На современном научном этапе гирудотерапии (ГТ) принадлежит одно из ведущих мест среди методов традиционной медицины [1, 3]. Данный успех обусловлен широким спектром терапевтического действия комплекса биологически активных веществ (БАВ) медицинской пиявки (МП) на физиологические и морфогенетические состояния систем организма: гемостаз, сосудистый тонус, нервную и эндокринную системы, регенерационные процессы и др. [1, 3, 10]. Очевидно, что большинство из указанных профилактических и терапевтических эффектов прямо или косвенно опосредуются через участие иммунной системы, одной из основных функций которой является регуляция антигенструктурного гомеостаза организма соответственно его генотипу в процессе роста, развития и регенерации [2, 8]. Однако основные механизмы иммунотропного влияния ГТ мало изучены. Установлены лишь некоторые иммунологические сдвиги под влиянием ГТ: повышение фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН) и макрофагов крови [3, 6], проявление антикомплементарных свойств, особенно в отношении классического пути [1]. Поэтому целью работы было изучение динамики количественных и функциональных показателей лейкоцитов крови больных под влиянием ГТ.
Материал и методы исследования
Исследовали венозную кровь 22 условно здоровых доноров, интактных к БАВ МП (контроль, женщины, средний возраст – 29,3 ± 1,99 лет), и 25 больных (опыт, 13 женщин и 12 мужчин, средний возраст – 52,0 ± 2,55 лет) с различной хронической патологией (гипертоническая болезнь, варикозное расширение вен, тромбофлебит, сахарный диабет, остеохондроз и др.) в период ремиссии. Больным амбулаторно проводили стандартный курс ГТ, включающий постановку 25–35 МП аптечного вида (Hirudo verbana, Carena, 1820) на протяжении 3,5–4,5 недель. Обследование проводили до ГТ, на 1 неделе, а также спустя 3–4 недели после окончания курса ГТ. Забор крови осуществлялся из локтевой вены натощак, кровь стабилизировали кристаллическим гепарином (0,2 мг/мл, Спофа).
При оценке лейкоцитарного профиля крови подсчитывали общее количество лейкоцитов и лейкоформулу крови, с параллельной оценкой функциональной активности лимфоцитов в цитоморфометрическом тесте (с помощью окуляр- и обьект-микрометра, PZO, Польша). Выделяли малые, средние и большие классы лимфоцитов [8], из которых малые и большие считали активированными на момент обследования. Так, к малым лимфоцитам со средним диаметром 7,0 мкм и менее (КЛ ≤ 7,0 мкм) относятся: меньшая часть, характеризующая непродуктивный иммуногенез, – преапоптотические лимфоциты, первым признаком которого является карио- и цитопикноз, и большая часть – высоко мигрирующие постпролиферативные лимфоциты. К большим лимфоцитам (КЛ ≥ 11,5 мкм) принадлежат иммунобласты, активированные Т-лимфоциты и натуральные киллеры. К средним лимфоцитам (КЛ 7,5–11,0 мкм) относятся пролонгировано мигрирующие лимфоциты (клетки памяти), меньшая их часть может составлять активированные, как переходная цитоморфометрическая форма больших лимфоцитов.
Содержание СD2+, СD4+, СD8+, СD16+-лимфоцитов определяли с помощью эритроцитарного диагностикума (Витебск, Беларусь), при этом активированными считали высокоавидные лимфоциты, присоединившие 8 и более эритроцитов барана (ЭБ), конъюгированных соответствующими моноклональными антителами (КЛ ≥ 8ЭБ) [5]. Дополнительно вычисляли СD2-регуляторный индекс активированный (СD2-РИ А) по соотношению количества активированных CD4 к сумме активированных CD8 и CD16 [9]. Основанием для вычисления СD2-РИ вместо общепринятого Т-регуляторного индекса (CD4/CD8) является тот факт, что CD8 и CD16 субпопуляции обеспечивают сходную по молекулярно-клеточным механизмам негативную регуляцию иммуногенеза.
ФАН исследовали in vitro с использованием пекарских дрожжей с последующим цитологическим исследованием мазков крови. Изучали следующие показатели ФАН: фагоцитарный показатель (ФП); фагоцитарное число (ФЧ); количество активных фагоцитов (КАФ) – абсолютное число фагоцитирующих нейтрофилов в 1 л крови, которое вычисляли исходя из абсолютного содержания нейтрофилов (Нф) в мазке крови и процента фагоцитоза (ФП): КАФ = (ФП/100)×Нф (109/л); фагоцитарную емкость крови (ФЕК) – количество микробов, которое могут поглотить фагоциты 1 л крови: ФЕК = ФЧ×Нф (109/л) [4].
Определяли потенциальную пролиферативную активность лимфоцитов в микрометоде реакции бласттрансформации (РБТЛ) в вариантах: спонтанная, фитогемагглютинин (ФГА) стимулированная (доза 20 мкг/мл) [4] и антигенстимулированная тканевыми антигенами H. verbana [7] (доза 125 мкг/мл) культуры лимфоцитов с оценкой уровня РБТЛ через сутки, морфологическим методом.
Цитокиновый профиль – С–реактивный белок (СРБ), интерлейкин-1 β (ИЛ-1β), интерлейкин-8 (ИЛ-8) и фактор некроза опухолей-α (ФНО-α) определяли с помощью набора реактивов для количественного определения содержания цитокинов в плазме крови методом твердофазного иммуноферментного анализа производства ООО «УкрмедДон», г. Донецк, согласно стандартизированной методике, представленной производителем на автоматическом анализаторе «Chemwell-2910» (Awarenes Tech., США).
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью пакета прикладных программ IBM SPSS Statistics 20,0. Проверку данных на нормальность распределения осуществляли с использованием одновыборочного теста Колмогорова–Смирнова, в случае нормального распределения статистическую значимость разницы между исследуемыми группами оценивали по критерию Стьюдента. Достоверными считали различия результатов при Р > 95 %, р < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
У больных уже после 2–3 сеансов ГТ отмечались положительные клинические сдвиги, а к концу курса эта положительная тенденция закрепилась в виде стойких клинических улучшений. Изученные иммунологические показатели больных до и в разные строки после ГТ представлены в таблице.
У больных до и в разные сроки после ГТ общее количество лейкоцитов статистически значимо не отличалось от таковых показателей в контроле. У большинства больных ГТ сопровождалась иммуномодулирующим эффектом на количество лейкоцитов с приведением средних показателей к физиологическим значениям, характерным для данного периода обследования. У больных до ГТ по сравнению с контролем отличались все показатели лейкоформулы, за исключением моноцитов, отмечалось повышенное содержание эозинофилов, палочкоядерных нейтрофилов, лимфоцитов, сниженное содержание сегментоядерных нейтрофилов. Практически все показатели лейкоформулы, за исключением мононуклеаров, у больных зависимо от проведения курса ГТ не отличались. В отдалённые строки после ГТ (3–4 неделя) отмечалась нормализация ранее сниженного абсолютного содержания нейтрофилов, по сравнению с контролем. На 1 неделе после ГТ у больных отмечалась тенденция к снижению как относительного, так и абсолютного содержания лимфоцитов (р > 0,05) по сравнению с исходными показателями до ГТ, которая на 3–4 неделе по сравнению с 1 изменялась в обратную сторону – отмечалась тенденция к повышению относительного (р > 0,05) и абсолютного содержания лимфоцитов (р < 0,05). Снижение количества лимфоцитов у большинства больных на 1 неделе после ГТ, вероятно, связано с их депонированием в местах приставок МП и санации органов.
Динамика показателей иммунитета периферической крови больных в процессе гирудотерапии, (M ± m)
№ п/п |
Иммунные показатели |
Ед. |
Здоровые, n = 22 |
Больные, n = 25 |
||||
До ГТ |
ГТ 1 |
ГТ 2 |
||||||
1 |
Лейкоциты |
Г/л |
6,3 ± 0,305 |
5,6 ± 0,30 |
5,5 ± 0,31 |
6,1 ± 0,26 |
||
2 |
Лейкоформула |
Э |
% |
1,6 ± 0,22 |
2,8 ± 0,32* |
3,0 ± 0,34* |
2,1 ± 0,21∆2 |
|
Нейтрофилы |
П |
% |
3,6 ± 0,34 |
6,6 ± 0,60* |
7,3 ± 0,65* |
6,1 ± 0,51* |
||
С |
% |
64,8 ± 1,04 |
56,6 ± 1,69* |
56,8 ± 1,59* |
57,0 ± 1,40* |
|||
Всего |
% |
68,4 ± 1,06 |
63,2 ± 1,73* |
64,1 ± 1,58* |
63,2 ± 1,34* |
|||
Г/л |
4,33 ± 0,242 |
3,54 ± 0,208* |
3,56 ± 0,225* |
3,87 ± 0,187 |
||||
М |
% |
3,9 ± 0,31 |
3,7 ± 0,32 |
5,2 ± 0,39*,∆1 |
5,9 ± 0,34*,∆2 |
|||
Л |
% |
26,0 ± 1,01 |
30,3 ± 1,77* |
27,7 ± 1,66 |
28,9 ± 1,22 |
|||
Г/л |
1,62 ± 0,09 |
1,67 ± 0,129 |
1,50 ± 0,106 |
1,76 ± 0,101∆3 |
||||
3 |
КЛ |
≤ 7,0 мкм |
% |
21,2 ± 1,35 |
19,5 ± 1,87 |
18,6 ± 1,83 |
23,4 ± 1,30∆3 |
|
Г/л |
0,35 ± 0,031 |
0,34 ± 0,045 |
0,27 ± 0,029 |
0,42 ± 0,035∆3 |
||||
≥ 11,5 мкм |
% |
9,1 ± 0,62 |
12,5 ± 1,21* |
10,9 ± 1,04 |
13,9 ± 0,62*,∆3 |
|||
Г/л |
0,15 ± 0,012 |
0,20 ± 0,018* |
0,17 ± 0,024 |
0,24 ± 0,018*,∆3 |
||||
Акт. лимф. |
% |
30,4 ± 1,33 |
32,0 ± 1,89 |
29,5 ± 1,99 |
37,3 ± 1,11*,∆3 |
|||
Г/л |
0,50 ± 0,036 |
0,54 ± 0,052 |
0,44 ± 0,039 |
0,67 ± 0,046*,∆3 |
||||
4 |
CD2 + -лимф |
Всего |
% |
62,2 ± 1,64 |
68,3 ± 0,98* |
62,0 ± 0,75∆1 |
64,5 ± 0,66∆2,∆3 |
|
Г/л |
1,01 ± 0,057 |
1,14 ± 0,089 |
0,93 ± 0,068∆1 |
1,14 ± 0,069∆3 |
||||
Акт. |
% |
27,7 ± 1,04 |
39,5 ± 1,19* |
30,3 ± 0,98∆1 |
43,8 ± 1,44*,∆2,∆3 |
|||
Г/л |
0,46 ± 0,032 |
0,67 ± 0,064* |
0,46 ± 0,038∆1 |
0,76 ± 0,049*,∆3 |
||||
CD2-РИ А |
0,99 ± 0,012 |
1,24 ± 0,010* |
0,71 ± 0,008*,∆1 |
0,86 ± 0,009*,∆2,∆3 |
||||
5 |
РБТЛ |
СП |
% |
5,5 ± 0,47 |
6,7 ± 0,67 |
18,5 ± 1,04*,∆1 |
12,4 ± 0,57*,∆2,∆3 |
|
ФГА |
% |
67,6 ± 2,35 |
64,3 ± 1,71 |
70,9 ± 1,43*,∆1 |
74,6 ± 1,34*,∆2,∆3 |
|||
АП |
% |
10,9 ± 0,90 |
12,0 ± 1,04 |
24,8 ± 0,72*,∆1 |
29,1 ± 0,77*,∆2,∆3 |
|||
6 |
ФАН |
ФП |
% |
50,5 ± 1,14 |
50,0 ± 1,52 |
60,9 ± 1,39*,∆1 |
64,1 ± 1,33*,∆2,∆3 |
|
ФЧ |
ед./кл. |
2,50 ± 0,104 |
3,12 ± 0,126* |
3,88 ± 0,126*,∆1 |
4,21 ± 0,091*,∆2,∆3 |
|||
ФЕК |
Г/л |
10,76 ± 0,703 |
11,12 ± 0,874 |
13,75 ± 0,998*,∆1 |
16,13 ± 0,759*,∆2,∆3 |
|||
КАФ |
Г/л |
2,18 ± 0,129 |
1,79 ± 0,120* |
2,16 ± 0,144∆1 |
2,48 ± 0,123∆2 |
|||
7 |
ЦП |
ИЛ-1β |
пг/мл |
1,71 ± 0,348 |
7,67 ± 0,932* |
8,46 ± 0,875* |
13,25 ± 1,479*,∆2,∆3 |
|
ИЛ-8 |
пг/мл |
1,99 ± 0,303 |
17,62 ± 3,229* |
18,79 ± 2,869* |
23,75 ± 2,807*,∆2,∆3 |
|||
ФНО-α |
пг/мл |
1,51 ± 0,330 |
7,92 ± 2,022* |
10,36 ± 1,898* |
12,30 ± 1,336* |
|||
СРБ |
мг/л |
0,45 ± 0,061 |
2,48 ± 0,505* |
2,56 ± 0,458* |
2,02 ± 0,250* |
Примечания: Ед. – единицы измерения; КЛ – цитоморфометрические классы лимфоцитов; СП – спонтанная РБТЛ; АП – РБТЛ, стимулированная тканевыми антигенами аптечной пиявки; Акт. – активированные; ЦП – цитокиновый профиль; ГТ 1 – обследование больных на 1 неделе после курса ГТ; ГТ 2 – обследование больных на 3–4 неделе после ГТ; * – различия достоверны по сравнению с контролем при р < 0,05; ∆1 – различия между группой до ГТ и ГТ 1 достоверны при р < 0,05; ∆2 – различия между группой до ГТ и ГТ 2 достоверны при р < 0,05; ∆3 – различия между группой ГТ 1 и ГТ 2 достоверны при р < 0,05.
В процессе ГТ отмечены не только количественные, но и функциональные изменения показателей лимфоцитов периферической крови. Количество активированных малых лимфоцитов (КЛ ≤ 7,0 мкм) у больных до ГТ было незначительно ниже (19,5 ± 1,87 %, р > 0,05), чем в контроле (21,2 ± 1,35 %), а больших – статистически значимо больше (12,5 ± 1,21 %, р < 0,05), чем в контроле (9,1 ± 0,62 %). На 1 неделе после курса ГТ по сравнению с исходными показателями до ГТ отмечалась тенденция к снижению количества малых и больших лимфоцитов (р > 0,05) с обратной тенденцией на 3–4 неделе после ГТ: повышение количества малых и больших лимфоцитов (статистически значимо по сравнению с 1 неделей после ГТ, но незначимо по сравнению с исходными показателями). Невысокие уровни малых лимфоцитов в периферической крови больных с различной хронической патологией до и на 1 неделе после ГТ, вероятно, связаны с их депонированием в очагах воспаления. Незначительное повышение содержания больших лимфоцитов, которые также относятся к активированным, на 3–4 неделе после ГТ, вероятно, связано со стимуляцией БАВ МП морфогенетических гомеостатических реакций, контролируемых иммунной системой. Общее содержание активированных лимфоцитов у исследованного контингента лиц соответствовало конкретным иммунологическим ситуациям: до ГТ наблюдалась тенденция к повышению содержания активированных лимфоцитов по сравнению с контролем на 1 неделе после ГТ – незначительная тенденция к снижению, на 3–4 неделе – статистически значимое повышение содержания активированных лимфоцитов, по сравнению с контролем и 1 неделей после ГТ.
В процессе ГТ также выявлены изменения в популяционном и субпопуляционном составе лимфоцитов. Так, у больных до ГТ отмечено статистически значимое повышение содержания СD2+-лимфоцитов (Т-лимфоцитов), а также их активированной фракции (КЛ ≥ 8 ЭБ) по сравнению с контролем (р < 0,05). На 1 неделе после ГТ у больных отмечено статистически значимое снижение общего количества СD2+-лимфоцитов и их активированной фракции по сравнению с исходными значениями (р < 0,05), при этом показатели СD2+-лимфоцитов не отличались от контроля (р > 0,05). Данное снижение общего количества Т-лимфоцитов и их активированной фракции в периферической крови больных, вероятно, также связано с их депонированием в местах санации органов и приставок МП. Последующая активация иммунитета у больных в отдаленные сроки после ГТ (на 3–4 неделе), которая сопровождалась повышением содержания активированной фракции СD2+-лимфоцитов на фоне снижения общего количества Т-лимфоцитов по сравнению с исходными значениями до ГТ свидетельствует об адекватной активации иммунной системы, направленной на поддержание коррекции антигенструктурных нарушений в организме больных.
Действие ГТ также было направлено на специфическую перестройку регуляторных субпопуляций лимфоцитов. Так, у части больных, в крови которых было повышено исходное количество CD4+ (Т-хелперы) субпопуляции лимфоцитов, данный показатель снижался до физиологических значений. Одновременно с ингибицией CD4+ субпопуляции имело место повышение количества и функциональных показателей среди CD8+ (Т-киллеры/супрессоры) и CD16+ (натуральные киллеры). Оценка данных хелперно-супрессорных взаимоотношений субпопуляций при иммуногенезе представлена в табл. 1 в виде CD2-РИ А. У больных до ГТ он был повышен по сравнению с контролем (р < 0,05), что свидетельствует о напряжении иммунной системы и превышенной активности CD4+ (хелперной активации иммуногенеза). На 1 неделе после ГТ CD2-РИ А снижался за счет супрессии излишней активации иммуногенеза, а через 3–4 недели его значения приближались к норме.
В процессе ГТ также повышалась потенциальная пролиферативная активность лимфоцитов периферической крови. Так, спонтанная и ФГА-стимулированная РБТЛ у здоровых доноров и больных до ГТ была в пределах нормы (у здоровых доноров – 5,5 ± 0,47 и 67,6 ± 2,35 %, у больных – 6,7 ± 0,67 и 64,3 ± 1,71 % соответственно). Показатели РБТЛ в контроле и у больных до ГТ на антигены МП аптечного вида были почти в 2 раза выше спонтанного уровня РБТЛ и равнялись 10,9 ± 0,90 и 12,0 ± 1,04 % соответственно. На 1 неделе и особенно на 3–4 неделе после ГТ у больных стимулирующий эффект ГТ проявился во всех видах культур: увеличилась спонтанная и ФГА-стимулированная РБТЛ как показатель потенциальной пролиферативной активности лимфоцитов. В 2–2,5 раза от исходного уровня статистически значимо (р < 0,05), увеличилась РБТЛ после ГТ и в антиген-стимулированной культуре, что указывает на повышение количества циркулирующих сенсибилизированных к антигенам МП лимфоцитов в периферической крови.
У больных до ГТ отмечены сниженные значения показателей ФАН: главным образом КАФ, который вместе с ФЧ является наиболее существенным при оценке ФАН. Известно, что снижение ФАН ведет к хронизации воспалительного процесса, способствует поддержанию аутоиммунного процесса [4]. В процессе ГТ у больных нами выявлена активация исходно сниженных до ГТ показателей ФАН, которая сопровождалась повышением всех изученных показателей фагоцитоза на 1 неделе и особенно на 3–4 неделе после ГТ. Таким образом, изученные показатели ФАН после курса ГТ были выше исходных показателей до ГТ и контроля (р < 0,05), что связано с активацией врожденного иммунитета под влиянием БАВ МП и соответствует данным других авторов [1, 3, 6].
При анализе цитокинового профиля у больных до и в разные сроки после ГТ обнаружено статистически значимое (р < 0,05) повышение уровней ИЛ-1β, ИЛ-8, ФНО-α и СРБ по сравнению со здоровыми донорами. У больных на 1 неделе после ГТ отмечалась статистически не значимая (р > 0,05) тенденция к повышению исходных уровней цитокинов, в то время как на 3–4 неделе эта тенденция закрепилась в виде статистически значимого повышения уровней ИЛ-1β, ИЛ-8 по сравнению с показателями до и на 1 неделе после ГТ (р < 0,05), что свидетельствует о функциональном напряжении иммунитета, направленного на поддержание коррекции антигенструктурных нарушений в организме больных, и совпадает с выше выявленной активацией клеточного иммунитета.
Таким образом, нами выявлено иммунотропное воздействие БАВ МП, которое заключалось в активации исходно сниженной иммунологической резистенции: активации факторов врожденного и адаптивного иммунитета, адекватной по отношению к определенной ситуации в организме больного.
Выводы
1. ГТ индуцирует перераспределение иммунокомпетентных клеток в организме больного путём индукции микроциркуляторных процессов, которое необходимо отслеживать взятием крови на анализ в динамике.
2. После ГТ повышается количество активированных иммунокомпетентных клеток врождённого (фагоциты, натуральные киллеры) и адаптивного (Т-лимфоциты) иммунитета и синтезированных ими цитокинов.
3. Иммуномодулирующее действие ГТ проявляется в виде сдвига СD2-РИ А в сторону супрессорных механизмов, иммунологически обеспечивающих противовоспалительное действие БАВ МП.
Рецензенты:
Токаренко А.И., д.м.н., профессор, зав. кафедрой терапии, физиотерапии, курортологии и профпатологии, ГУ «Запорожская медицинская академия последипломного образования МЗ Украины», г. Запорожье;
Сырцов В.К., д.м.н., профессор, зав. кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии Запорожского государственного медицинского университета МЗ Украины, г. Запорожье.
Работа поступила в редакцию 23.08.2013.
Библиографическая ссылка
Фролов А.К., Литвиненко Р.А. ИММУННЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ С ХРОНИЧЕСКОЙ ПАТОЛОГИЕЙ В ПРОЦЕССЕ ГИРУДОТЕРАПИИ // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 10-3. – С. 589-593;URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=32325 (дата обращения: 17.08.2024).