Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Звягина В.И. 1 Медведев Д.В. 1 Бельских Э.С. 1 Фрольцов Д.В. 1

---

1 ГБОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Целью работы было изучить влияние донора NO L-аргинина на содержание метаболитов оксида азота, активность оксидоредуктаз митохондрий и процессы спонтанного окисления белков в ткани сердца крыс в условиях ингибирования синтеза NO, вызванного неселективным ингибитором NO-синтазы L-NG-нитроаргинина метиловым эфиром (L-NAME), и оценить действие L-аргинина на функциональное состояние митохондрий клеток сердца. Для выделения митохондрий использовался метод дифференциального центрифугирования. Концентрацию метаболитов NO и активность ферментов измеряли спектрофотометрически, окислительную модификацию белков оценивали по методу R.L. Levine в модификации Е.Е. Дубининой. В ходе исследования выявлено, что ингибирование синтеза NO под действием L-NAME приводит к статистически значимым изменениям активности ферментов митохондрий и развитию вторичной митохондриальной дисфункции. L-аргинин стимулирует образование метаболитов NO в сыворотке крови и ещё более выражено в митохондриях ткани сердца крыс в условиях дефицита NO. Действие L-аргинина на метаболизм клеток сердца крыс можно в целом оценить как положительное, так как он замедляет процессы свободно-радикального окисления белков в цитоплазме этих клеток и нормализует активность большинства ферментов митохондрий, способствуя компенсации митохондриальной дисфункции.

Статья в формате PDF

308 KB

оксид азота

вторичная митохондриальная дисфункция

L-аргинин

L-NAME

1. Алмакаева Л.Г., Литвинова Е.В. Аргинин и его применение в медицине и фармации // Лiки Украïни плюс. – 2011. – № 1 (5). – С. 23–26.

2. Вторичная митохондриальная дисфункция при остром коронарном синдроме / Ю.А. Васюк, К.Г. Куликов, О.Н. Кудряков [и др.] // Рациональная фармакотерапия в кардиологии, 2007. – № 1. – С. 41–47.

3. Гарматина О.Ю., Ткаченко М.Н., Мойбенко А.А. Индуцибельная синтаза оксида азота при патологии сердца (обзор литературы и собственных исследований) // Теоретична медицина. – 2005. – Т. 11. – № 4. – С. 645–660.

4. Граник В.Г., Григорьев Н.Б. Оксид азота (NO). Новый путь к поиску лекарств: монография. – М.: Вузовская книга. – 2004. – 360 с.

5. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения / Е.Е. Дубинина, С.О. Бурмистров, Д.А. Ходов [и др.] // Вопросы мед. химии. – 1995. – Т. 41. – № 1. – С. 24–26.

6. Костюк В.А., Потапович А.И., Ковалева Ж.В. Простой и чувствительный метод определения активности супероксиддисмутазы, основанный на реакции окисления кверцетина // Вопросы мед. химии. – 1990. – № 2. – С. 88–91.

7. Марков Х.М. L-аргинин–оксид азота в терапии болезней сердца и сосудов // Кардиология. – 2005. – № 6. – С. 87–95.

8. Метельская В.А., Гуманова Н.Г. Скрининг-метод определения уровня метаболитов оксида азота в сыворотке // Клиническая лабораторная диагностика. – 2005. – № 6. – С. 15–18.

9. Мещерякова О.В., Чурова М.В., Немова Н.Н. Митохондриальный лактат-окисляющий комплекс и его значение для поддержания энергетического гомеостаза клеток (обзор) // Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов. Т. 1. Экологическая физиология и биохимия водных организмов: сборник научных статей. – Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2010. – С. 163–172.

10. Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен) / под ред. М.И. Прохоровой. – Л.: Изд-во Ленинградского университета, 1982. – 327с.

11. Эндотелиопротекторные эффекты L-аргинина при моделировании дефицита окиси азота. / М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Корчаков [и др.] // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2008. – Т.71, № 2. – С. 29–31.

12. Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins / R.L. Levine, D. Garland, C.N. Oliver [at al.] // Methods in enzymology. – 1990. – Vol. 186. – P. 464–478.

13. Marcovina Santica M., Sirtori Cesare, Peracino Andrea. Translating the basic knowledge of mitochondrial functions to metabolic therapy: role of L-carnitine // The journal of laboratory and clinical medicine. – 2012. – P. 73–84.

14. Zun-Yi Wang, Hakanson Rolf. Role of nitric oxide (NO) in ocular inflammation // British Journal of Pharmacology – 1995. – Vol. 116. – P. 244–245.

Большинство заболеваний сердца связано с ишемией миокарда. Одной из причин ишемии может являться дефицит оксида азота (NO). Недостаточное кровоснабжение сердца вызывает метаболические нарушения в кардиомиоцитах, что, в свою очередь, приводит к развитию вторичной митохондриальной дисфункции. Митохондриальная дисфункция представляет собой патологический процесс, который может быть вызван различными повреждающими факторами, в частности, ишемией. Выделяют первичную митохондриальную дисфункцию, являющуюся следствием врождённого генетического дефекта, и вторичную, возникающую при некоторых приобретённых заболеваниях [2]. Вторичная митохондриальная дисфункция включается в патогенез хронической сердечной недостаточности и острого коронарного синдрома [2, 13]. Дисфункция митохондрий приводит к нарушению окислительного декарбоксилирования пирувата, окисления ацетил-КоА, окислительного фосфорилирования, β-окисления жирных кислот, непрямого окислительного дезаминирования аминокислот, системы антиоксидантной защиты и гиперпродукции митохондриями активных форм кислорода.

В свете вышесказанного целесообразным является поиск средств метаболической коррекции вторичной дисфункции митохондрий при заболеваниях сердца в условиях дефицита NO. Одним из возможных соединений, улучшающих метаболизм кардиомиоцитов при ишемии миокарда, является донор NO L-аргинин. На настоящий момент проведён ряд исследований, касающихся возможности применения аргинина в кардиологии [1]. Однако влияние этой аминокислоты на функционирование митохондрий кардиомиоцитов не изучалось.

Цель исследования: изучить влияние аргинина на содержание метаболитов NO, активность оксидоредуктаз митохондрий и процессы спонтанного окисления белков в ткани сердца крыс в условиях ингибирования синтеза NO, и, исходя из полученных данных, оценить действие аргинина на функциональное состояние митохондрий клеток сердца.

Материалы и методы исследования

Исследование проводилось на 40 крысах самцах линии Вистар массой 230–270 г. Крысы были разделены на 5 групп, каждая из которых включала по 8 животных. Первой группе ежедневно в течение 7 дней 1 раз в сутки внутрибрюшинно вводился 0,9 % раствор NaCl, второй и третьей группам ежедневно в течение 7 дней 1 раз в сутки внутрибрюшинно вводился водный раствор L-NG-нитроаргинина метилового эфира (L-NAME) – неселективного ингибитора NO-синтазы в дозах 25 и 200 мг/кг соответственно, четвёртой и пятой группам на фоне ежедневного в течение 10 дней введения 1 раз в сутки per os раствора аргинина в дозе 500 мг/кг на 0,9 % растворе NaCl внутрибрюшинно вводился в течение 7 дней 1 раз в сутки водный раствор L-NAME в дозах 25 и 200 мг/кг соответственно. Выбор доз проводился на основе литературных данных [1, 7, 11, 14].

При работе с крысами руководствовались «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Умерщвление животных проводилось под эфирным наркозом путём вскрытия брюшной полости и пересечения спинной аорты.

Сыворотку крови использовали для определения содержания в ней метаболитов NO. Из ткани сердца с помощью гомогенизатора Potter S получали гомогенат и выделяли из него митохондрии методом дифференциального центрифугирования [10]. Для оценки окислительной модификации белков использовали надосадочную жидкость, а осадок, содержащий митохондрии, ресуспендировали в 0,25 М растворе сахарозы с добавлением детергента Тритона Х-100 (для разрушения митохондриальных мембран) и далее использовали для определения активности митохондриальных ферментов: сукцинатдегидрогеназы, митохондриальной Mn-зависимой супероксиддисмутазы, α-гидроксибутиратдегидрогеназы и глутаматдегидрогеназы, а также для измерения концентрации метаболитов NO в митохондриях.

Общее содержание белка в пробах определяли по методу Лоури с помощью стандартизированного набора DiaSyS Diagnostic Systems. Окислительную модификацию белков оценивали с помощью метода R.L. Levine [12] в модификации Е.Е. Дубининой [5], основанного на реакции взаимодействия карбонильных групп и иминогрупп окисленных аминокислотных остатков с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов, обладающих специфическим спектром поглощения в ультрафиолетовой и видимой областях спектра. Оптическую плотность образовавшихся динитрофенилгидразонов регистрировали на спектрофотометре СФ-2000 при длинах волн 254, 270, 280, 356, 363, 370, 430 и 530 нм.

Активность α-гидроксибутиратдегидрогеназы и глутаматдегидрогеназы измеряли с помощью стандартизированных наборов Dia SyS Diagnostic Systems.

Активность сукцинатдегидрогеназы исследовали с помощью метода, основанного на определении восстановленного гексацианоферрата [10]. Активность супероксиддисмутазы определяли при помощи метода В.А. Костюка [6].

Определение концентрации метаболитов NO (нитритов и нитратов) проводили с помощью метода в модификации В.А. Метельской [8] на иммуноферментном анализаторе StatFax 3200.

Полученные в ходе исследования результаты обрабатывались с помощью программы Microsoft Excel 2003. Для определения различий между независимыми группами использовали U-критерий Манна‒Уитни. Уровень отличий рассматривался как статистически значимый при вероятности ошибки (p) < 0,05.

Результаты исследованияи их обсуждение

Из таблицы 1 видно, что введение L-NAME вызывает дозозависимое снижение концентрации метаболитов NO и в сыворотке крови, и в митохондриях сердца. Менее выраженное снижение концентрации метаболитов NO в митохондриях сердца по сравнению с сывороткой крови может быть связано с особенностями распределения L-NAME в организме или с некоторой селективностью его действия в отношении конститутивных форм NO-синтаз [4]. По-видимому, L-NAME как ингибитор оказывает более выраженное действие на эндотелиальную NO-синтазу, являющуюся главным поставщиком NO для крови, чем на индуцибельную NO-синтазу, являющуюся главным продуцентом NO в митохондриях сердца (фермент экспрессируется в сердце как при патологии, так и в норме, и обладает в сотни раз большей активностью, чем конститутивные формы NO-синтаз [3]).

Аргинин при совместном введении с L-NAME в обеих дозах увеличивает концентрации метаболитов NO как в сыворотке крови, так и в митохондриях клеток сердца. Это косвенно указывает на способность аргинина активировать синтез NO даже при ингибировании NO-синтаз.

Применение L-NAME приводит к снижению активности α-гидроксибутиратдегидрогеназы, практически не зависящему от дозы ингибитора NO-синтазы. Введение аргинина не вызывает достоверного изменения активности фермента на фоне L-NAME в дозе 25 мг/кг, но приводит к резкому (в 4,3 раза) увеличению активности α-гидроксибутиратдегидрогеназы на фоне L-NAME в дозе 200 мг/кг. α-гидроксибутиратдегидрогеназной активностью обладают 2 изофермента лактатдегидрогеназы (ЛДГ) – ЛДГ-1 и ЛДГ-2, так как только эти 2 изофермента ЛДГ способны катализировать обратимую реакцию превращения α-гидроксибутирата в 2-оксобутират. В митохондриях клеток сердца в отличие от цитоплазмы кардиомиоцитов нет ЛДГ-2, а присутствует только ЛДГ-1 (и не измеряемая данным методом ЛДГ-5). Митохондриальная ЛДГ-1 связана с внешней стороной внутренней мембраны митохондрий, её активный центр обращён в матрикс. Этот фермент является составной частью митохондриального лактат-окисляющего комплекса, обеспечивающего дегидрирование лактата и одновременно транспорт образующегося пирувата в митохондрию [9]. Обратная реакция восстановления пирувата в лактат в митохондриях сердца малоактивна. Поэтому повышение активности α-гидроксибутиратдегидрогеназы митохондрий должно свидетельствовать об активации процесса окисления лактата.

Концентрация метаболитов NO, общий белок и показатели активности ферментов митохондрий (результаты представлены в форме:среднее значение ± стандартное отклонение, M ± s)

Примечания:

* – достоверные отличия от группы, получавшей 0,9 %-й раствор NaCl (p < 0,05);

** – достоверные отличия от групп, получавших L-NAME в соответствующих дозах (p < 0,05).

Активность глутаматдегидрогеназы под действием L-NAME достоверно дозозависимо снижается на 28,15 % при дозе 25 мг/кг и на 76,46 % при дозе 200 мг/кг. Введение аргинина на фоне L-NAME в дозе 25 мг/кг приводит к увеличению активности фермента более чем в 1,5 раза, а на фоне L-NAME в дозе 200 мг/кг – в 1,8 раз. Значительное увеличение активности глутаматдегидрогеназы под действием аргинина объясняется избыточным поступлением аминокислот в организм животного, что приводит к необходимости их утилизации путём непрямого окислительного дезаминирования.

Активность сукцинатдегидрогеназы под действием L-NAME изменяется разнонаправлено: доза 25 мг/кг приводит к достоверному увеличению активности фермента в 1,8 раза, а доза 200 мг/кг – к её снижению в 2,2 раза. Введение аргинина на фоне L-NAME в дозе 25 мг/кг приводит к снижению активности фермента в 2,2 раза, а на фоне L-NAME в дозе 200 мг/кг – к повышению его активности в 1,8 раз, но эти изменения не являются статистически значимыми. Интересно, что при использовании аргинина в обоих случаях активность сукцинатдегидрогеназы близка к значению контрольной группы, то есть имеет место нормализация активности фермента под действием аргинина в условиях ингибирования синтеза NO.

Введение L-NAME в дозе 25 мг/кг приводит к увеличению активности супероксиддисмутазы более чем в 4 раза, а в дозе 200 мг/кг – в 3,2 раза. Аргинин вызывает резкое снижение активности фермента как на фоне L-NAME в дозе 25 мг/кг в 8 раз, так и на фоне L-NAME в дозе 200 мг/кг в 10,7 раза. Этот эффект аргинина, видимо, обусловлен его антиоксидантным действием.

Введение L-NAME в дозе 25 мг/кг достоверно (p < 0,05 – по сравнению с контрольной группой) снижает показатели спонтанной ОМБ при длине волны 430 нм в 49,5 раз (рисунок). L-NAME же в дозе 200 мг/кг достоверно снижает значения спонтанной ОМБ при λ = 356 нм на 38,2 % (p < 0,01 – по сравнению с контрольной группой), а при 363 нм – на 31,3 % (p < 0,05 – по сравнению с контрольной группой). Введение аргинина на фоне L-NAME в дозе 25 мг/кг снижает показатели спонтанной ОМБ при длинах волн 356 и 363 нм соответственно в 3,4 и 2,6 раз, а на фоне L-NAME в дозе 200 мг/кг – при длинах волн 356, 363 и 370 нм соответственно в 1,8, 1,7 и 1,6 раз (p < 0,05 – по сравнению с группами, получавшими L-NAME в соответствующих дозах). Таким образом, аргинин снижает количество как ранних маркёров окислительной деструкции белков – нейтральных альдегиддинитрофенилгидразонов (их максимум поглощения 356 нм), так и поздних – нейтральных кетондинитрофенилгидразонов (максимумы поглощения 363 и 370 нм). Такая динамика указывает на непрямой антиоксидантный эффект аргинина, который, по-видимому, не связан с его действием на активность митохондриальных оксидоредуктаз.

Результаты спонтанной ОМБ: содержание карбонильных групп на 1 г белка в пробе

Выводы

Ингибирование синтеза NO под действием L-NAME приводит к статистически значимым изменениям активности изучаемых ферментов митохондрий и развитию вторичной митохондриальной дисфункции.

Аргинин стимулирует образование метаболитов NO в сыворотке крови и ещё более выражено в митохондриях ткани сердца крыс в условиях ингибирования синтеза NO, вызванного L-NAME.

Действие аргинина на метаболизм клеток сердца крыс можно в целом оценить как положительное, потому что он замедляет процессы свободно-радикального окисления белков в цитоплазме этих клеток и нормализует активность большинства ферментов митохондрий, способствуя компенсации митохондриальной дисфункции.

Рецензенты:

Булатецкий С.В., д.м.н., профессор кафедры уголовного процесса и криминалистики, полковник полиции, Рязанский филиал ФГКОУ ВПО «Московский университет Министерства внутренних дел Российской Федерации», г. Рязань;

Емельянова А.С., д.б.н., профессор кафедры технологии производства и переработки продукции животноводства, ФГБОУ ВПО «Рязанский государственный агротехнологический университет имени П.А. Костычева», г. Рязань.

Работа поступила в редакцию 15.07.2013.

Библиографическая ссылка