Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Соловьева А.Г. 1 Уланова А.А. 1 Зимин Ю.В. 1

---

1 ФГБУ «Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии» Минздрава России

Биологическая роль различных ферментов митохондрий может в значительной степени определяться их способностью к связыванию с мембраной, приводя к существенным изменениям структурных и регуляторных особенностей энзимов клетки. Целью данной работы явилось изучение каталитических и кинетических свойств лактатдегидрогеназы (ЛДГ), алкогольдегидрогеназы (АДГ) и комплекса АДГ-ЛДГ митохондрий печени крыс, а также исследование сил электростатического взаимодействия ферментативного комплекса с мембраной митохондрий. В работе были использованы крысы самцы линии Wistar. Активность и кинетические свойства АДГ и ЛДГ определяли в митохондриальной фракции печени крыс. Митохондрии получали методом дифференциального центрифугирования. Для оценки взаимодействия ферментов с мембраной проводилась солюбилизация мембраносвязанных форм ЛДГ, АДГ путем суспендирования митохондрий в 0,15 М NaCl. Показано, что преобладающее количество общей суммарной активности ЛДГ, АДГпр, кластера ЛДГпр-АДГпр интактных животных приходится на лабильно связанную с мембраной форму фермента (солюбилизат). Для АДГобр, надмолекулярного комплекса ЛДГобр-АДГобр крыс выявлено преобладание прочно связанных с мембраной форм ферментов. До солюбилизации и в солюбилизате в составе кластера отмечено снижение удельной активности лактатдегидрогеназы как в прямой, так и в обратной реакциях, увеличение активности АДГпр и АДГобр по сравнению с односубстратными реакциями. Для односубстратных реакций ферментов и энзимов гетерогенной системы (АДГ-ЛДГ) выявлены изменения кинетических характеристик ЛДГ и АДГ, которые приводят к смещению направленности метаболизма митохондрий.

Статья в формате PDF

447 KB

митохондрии

мембраны

печень

надмолекулярный кластер

алкогольдегидрогеназа

лактатдегидрогеназа

1. Гринштейн С.В., Кост О.А. Структурно-функциональные особенности мембранных белков // Успехи биологической химии. – 2001. – Т. 41. – С. 77–104.

2. Зимин Ю.В., Соловьева А.Г., Уланова А.А. Оценка кинетических параметров ферментов в гетерогенной надмолекулярной системе // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 2. – С. 68–71.

3. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. – М.: Высшая школа, 1980. – 272 с.

4. Крупянко В.И. Векторный метод представления ферментативных реакций. – М.: Наука, 1990. – 146 с.

5. Сатановская В.И. Система обмена этанола и ацетальдегида печени крыс при развитии толерантности к этанолу // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1990. – Т. CIX, № 2. – С. 161–162.

6. Финдлей Дж., Эванз У. Биологические мембраны. Методы: пер. с англ. – М.: Мир, 1990. – 424 с.

7. Chaubey A., Gerard M., Singh V.S., Malhotra B.D. Immobilization of lactate dehydrogenase on tetraethylorthosilicate-derived sol-gel films for application to lactate biosensor // Appl. Biochem. Biotechnol. – 2001. – Vol. 96, № 1–3. – P. 293–301.

8. Dawson J.M., Heatlic P.L. Lowry method of protein quantification Evidence for Photosensitivity // Anal. Biochem. – 1984. – Vol. 140, № 2. – P. 391–393.

9. De Bari L., Chieppa G., Marra E., Passarella S. L-lactate metabolism can occur in normal and cancer prostate cells via the novel mitochondrial L-lactate dehydrogenase // Int. J. Oncol. – 2010. – Vol. 37, № 6. – P. 1607–1620.

10. Koivusalo M., Baumann L. V. Evidence for the identity of glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase and class III alcohol dehydrogenase // FEBS Lett. – 1989. – Vol. 257, № 1. – P. 105–109.

11. Nicolau E., Mйndez J., Fonseca J.J., Griebenow K., Cabrera C.R. Bioelectrochemistry of non-covalent immobilized alcohol dehydrogenase on oxidized diamond nanoparticles // Bioelectrochemistry. – 2012. – Vol. 85. – P. 1–6.

12. Sagrista M.L., Bozal J. Lactate dehydrogenase activity in the mitochon-drial fraction of chichen liver: enzyme binding and kinetic behavior of soluble and bound enzyme // Biochim. – 1987. – Vol. 69, № 3. – P. 205–214.

13. Trivedi A., Heinemann M., Spiess A.C., Daussmann T., Bьchs J. Optimization of adsorptive immobilization of alcohol dehydrogenases // J. Biosci. Bioeng. – 2005. – V. 99, № 4. – P. 340-347.

14. Tsai Y.-C., Chen S.-Y., Liaw H.-W. Immobilization of lactate dehydrogenase within multiwalled carbon nanotube-chitosan nanocomposite for application to lactate biosensors // Sensors and Actuators B: Chemical. – 2007. – Vol. 2. – P. 474–481.

Митохондрии являются важнейшими внутриклеточными структурами, определяющими функционирование клеток млекопитающих в норме и при патологии. Уникальная способность митохондрий к поддержанию гомеостаза обеспечивается рядом их свойств, среди которых матричность, эластичность, связанная с характерным только для мембран митохондрий специализированным белковым составом.

Согласно литературным данным, мембранные ферменты функционируют в составе биомембран в виде сложных надмолекулярных ансамблей, что может приводить к проявлению ими особых свойств, не реализующихся в гомогенных водных растворах. Многие ферменты плазматических мембран животных клеток способны переходить из мембраносвязанной формы в «растворимую». Функционирование мембранных ферментов зависит от локального окружения и определяется их взаимодействием с липидными и белковыми компонентами мембран [1]. Контролируемая метаболитами обратимая адсорбция энзимов на мембранах органелл расширяет регуляторные возможности клетки [13]. Биологическая роль различных мембранных ферментов может в значительной степени определяться их способностью к связыванию с мембраной, приводя к существенным изменениям особенностей строения и функционирования энзимов.

Проводились эксперименты по включению одного из ключевых ферментов биотрансформации печени алкогольдегидрогеназы (АДГ) в искусственные мембраны. Показано, что увеличение количества АДГ, связанной на единицу массы носителя, сопровождается снижением её активности, причиной которого являются возникающие диффузионные затруднения, препятствующие доступу субстратов к активным центрам фермента [11]. Имеются доказательства тесной метаболической связи между обменами субстратов и продуктов алкогольдегидрогеназной и лактатдегидрогеназной реакций: этанол-ацетальдегид и лактат-пируват [5].

Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) как фермент гликолиза играет важную роль в регуляции энергетического обмена клетки и способна взаимодействовать с мембранами субклеточных органелл [9]. Существуют сведения о связи лактатдегидрогеназы и алкогольдегидрогеназы в условиях in vitro [7; 14]. Однако в настоящее время отсутствуют какие-либо представления о роли функционального взаимодействия ЛДГ-АДГ в составе надмолекулярного кластера с мембранами митохондрий печени в эксперименте.

Целью данной работы явилось изучение каталитических и кинетических свойств ЛДГ, АДГ и комплекса АДГ-ЛДГ митохондрий печени крыс, а также исследование сил электростатического взаимодействия ферментативного комплекса с мембраной митохондрий.

Материал и методы иследования

Эксперименты проведены на 15 крысах самцах линии Wistar массой 180–200 г, содержащихся в условиях вивария при свободном доступе к пище и воде. Исследование активности и кинетических свойств ЛДГ и АДГ проводили в митохондриальной фракции печени животных, которую получали методом дифференциального центрифугирования на центрифуге Multifuge 1 S-R [6]. Для оценки взаимодействия ферментов с мембраной проводилась солюбилизация мембраносвязанных форм ЛДГ, АДГ путем суспендирования митохондрий в 0,15 М NaCl, pH 6,0 [12].

Активность ЛДГ определяли с использованием в качестве субстрата молочной кислоты (прямая реакция, ЛДГпр) и пировиноградной кислоты (обратная реакция, ЛДГобр) [3]. Исследование активности АДГ осуществляли с использованием в качестве субстрата этилового спирта (прямая реакция, АДГпр) и ацетальдегида (обратная реакция, АДГобр) по М. Koivusalo et al. (1989) [10]. Концентрацию белка определяли по методу Лоури в модификации [8]. Оценку каталитических и кинетических свойств ферментов в надмолекулярной системе (АДГ-ЛДГ) проводили путем одновременного внесения в пробу субстратов для лактатдегидрогеназы и алкогольдегидрогеназы.

Для определения кинетических констант АДГ и ЛДГ реакций использовали полную кривую накопления продуктов реакции (V от t). Используя математический метод, рассчитывали кинетические параметры ферментативной реакции (Kt, Vmax, Kn, Ka, Kd) в гетерогенной системе, где Kt – время полупревращения субстрата (усл.ед.); Vmax – максимальная скорость реакции (усл.ед.); Ka – коэффициент каталитической эффективности (усл.ед.); Kn – коэффициент кооперативности ферментативной реакции (усл.ед.); Kd – коэффициент структурных изменений фермента (усл.ед.) [2]. Характер ингибирования и активации ферментов определяли по В.И. Крупянко (1990) [4].

Результаты исследований обрабатывали с использованием t-критерия Стьюдента с помощью программы Statistica 6.0. При расчете t-критерия Стьюдента применяли поправку Бонферрони, позволяющую устранить ошибку первого рода, возникающую при сравнении более чем двух выборок данным методом.

Результаты исследования и их обсуждение

Использование 0,15 М раствора NaCl с целью изменения сил электростатического взаимодействия ферментативного комплекса с мембраной митохондрий показало, что 65 % суммарной активности ЛДГпр интактных животных приходится на лабильно связанную с мембраной форму фермента (солюбилизат), тогда как 35 % суммарной активности ЛДГпр прочно связаны с мембранами митохондрий (после солюбилизации). Аналогичное распределение активности выявлено для АДГпр и комплекса ЛДГпр-АДГпр: преобладающее количество общей активности АДГпр (53 %), кластера ЛДГпр-АДГпр (63 %) отмечено в солюбилизате, 47 % АДГпр и 37 % комплекса – прочно связаны с мембранами (рис. 1). Согласно литературным данным, изменение способности белков к связыванию с мембраной может сопровождаться существенными преобразованиями в строении и в функционировании энзимов [1].

Выявлено, что у животных в обратной реакции преобладает лабильно связанная с мембраной форма лактатдегидрогеназы (57 %). Иная картина характерна для АДГобр крыс, при которой подавляющее количество фермента находится в связанном с мембранами состоянии (78 %), и лишь 22 % суммарной активности АДГобр приходится на лабильно связанную форму фермента. Для комплекса ЛДГобр-АДГобр интактных животных выявлено преобладание прочно связанных (57 %) форм энзима над лабильными (43 %) (рис. 1). Перераспределение ферментов между «свободными» и связанными с мембранами формами в комплексе, вероятно, связано с модификацией структуры мембран.

Удельная активность ЛДГпр в митохондриальной фракции печени до солюбилизации в составе кластера АДГпр-ЛДГпр статистически значимо уменьшилась в 2,6 раза, удельная активность АДГпр, наоборот, увеличилась в 5,6 раза по сравнению с активностью ферментов в односубстратных реакциях (рис. 2). Изменение каталитических свойств ЛДГ в составе кластера до солюбилизации обусловлено изменением кинетических характеристик фермента: статистически значимо возросло Kt в 3,2 раза, отмечено снижение каталитической эффективности ЛДГпр надмолекулярного комплекса (табл. 1). Выявлен механизм, посредством которого происходит снижение активности ЛДГпр, – смешанное ингибирование. Повышение активности АДГпр в составе кластера обусловлено двухпараметрически рассогласованной активацией [4].

Рис. 1. Распределение общей активности (нмоль НАДН/мин) ЛДГ, АДГ и их комплексов в митохондриях печени крыс до и после солюбилизации

Рис. 2. Удельная активность лактатдегидрогеназы и алкогольдегидрогеназы и комплекса ЛДГпр-АДГпр в митохондриальной фракции печени крыс до и после солюбилизации. Примечания: * – статистически значимые различия при р < 0,05 по сравнению с активностью до солюбилизации; # – статистически значимые различия при р < 0,05 по сравнению с активностью после солюбилизации; < – статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к АДГпр; > – статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к ЛДГпр

Полученные результаты показали, что удельная активность прочно связанных форм ЛДГпр в митохондриальной фракции печени (после солюбилизации) в составе кластера АДГпр-ЛДГпр статистически значимо уменьшилась в 2,4 раза, удельная активность АДГпр, наоборот, возросла в 4,6 раза по сравнению с активностью ферментов в односубстратных реакциях (рис. 2). Снижение активности ЛДГпр происходило по типу псевдоингибирования, повышение активности АДГпр – по типу двухпараметрически рассогласованной активации. Выявлено понижение сродства и каталитической эффективности ЛДГпр кластера соответственно в 16 и 3,3 раза по сравнению с кинетическими характеристиками лактатдегидрогеназы в прямой реакции. Отмечено повышение коэффициента кооперативности и коэффициент структурных изменений АДГпр в составе ЛДГпр-АДГпр в 1,3 и 1,2 раза соответственно (таблица).

Кинетические свойства лактатдегидрогеназы, алкогольдегидрогеназы и кластера АДГ-ЛДГ в митохондриальной фракции печени крыс до и после солюбилизации

Примечания: & – статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к группе ЛДГ; ^ – статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к группе АДГ; * – статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к группе ЛДГ, АДГ и ЛДГ-АДГ до солюбилизации; # – статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к группе АДГ, ЛДГ и ЛДГ-АДГ после солюбилизации.

Удельная активность и каталитическая эффективность лабильно связанных форм ЛДГпр в митохондриальной фракции печени (солюбилизат) у интактных животных в составе кластера АДГпр-ЛДГпр статистически значимо уменьшились в 2,7 раза, удельная активность АДГпр, наоборот, увеличилась в 6,9 раза по сравнению с активностью ферментов в односубстратных реакциях. Возросли также показатели Kn, Kd АДГпр надмолекулярного кластера АДГпр-ЛДГпр в 1,3 раза. Установлен механизм, посредством которого происходит снижение активности ЛДГпр, – неконкурентное ингибирование. Повышение активности алкогольдегидрогеназы в прямой реакции в составе кластера обусловлено двухпараметрически согласованной активацией [4].

Показано, что использование 0,15 М раствора NaCl вызывает статистически значимое повышение удельной активности односубстратной ЛДГпр, АДГпр в солюбилизате в 3,4 и 2,8 раза соответственно по сравнению с активностью ферментов до солюбилизации. Удельная активность ЛДГпр, АДГпр митохондрий после солюбилизации возросла в 1,3 и 1,8 раза по сравнению с активностью энзимов до солюбилизации. Выявлены статистически значимые отличия активности между прочно и лабильно связанными формами ЛДГпр и АДГпр. Удельная активность ЛДГпр, АДГпр солюбилизата выше в 2,5 и 1,5 раза соответственно по сравнению с активностью прочно связанных с мембраной ферментов.

Активность надмолекулярного кластера ЛДГпр-АДГпр в солюбилизате, во фракции митохондрий после солюбилизации статистически значимо повысилась в 3,4 и 1,5 раза по сравнению с активностью комплекса до солюбилизации. Удельная активность лабильно связанной формы кластера ЛДГпр-АДГпр выше активности прочно связанного с мембраной комплекса ферментов в 2,3 раза.

Выявлено, что удельная активность ЛДГобр в митохондриальной фракции печени до солюбилизации у интактных животных в составе кластера АДГобр-ЛДГобр статистически значимо не отличается от активности односубстратной реакции ЛДГобр. Удельная активность, каталитическая эффективность, значения коэффициентов Kn, Kd АДГобр статистически значимо увеличились в 2,4; 1,5; 1,3; 1,3 раза по сравнению с каталитическими и кинетическими свойствами фермента в односубстратной реакции (рис. 3; таблица). Повышение активности АДГобр обусловлено двухпараметрически рассогласованной активацией.

После солюбилизации удельная активность ЛДГобр и АДГобр в митохондриальной фракции печени крыс в составе кластера АДГобр-ЛДГобр статистически значимо увеличилась соответственно в 1,4 и 1,6 раза по сравнению с активностью ферментов в односубстратных реакциях по типу двухпараметрически рассогласованной активации.

Рис. 3. Удельная активность лактатдегидрогеназы и алкогольдегидрогеназы и комплекса ЛДГобр-АДГобр в митохондриальной фракции печени крыс до и после солюбилизации. Примечания: * – статистически значимые различия при р < 0,05 по сравнению с активностью до солюбилизации; # – статистически значимые различия при р < 0,05 по сравнению с активностью после солюбилизации; < – статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к АДГобр; > – статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к ЛДГобр

Удельная активность лабильно связанных форм ЛДГобр в митохондриальной фракции печени (солюбилизат) у интактных животных в составе кластера АДГобр-ЛДГобр статистически значимо уменьшилась в 1,3 раза, удельная активность АДГобр, наоборот, увеличилась в 4,4 раза по сравнению с активностью ферментов в односубстратных реакциях (рис. 2). Отмечено снижение каталитической эффективности и сродства ЛДГобр кластера ЛДГобр-АДГобр в 2,4 и 4,8 раза соответственно. Каталитическая эффективность АДГобр комплекса и сродство фермента к субстрату возросли в 6,03 и 1,4 раза (таблица). Выявлен механизм, посредством которого происходит снижение активности ЛДГобр, – псевдоингибирование. Повышение активности алкогольдегидрогеназы в обратной реакции в составе кластера обусловлено двухпараметрически согласованной активацией [4].

Полученные результаты показали, что после солюбилизации происходит повышение удельной активности односубстратной лабильно связанной ЛДГобр в 1,9 раза по сравнению с активностью фермента до солюбилизации. Выявлены статистически значимые отличия активности между прочно и лабильно связанными формами ЛДГобр: удельная активность ЛДГобр солюбилизата выше в 1,8 раза.

Удельная активность АДГобр митохондрий после солюбилизации возросла в 2,3 раза по сравнению с активностью энзима до солюбилизации. Полученные результаты показали, что удельная активность прочно связанной односубстратной АДГобр статистически значимо выше в 2,5 раза по сравнению с лабильно связанной формой АДГобр.

После солюбилизации активность прочно и лабильно связанных фракций надмолекулярного комплекса ЛДГобр-АДГобр также возросла в 1,6 и 1,7 раза по сравнению с активностью кластера до солюбилизации (рис. 3).

Таким образом, использование 0,15 М раствора NaCl показало, что преобладающее количество общей суммарной активности ЛДГпр, АДГпр, ЛДГобр, кластера ЛДГпр-АДГпр интактных животных приходится на лабильно связанную с мембраной форму фермента (солюбилизат). Для АДГобр, надмолекулярного комплекса ЛДГобр-АДГобр крыс выявлено преобладание прочно связанных с мембраной форм энзимов.

До солюбилизации и в солюбилизате в составе кластера отмечено снижение удельной активности лактатдегидрогеназы как в прямой, так и в обратной реакциях, увеличение активности АДГпр и АДГобр по сравнению с односубстратными реакциями.

Показано, что после солюбилизации мембранносвязанных ферментов удельная активность ЛДГ, АДГ и их комплексов во фракциях прочно и лабильно связанных с мембранами ферментов возрастает по сравнению с активностью до солюбилизации. Для односубстратных реакций ферментов и энзимов гетерогенной системы (АДГ-ЛДГ) выявлены изменения кинетических характеристик лактатдегидрогеназы и алкогольдегидрогеназы, которые приводят к смещению направленности метаболизма клетки.

Т.о., в условиях внутриклеточного окружения ЛДГ и АДГ образуют кластерный надмолекулярный комплекс, в различной степени связанный с мембранами митохондрий. Каталитически активная конформация ферментов может в значительной степени формироваться мембраной. При связывании ЛДГ и АДГ с мембраной формируется оптимальное микроокружение, обеспечивающее нативную конформацию и каталитическую активность ферментов.

Рецензенты:

Корягин А.С., д.б.н., профессор кафедры физиологии и биохимии человека и животных, ГОУ ВПО «ННГУ им. Н.И. Лобачевского», г. Нижний Новгород;

Веселов А.П., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биохимии и физиологии растений, декан биологического факультета, ГОУ ВПО «ННГУ им. Н.И. Лобачевского», г. Н. Новгород.

Работа поступила в редакцию 12.07.2013.

Библиографическая ссылка