногенеза). На 1 неделе после ГТ CD2-РИ А снижался за счет супрессии излишней активации иммуногенеза, а через 3–4 недели его значения приближались к норме.

В процессе ГТ также повышалась потенциальная пролиферативная активность лимфоцитов периферической крови. Так, спонтанная и ФГА-стимулированная РБТЛ у здоровых доноров и больных до ГТ была в пределах нормы (у здоровых доноров – 5,5 ± 0,47 и 67,6 ± 2,35 %, у больных – 6,7 ± 0,67 и 64,3 ± 1,71 % соответственно). Показатели РБТЛ в контроле и у больных до ГТ на антигены МП аптечного вида были почти в 2 раза выше спонтанного уровня РБТЛ и равнялись 10,9 ± 0,90 и 12,0 ± 1,04 % соответственно. На 1 неделе и особенно на 3–4 неделе после ГТ у больных стимулирующий эффект ГТ проявился во всех видах культур: увеличилась спонтанная и ФГА-стимулированная РБТЛ как показатель потенциальной пролиферативной активности лимфоцитов. В 2–2,5 раза от исходного уровня статистически значимо (р < 0,05), увеличилась РБТЛ после ГТ и в антиген-стимулированной культуре, что указывает на повышение количества циркулирующих сенсибилизированных к антигенам МП лимфоцитов в периферической крови.

У больных до ГТ отмечены сниженные значения показателей ФАН: главным образом КАФ, который вместе с ФЧ является наиболее существенным при оценке ФАН. Известно, что снижение ФАН ведет к хронизации воспалительного процесса, способствует поддержанию аутоиммунного процесса [4]. В процессе ГТ у больных нами выявлена активация исходно сниженных до ГТ показателей ФАН, которая сопровождалась повышением всех изученных показателей фагоцитоза на 1 неделе и особенно на 3–4 неделе после ГТ. Таким образом, изученные показатели ФАН после курса ГТ были выше исходных показателей до ГТ и контроля (р < 0,05), что связано с активацией врожденного иммунитета под влиянием БАВ МП и соответствует данным других авторов [1, 3, 6].

При анализе цитокинового профиля у больных до и в разные сроки после ГТ обнаружено статистически значимое (р < 0,05) повышение уровней ИЛ-1β, ИЛ-8, ФНО-α и СРБ по сравнению со здоровыми донорами. У больных на 1 неделе после ГТ отмечалась статистически не значимая (р > 0,05) тенденция к повышению исходных уровней цитокинов, в то время как на 3–4 неделе эта тенденция закрепилась в виде статистически значимого повышения уровней ИЛ-1β, ИЛ-8 по сравнению с показателями до и на 1 неделе после ГТ (р < 0,05), что свидетельствует о функциональном напряжении иммунитета, направленного на поддержание коррекции антигенструктурных нарушений в организме больных, и совпадает с выше выявленной активацией клеточного иммунитета.

Таким образом, нами выявлено иммунотропное воздействие БАВ МП, которое заключалось в активации исходно сниженной иммунологической резистенции: активации факторов врожденного и адаптивного иммунитета, адекватной по отношению к определенной ситуации в организме больного.

Выводы

1. ГТ индуцирует перераспределение иммунокомпетентных клеток в организме больного путём индукции микроциркуляторных процессов, которое необходимо отслеживать взятием крови на анализ в динамике.

2. После ГТ повышается количество активированных иммунокомпетентных клеток врождённого (фагоциты, натуральные киллеры) и адаптивного (Т-лимфоциты) иммунитета и синтезированных ими цитокинов.

3. Иммуномодулирующее действие ГТ проявляется в виде сдвига СD2-РИ А в сторону супрессорных механизмов, иммунологически обеспечивающих противовоспалительное действие БАВ МП.

Рецензенты:

Токаренко А.И., д.м.н., профессор, зав. кафедрой терапии, физиотерапии, курортологии и профпатологии, ГУ «Запорожская медицинская академия последипломного образования МЗ Украины», г. Запорожье;

Сырцов В.К., д.м.н., профессор, зав. кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии Запорожского государственного медицинского университета МЗ Украины, г. Запорожье.

Работа поступила в редакцию 23.08.2013.

Библиографическая ссылка