Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Исакова Н.Б. 1, 2, 3 Старкова Е.В. 1, 2

---

1 ФГБУ «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии» СО РАМН

2 Новосибирский государственный университет

3 ГБУЗ «Новосибирский областной онкологический диспансер»

Цель исследования – выявление характерных морфофункциональных преобразований в брыжеечных лимфатических узлах при моделировании рака прямой кишки экспериментальным животным (крысы Вистар) и цитостатической терапии параректальным путем (5-фторурацил и лейковарин). Спустя 11 мес. после инстилляции химического канцерогена в стенке прямой кишки выявлена злокачественная эпителиальная опухоль – диморфный рак. В условиях роста злокачественной опухоли прямой кишки в брыжеечных лимфатических узлах выявлены признаки значительных изменений структурно-клеточной организации, активации процессов пролиферации и бласттрансформации в зонах, ответственных за клеточное и гуморальное звенья иммунитета. Подобные преобразования имели место на фоне внутриузлового перераспределения лимфы в корковые промежуточные синусы, что и повлияло на изменения цитоархитеконики в зонах органа, ответственных за процессы детоксикации и противоопухолевую резистентность. В условиях параректального способа введения химиопрепаратов наблюдалось сохранение активности процессов пролиферации и бласттрансформации в герминативных центрах и паракортикальной зоне, на фоне более выраженного лимфонаполнения корковых промежуточных синусов. В мозговых тяжах наблюдалось увеличение числа средних лимфоцитов, однако сокращение числа созревающих форм плазматических клеток. Отмечается относительная равномерность структурно-клеточных преобразований в 1 и 2 брыжеечных лимфатических узлах. Транспортная функция брыжеечных лимфатических узлов не увеличилась.

Статья в формате PDF

617 KB

моделируемый рак прямой кишки

лимфатические узлы

локальная химиотерапия

1. Давыдов М.И., Аксель Е.М. // Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. – 2010. – т. 21, № 2 (80) (прил 1).

2. Канаев С.В. Химиолучевое лечение рака прямой кишки // Практическая онкология. – 2002. – Т 3. – № 2. – С. 123–129.

3. Сакаева Д. Д. Оптимизация химиотерапии злокачественных опухолей (предупреждение и коррекция осложнений): автореф. дис. ... д-ра мед. наук. – Уфа, 2004.

4. Локальная химиотерапия от эксперимента в клинику / В.А. Лиходед, Ф.Ш. Зайнуллин, Р.Ш. Ишмуратова и др. // Креативная онкология и хирургия. – 2009. – № 2. – С. 37–38.

5. Collins JM, Dedrick RL; Pharmacokinetics of anticancer drugs Pharmacologic principles of cancer treatment; edited by Chabner W, Saunder B, Philadelphia: 77–79, 1982.

6. Kerr D.J. Introduction: Pharmacokinetic Basis of regional chemotherapy: Regional chemotherapy – Theory and Practice, Amsterdam. 2000. Р. 1–8.

7. Narisawa T., Sato M., Tani M. et al. Inhibition of development of methylnitrosourea-inducted rat colon tumors by indomethacin treatment // Cancer Res. – 1981. – Vol. 41. – P. 1954–1957.

8. Петренко В.М. Топография брыжеечных лимфатических узлов белой крысы // Успехи современного естествознания. – 2011. – № 9 – С. 44–48.

9. Бородин Ю.И., Труфакин В.А., Трясучев П.М. Регионарные особенности клеточного состава различных зон лимфатических узлов взрослого человека // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. – 1985. – Т. 88. – № 4. – С. 76–78.

10. Функциональная морфология иммунной системы / Ю.И. Бородин, В.Н. Григорьев, А.Ю. Летягин и др. – Новосибирск: Наука, 1987. – 238 с.

11. Бородин Ю.И., Григорьев В.Н. Лимфатический узел при циркуляторных нарушениях. – Новосибирск: Изд-во «Наука», 1986. – 272 с.

12. Кадагидзе З.Г. Иммунодиагностика и иммунотерапия опухолей // Вестник РАМН. – 1999. – № 5. – С. 19–22.

В структуре заболеваемости и смертности среди онкологических заболеваний рак прямой кишки занимает ведущие позиции. В последнее время отмечается прирост абсолютного числа заболевших колоректальным раком [1], что указывает на высокую социальную значимость проблем диагностики и необходимость поиска новых способов лечения пациентов с раком прямой кишки.

Лечение рака прямой кишки, особенно у больных с распространенной стадией заболевания, является комплексным и включает радикальную операцию с удалением органа и прилегающей жировой клетчатки и лучевую терапию в сочетании с полихимиотерапией [2]. Противоопухолевые препараты вводят внутривенно, что сопровождается побочными эффектами, связанными с параллельным влиянием цитостатиков на активно пролиферирующие и быстро обновляющиеся клеточные системы [3]. В ряде случаев для повышения эффективности и уменьшения побочных эффектов цитостатической терапии используют другие способы доставки химиопрепаратов, как, например, регионарное введение [4], что позволяет увеличить их местную концентрацию [5] и снизить вероятность появления нежелательных эффектов, связанных с токсическим влиянием на организм в целом за счет абсорбции медикаментов напрямую тканью опухоли [6].

Структурно-клеточные изменения отдаленных от первичного опухолевого узла брыжеечных лимфатических узлов при моделируемом раке прямой кишки в условиях проведения регионарной цитостатической терапии является проявлением комплексного ответа лимфатической системы на такое воздействие. Изучение брыжеечных лимфатических узлов позволит оценить влияние локальной противоопухолевой терапии на звенья лимфатической системы и их способность к сохранению барьерно-детоксикационной функции, обеспечивающей противоопухолевую резистентность и предотвращающей генерализацию эндотоксикоза.

Цель исследования – выявить характерные особенности структурной организации брыжеечных лимфатических узлов в условиях роста злокачественной опухоли прямой кишки при параректальном пути введения химиопрепаратов.

Материалы и методы исследования

Исследование проведено на 30 экспериментальных животных – крысах-самцах популяции Wistar с массой 300–400 г (НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, Новосибирск). Все эксперименты выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными приказом Минздрава СССР № 577 от 12.08.77 г. Эксперименты выполнены с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директиве Европейского Сообщества (86/609/ЕС).

У крыс-самцов индуцировали экспериментальную опухоль толстой кишки путем интраректальных инстилляций химического канцерогена N-метил-N-нитрозомочевины (МНМ). Вводили по 4 мг МНМ в 0,5 мл изотонического раствора натрия хлорида один раз в неделю в течение 4 недель (всего 4 инстилляции) [2].

Определены экспериментальные группы:

1. Интактные животные (10 животных).

2. Животные с индуцированной опухолью прямой кишки, без лечения (10 животных).

3. Животные с индуцированной опухолью прямой кишки, леченные по схеме Мейо, параректальное введение (10 животных).

Химиотерапию экспериментальным животным проводили по схеме Мейо [2]: 5-фторурацил и лейковарин спустя 11 мес. после инстилляции МНМ в дозе, рассчитанной на кг веса животного. Введение цитостатиков осуществлялось тремя курсами (3 дня каждую неделю) в дозе 0,1 мг лейковарина и 0,1 мг фторурацила параректальным путем.

Забор материала у животных проводился спустя 11 месяцев после инстилляции канцерогена, верификации роста опухоли и окончании курсов химиотерапии под эфирным наркозом. Для гистологического исследования забирали ткань опухоли, краниальные брыжеечные лимфатические узлы. Краниальные брыжеечные лимфатические узлы, расположенные вдоль краниальной брыжеечной артерии и ее ветвей делили на центральные (проксимальные и дистальные) и периферические [8]. Забирали околоободочные брыжеечные лимфатические узлы (центральные дистальные), залегающие в вентральном (№ 1) и дорзальном (№ 2) концах корневого тела в общем корне брыжейки восходящей ободочной и тонкой кишки.

По стандартной гистологической методике выполняли проводку материала, заливали объекты исследования в парафиновые блоки, с которых делали гистологические срезы толщиной 5–7 мкм. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином и азур II-эозином. Гистологические препараты изучали на световых микроскопах NIKON (Япония), МБС-10 при увеличении 32, 400 и 1000 раз, с помощью окулярной тестовой системы производили морфометрию срезов и подсчет клеточных элементов в опухоли и отдельных структурно-функциональных зонах лимфатических узлов. Статистическую обработку данных проводили с помощью t-критерия Стьюдента для зависимых выборок и определяли значимость различий (р – стандартная ошибка среднего). Критический уровень значимости в данном исследовании принимался р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

У всех экспериментальных животных спустя 11 месяцев после инстилляции химического канцерогена N-метил-N-нитрозомочевины в стенке прямой кишки выявлена злокачественная эпителиальная опухоль: сочетание умеренно дифференцированной аденокарциномы и плоскоклеточного ороговевающего рака (диморфный рак) с преобладанием железистого компонента. Макроскопически опухоль была представлена экзофитным бугристым образованием на широком основании, иногда это была опухоль язвенно-инфильтративного характера с распространением на кожу вокруг ануса. Микроскопически опухоль представлена хаотично расположенными тубулярными (железистыми) структурами, выстланными полиморфными клетками с эксцентрично расположенными гиперхромными ядрами, вакуолизацией цитоплазмы (рис. 1). Имеются участки опухоли с плоскоклеточной дифференцировкой, встречаются «луковицы» ороговения, и роговые кисты. Отмечается инфильтрирующий рост за пределы слизистой прямой кишки в подслизистый и мышечный слои, а иногда – в окружающую жировую клетчатку.

Рис. 1. Ткань опухоли в стенке прямой кишки у крыс. Окраска гематоксилином и эозином. Микрофото. Ув. 10×40

В условиях регионарной химиотерапии лечебный патоморфоз наблюдался как в эпителиальном, так и в стромальном компонентах, однако с преимущественным сохранением самой структуры опухоли. Эпителиальные клетки, представляющие субстрат опухоли, увеличены в размерах, отмечается выраженная вакуолизация цитоплазмы, появление «размытости» контуров отдельных клеток. Имело место увеличение размеров ядер, ослабление интенсивности их окраски. Контур желез часто прерывистый, «разорван», в просвете слизистое содержимое с примесью большого количества нейтрофильных лейкоцитов. В строме опухоли – очаговая и диффузная воспалительная инфильтрация в виде лимфоидных клеток различной степени зрелости, плазматических клеток, макрофагов, нейтрофильных лейкоцитов. Встречаются фокусы некрозов и кровоизлияний, местами – обширные. В участках погибшей паренхимы отмечаются очаги созревающей грануляционной ткани. Исследование лечебного патоморфоза опухоли выявило наличие 2-х способов гибели раковых клеток – некроза и апоптоза.

В условиях роста экспериментальной злокачественной опухоли прямой кишки в первом и втором брыжеечных лимфатических узлах отмечались признаки фолликулярной гиперплазии с увеличением доли герминативных центров (на 56,42 %, (р < 0,001) и на 61,74 %, (р < 0,001) соответственно) и зоны мантии (на 64,34 %, (р < 0,001) и на 61,02 %, (р < 0,001) соответственно) (табл. 1). Увеличение размеров герминативных центров сопровождалось ростом числа клеток на стадии митотического деления, лимфобластов и средних лимфоцитов и сокращением числа зрелых лимфоцитов (табл. 2). Описанные изменения свидетельствуют об активации процессов клеточной пролиферации и бласттрансформации в условиях антигенной стимуляции в герминативных центрах. Во втором органе число макрофагов оказалось ниже контрольных значений на 22,96 % (р < 0,01).

В условиях параректального пути введения химиопрепаратов в обоих брыжеечных лимфатических узлах относительная площадь герминативных центров вторичных лимфоидных узелков увеличилась на 21,88 % (р < 0,01) и на 29,24 % (р < 0,001) соответственно), что сопровождалось усилением пролиферативной активности клеток, увеличением числа лимфобластов и средних лимфоцитов. В пользу активизации процессов бласттрансформации в герминативных центрах указывает факт увеличения содержания моноцитарных макрофагов и ретикулярных клеток как антигенпрезентирующих клеток. Рост числа низкодифференцированных форм лимфоидных клеток в герминативных центрах сопровождался сокращением количества зрелых лимфоцитов (на 17,35 % (р < 0,001) и на 17,76 % (р < 0,001) соответственно). Доля мантийной зоны во 2-м лимфатическом узле сократилась.

Развитие злокачественной опухоли прямой кишки привело к увеличению удельных размеров межфолликулярной зоны в обоих брыжеечных лимфатических узлах. Морфометрические показатели паракортикальной зоны первого органа статистически значимо выросли (на 30,66 % р < 0,001), а во втором органе наблюдается тенденция к увеличению. Паракортикальная гиперплазия сопровождалась увеличением числа иммунбластов и средних лимфоцитов (табл. 2). Такие преобразования свидетельствуют об активации процессов бласттрансформации в этой зоне брыжеечных лимфатических узлов. Увеличение макрофагальной активности в первом органе – в доказательство вышесказанного. Число зрелых лимфоцитов оказалось ниже такового в 1 группе животных, что свидетельствует о том, что на данный момент идет активное использование ранее накопленных клеток, и зрелые Т-лимфоциты расходуются в процессах иммунного ответа вне органа [12] (табл. 2).

Таблица 1

Относительные площади структурно-функциональных зон брыжеечных лимфатических узлов в условиях роста экспериментальной злокачественной опухоли прямой кишки (M ± m) %

Примечание:

* – отличия достоверны по сравнению с 1-й группой животных при Р < 0,05;

• – отличия достоверны по сравнению со 2-й группой животных при Р < 0,05.

В условиях параректального способа введения химиопрепаратов относительная площадь межузелковой зоны возросла в обоих органах (на 33,37 % (р < 0,01) в 1-м органе, на 23,86 % (р < 0,05) – во 2-м). Размеры паракортикальной зоны сократились в первом лимфатическом узле (на 28,12 % р < 0,01). Стоит отметить, что относительная площадь этой структурной единицы в группе животных без лечения в первом брыжеечном лимфатическом узле изначально выше, чем во втором. В паракортикальной зоне обоих органов отмечаются признаки усиления пролиферативной активности клеток и активации процессов бласттрансформации: число клеток на стадии митотического деления, число низкодифференцированных форм лимфоидных клеток, а именно иммунобластов и средних лимфоцитов, статистически значимо увеличилось (табл. 2). В доказательство активации иммунологических процессов в паракортикальной зоне брыжеечных лимфатических узлов указывает факт увеличения доли макрофагов и ретикулярных клеток как антигенпрезентирующих (рис. 2). Сокращение относительного числа зрелых лимфоцитов связано с их активным выходом в периферическую циркуляцию с последующим участием в иммунных процессах. Таким образом, параректальное введение химиопрепаратов характеризовалось не только сохранением процессов пролиферации и бласттрансформации в паракортикальной зоне отдаленных от первичной опухоли лимфатических узлов, но и усилении их активности.

Таблица 2

Цитоархитектоника структурно-функциональных зон брыжеечных лимфатических узлов самцов крыс линии Вистар в условиях роста экспериментальной злокачественной опухоли прямой кишки (M ± m) %

Примечание:

* – отличия достоверны по сравнению с 1-й группой животных при Р < 0,05;

• – отличия достоверны по сравнению со 2-й группой животных при Р < 0,05.

Рис. 2. Брыжеечный лимфатический узел. Паракортикальная гиперплазия. Окраска гематоксилином и эозином. Микрофото. Ув. 10×40

Развитие злокачественной опухоли прямой кишки привело в первом брыжеечном лимфатическом узле к сокращению относительной площади мозговых тяжей на 29,64 % (р < 0,001), что, однако, сопровождалось статистически значимым увеличением числа средних лимфоцитов, плазмобластов, незрелых плазмоцитов и макрофагов (табл. 1, 2). Во втором органе в отсутствии изменений размеров изучаемой зоны имело место увеличение числа средних лимфоцитов и незрелых плазмоцитов. В мозговых тяжах обоих брыжеечных лимфатических узлов отмечается рост пролиферативной активности клеток (на 43,37 % (р < 0,001) в 1-м органе и на 44,08 % (р < 0,001) – во 2-м). Увеличение числа низкодифференцированных и промежуточных форм плазматических клеток сопровождалось сокращением числа зрелых плазмоцитов.

Параректальное введение химиопрепаратов привело к увеличению доли мозговых тяжей в первом брыжеечном лимфатическом узле на 27,77 % (р < 0,05), при этом соответствующие параметры во втором органе значимо не изменились. В клеточной популяции изучаемой структурной единицы обоих брыжеечных лимфатических узлов возросла доля средних лимфоцитов (на 26,01 % (р < 0,001) и на 32,09 % (р < 0,001) соответственно). Процентное содержание незрелых плазмоцитов статистически значимо сократилось относительно показателей группы нелеченных животных, а зрелых плазматических клеток – возросло во втором органе и отмечается тенденция к увеличению в первом. Сокращение числа созревающих форм плазматических клеток в мозговых тяжах указывает на подавление активности иммунологических процессов в этой зоне [9].

В условиях роста злокачественной опухоли прямой кишки относительные размеры мозговых синусов в первом брыжеечном лимфатическом узле сократились на 45,43 % (р < 0,001), а краевого и коркового промежуточного синусов – увеличились (на 29,57 % (р < 0,001) и на 46,63 % (р < 0,001) соответственно). Такие изменения свидетельствуют об активном прямом пути транспорта лимфы, однако более выраженном лимфонаполнении корковых промежуточных синусов, что и повлияло на изменения цитоархитеконики в этой и других структурных зонах органа. Во втором брыжеечном лимфатическом узле имелась тенденция к уменьшению размеров мозговых синусов и отсутствие изменений со стороны краевого и коркового промежуточного синусов.

В мозговых синусах отмечаются признаки цитоза: увеличение процентного содержания средних лимфоцитов, всех форм плазматических клеток, макрофагов. Доля ретикулярных и тучных клеток в мозговых синусах первого брыжеечного лимфатического узла статистически значимо сократилась. В обоих органах уменьшилось число зрелых лимфоцитов (табл. 2).

В ответ на проводимую химиотерапию при параректальном пути введения препаратов в первом и втором органах отмечалось увеличение размеров корковых промежуточных синусов (на 38,14 %, (р < 0,01) в 1-м и на 39,79 %, (р < 0,1) во 2-м) по сравнению с показателями во 2-й группе животных. Размеры мозговых и краевых синусов значимо не изменились. Более выраженное лимфонаполнение корковых промежуточных синусов оказало влияние на лимфоидную ткань, соприкасающуюся с ними (паракортикальная зона и герминативные центры), где напряженность иммунологических реакций оказалась более выраженной, на что указывают признаки усиления пролиферативной активности клеток и активации процессов бласттрансформации, увеличения количества макрофагов и ретикулярных клеток, как антигенпрезентирующих клеток.

В мозговых синусах первого и второго органов имело место сокращение числа средних и малых лимфоцитов. Относительное количество незрелых плазмоцитов и зрелых плазматических клеток в мозговых синусах увеличилось.

Структурные изменения брыжеечных лимфатических узлов в условиях развития злокачественной опухоли прямой кишки привели к увеличению доли коркового вещества и сокращению доли мозгового вещества (в первом органе эти изменения являются статистически значимыми). Относительные размеры зоны, населенной преимущественно В-лимфоцитами, не изменились, а размеры зоны, ответственной за рост и дифференцировку Т-лимфоцитов, статистически значимо увеличились (табл. 1).

В условиях параректального введения химиопрепаратов микроанатомические преобразования брыжеечных лимфатических узлов в итоге не привели к значимым изменениям размеров коркового и мозгового вещества. В результате проведенной химиотерапии размеры зоны, населенной преимущественно В-лимфоцитами, увеличились в первом брыжеечном лимфатическом узле на 19,42 % (р < 0,05). Отмечается тенденция к увеличению размеров изучаемой структурной единицы и в первом органе. Относительная площадь Т-зависимой зоны не претерпела достоверно значимых изменений.

В условиях развития рака прямой кишки корково-мозговой индекс для первого брыжеечного лимфатического узла составил 1,83 соответственно по морфотипу с фрагментированного (в группе интактных животных) он меняется на компактный. Второй брыжеечный лимфатический узел остался узлом фрагментированного морфотипа. В группе с параректальным введением цитостатиков корково-мозговой индекс для первого лимфатического узла составил 1,39, а для второго – 1,08.

Заключение

В условиях роста злокачественной опухоли прямой кишки в брыжеечных лимфатических узлах выявлены признаки значительных изменений структурно-клеточной организации, активации процессов пролиферации и бласттрансформации в зонах, ответственных за клеточное и гуморальное звенья иммунитета, признаки плазматизации мозговых тяжей, выраженного синусного цитоза. Подобные преобразования имели место на фоне внутриузлового перераспределения лимфы в корковые промежуточные синусы, что и повлияло на изменения цитоархитеконики в зонах органа, ответственных за процессы детоксикации и противоопухолевую резистентность.

В условиях параректального способа введения химиопрепаратов наблюдалось сохранение активности процессов пролиферации и бласттрансфомации в герминативных центрах и паракортикальной зоне, на фоне более выраженного лимфонаполнения корковых промежуточных синусов. В мозговых тяжах наблюдалось увеличение числа средних лимфоцитов, однако сокращение числа созревающих форм плазматических клеток. Отмечается относительная равномерность структурно-клеточных преобразований в 1 и 2 брыжеечных лимфатических узлах. Транспортная функция брыжеечных лимфатических узлов не увеличилась.

Рецензенты:

Голубева И.А., д.м.н., профессор кафедры анатомии, ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава России, г. Новосибирск;

Бгатова Н.П., д.б.н., профессор, зав. лабораторией ультраструктурных исследований, ФГБУ «НИИ клинической и экспериментальной лимфологии» СО РАМН, г. Новосибирск.

Работа поступила в редакцию 12.07.2013.

Библиографическая ссылка