Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Вишенкова Д.А. 1 Короткова Е.И. 1 Дорожко Е.В. 1

---

1 ФГБОУ ВПО «Национальный исследовательский Томский политехнический университет»

В данной работе в основу определения гепарина на стекло-углеродном электроде (СУЭ) методом вольт­амперометрии с постоянно-токовой разверткой потенциала легла его комплексообразующая способность, реализующаяся путем взаимодействия анионных группировок полисахарида с катионными группами других соединений. В качестве соединения, способного образовать комплекс с гепарином, использовался краситель катионной природы метиленовый голубой (МГ). В фосфатном буферном растворе эквимолярной смеси KH2PO4 и Na2PO4 с pH 6,86 МГ дает хорошо выраженный пик электроокисления при Е = –0,02 В (нас. х. с.э.). После добавления гепарина к раствору МГ ток пика окисления красителя значительно уменьшался со смещением потенциала в положительную область без появления новых пиков в диапазоне сканирования. Подобраны оптимальные условия для электрохимического определения гепарина в лекарственной форме с использованием МГ. При оптимальных условиях уменьшение тока пика окисления МГпропорционально концентрации гепарина в диапазоне от 3,85∙10–4 до 3,85∙10–3 мг/мл.

Статья в формате PDF

380 KB

вольтамперометрия

гепарин

метиленовый голубой

электроокисление

антикоагулянт

1. Determination of over sulfated chondroitin sulfate and derma tan sulfate in heparin sodium using anion-exchange chromatography with UV detection. Dionex Application Note 235.www.dionex.com. – 2010.

2. Ghous T. Flow Injection Determination of Heparin by Inhibition of Ribonuclease (Rnase). // Jour. Chem. Soc. Pak. – 2004. – Vol. 26, № 1. – P. 28–34.

3. Heparin Sodium, USA Pharmacopeia Forum. – 2009. – P. 1–4.

4. Jaques L.B. A method for the determination of heparin in blood / L.B. Jaques, F.C. Monkhouse, M. Stewart // J. Physiol. – 1949. – Vol. 109. – P. 41–48.

5. Jan Langmaier, Jiri Olsak, Eva Samcova, ZdenekSamec, Antonin Trojanek // Electroanalysis. – 2006. – Vol. 18, № 2. – P. 115–120.

6. Khokhlov. V.Yu., Selemenev V.F., Khohlova O.N., Shcherbinin R.L // Pharmaceutical Chemistry Journal. – 1999. – Vol. 33, № 8. – P. 450–451.

7. Limtiaco, J.F.K.; Jones, C.J.; Larive, C.K. Characterization of Heparin Impurities with HPLCNMR Using Weak Anion-Exchange Chromatography. // Anal. Chem. – 2009. – Vol. 81, № 24. – P. 10116–10123.

8. Manzoori J., Jouyban A., Amjadi M., Ramezani A. // Journal of Applied Spectroscopy. – 2013. – Vol. 80, № 1. – P. 104–110.

9. Nemcova I. Determination of Heparin Using Flow Injection Analisis with Spectrophotometric Detection / I. Nemcova, P. Rychlovsky, M. Havelcova // J. Analytica Chimica Acta. – 1999. – Vol. 401, № 1–2. – P. 223–228.

10. Pierson-Perry J.F. Development and characterization of an automated assay of effective heparin activity in plasma / J.F. Pierson-Perry, D.M. Obzansky, J.P. Mizzer // Clin. Chem. – 1987. – Vol. 33, № 9. – P. 1630–1634.

11. Rahul P. Patel, Christian Narcowicz, Joseph P. Hutchinson, Emily F. Hilder, Glenn A. Jacobson // J. of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. – 2008. – Vol. 46. – P. 30–35.

12. Sun Wei, Ding Yaqin, Jiao Kui. Electrochemical Studies on the Interaction of Heparin with Crystal Violet and Analytical Application// J. of Analytical Chem. – 2006. – Vol. 61, № 4. – P. 359–364.

13. Бекровский А.Л., Сергеева Е.В., Суворов А.В., Козлов А.А. – М.: РЕНАМ, 2011. – C. 15.

14. Чазов Е.И., Лакин К.М. Антикоагулянты и фибринолитические средства. – М.: Медицина, 1975. – 310 с.

Гепарин – кислый серосодержащий гликозаминогликан, биополимер, состоящий из полисахаридных цепей, связанных с общим белковым ядром. Он является антикоагулянтным и антитромбическим средством, применяемым уже более 60 лет в клинической практике, в частности, при операциях на сердце и кровеносных сосудах, для поддержания жидкого состояния крови в аппаратах гемодиализа и искусственного кровообращения, при профилактике и терапии тромбоэмболических заболеваний [14].

Лабораторный контроль гепаринотерапии необходим для минимизации риска развития кровотечений при передозировке и оптимизации антитромбического лечения. Правильность определения активности гепарина крайне важна для производителей лекарственных форм данного соединения. Результаты измерений активности гепарина в субстанциях, полупродуктах и целевых лекарственных средствах позволяют обеспечить эффективность производства и в дальнейшем дают возможность предлагать клинике точно аттестованные препараты [13]. Благодаря широкому спектру применения гепарина его мониторинг в различных объектах вызывает большой интерес для многих медиков, биологов и химиков.

Анализ гепарина является сложной задачей из-за неоднородности соединения, размера молекулы и распределения в ней заряда дисперсии.

Существует ряд методов определения гепарина в разных объектах искусственного и природного происхождения. В настоящее время можно выделить биологические [2, 4, 10] и химические методы анализа. Химические же в свою очередь включают в себя три основные группы: спектральные [6, 8–9], хроматографические [1, 3, 7] и электрохимические [11–12].

Данная работа посвящена определению гепарина в лекарственной форме с использованием красителя МГ методом вольтамперометрии.

Материалы и методы исследования

Исходным препаратом в исследованиях использовали фармакологический раствор высокомолекулярного гепарина натрия в форме тетранатриевой соли (Na4Hep), для внутреннего и подкожного введения (ФГУП «Московский эндокринный завод», Россия, город Москва), упакованный во флаконы по 5 мл. Каждый миллилитр такого раствора содержал 38,5 мг соли. Раствор красителя МГ с классификацией ч.д.а. готовили растворением его навески 0,3198 г. в 100 мл бидистиллированной воды. Фоновым электролитом выбран фосфатный буферный раствор (эквимолярная смесь KH2PO4 и Na2PO4) с pH 6,86.

Все исследования выполняли на вольтамперометрическом анализаторе ТА–2 (ООО «Томьаналит», Россия, город Томск) с трехэлектродной системой, включающей индикаторный СУЭ, хлорид серебряный электрод сравнения и вспомогательный электрод из платины.

Исследуемый раствор фонового электролита объемом 10 см3 помещали в электрохимическую ячейку, добавляли лекарственную форму гепарина и краситель МГ в соотношении 1:10. Исследования проводили при постоянно-токовой развертке со скоростью 40 мВ/с в анодной области потенциалов от –1,0 до 1,5 В, время перемешивания раствора составляло 50 с, успокоения 60 с. Съемку анодной вольтамперограммы повторяли не менее пяти раз.

Для уменьшения ошибки эксперимента используемый в работе индикаторный СУЭ проходил предварительную поляризацию в области потенциалов от 2 до –2 В методом циклической вольтамперометрии.

Результаты исследования и их обсуждение

В литературных источниках информации о прямом электрохимическом определении гепарина при разных условиях ранее не сообщалось. Кроме того, в работе при поиске аналитического сигнала от гепарина в чистом виде на разных материалах электрода (РПЭ, СУЭ, PtЭ) получено не было. В связи с этим был предложен способ косвенного определения гепарина в комплексе с представителем соединений класса азокрасителей МГ. В исследовании использован нетоксичный и более чувствительный СУЭ, при проведении эксперимента на котором получены более воспроизводимые результаты по определению гепарина в лекарственной форме в комплексе с МГ.

Предварительно исследовались электрохимические свойства МГ методами циклической, катодной и анодной вольтамперометрии. Наиболее воспроизводимый сигнал МГ был получен в анодной области в диапазоне потенциалов от –1,0 до 1,5 В, в катодной области имело место мешающее влияние кислорода на МГ, поэтому область от –1,0 до 1,5 В была выбрана как рабочая.Большой интерес представляло собой исследование по выявлению влияния рН на ток окисления МГ. На рис. 1 представлена зависимость тока окисления МГ от рН фонового электролита на СУЭ.

Из рис. 1 видно, что в нейтральных и щелочных средах ток достигает своего максимума в отличие от кислых. В дальнейших исследованиях рН = 6,86 было выбрано как оптимальное значение.

Рис. 1. Зависимость тока электроокисления МГ на СУЭ от рН фонового электролита

При выборе оптимальных условий для определения гепарина в комплексе с МГ были сняты анодные вольтамперограммы МГ в отсутствии и присутствии гепарина, которые представлены на рис. 2.

В таблице представлены данные изменения интенсивности пиков окисления, потенциалов комплекса МГ-Hep в зависимости от концентрации гепарина в системе.

Используя данные, представленные в таблице, была построена зависимость тока окисления комплекса МГ-Hep от концентрации гепарина в электрохимической ячейке (рис. 3).

Из графика, представленного на рис. 3, видно, что с увеличением концентрации гепарина в ячейке уменьшается интенсивность сигнала окисления метиленового голубого в прямолинейной области концентраций от 10–4 до 10–3 мг/мл, что может быть использовано для определения гепарина косвенным методом в лекарственной форме.

Выводы

Подобраны оптимальные условия для определения гепарина в лекарственной форме косвенным методом по уменьшению пика окисления метиленового голубого.

При оптимизированных условиях получена линейная зависимость в диапазоне концентраций гепарина от 3,85∙10–4 до 3,85∙10–3 мг/мл.

Заключение

В фосфатном буферном растворе с рН 6,86 МГ заряжен положительно, а гепарин – отрицательно, взаимодействуя друг с другом электростатически, они образуют комплекс, в результате концентрация свободного МГ в растворе уменьшается, что приводит к снижению тока окисления МГ.

Рис. 2. Вольтамперограмма окисления МГ в отсутствии и присутствии гепарина на СУЭ: 1 – фоновая кривая; 2 – МГ 10–4 моль/дм3; 3 – 3,85∙10–4 мг/мл HepNa4; 4 – 19,25∙10–4 мг/мл HepNa4. W = 40 мВ/с, рН = 6,86

Данные анодной вольтамперометрии окисления комплекса МГ-Hep

Рис. 3. График зависимости токов окисления комплекса МГ-Hep от концентрации гепарина в электрохимической ячейке

Полученные в ходе исследования данные по уменьшению сигнала комплекса МГ при Е = –0,02 В с увеличением концентрации гепарина в системе могут быть использованы для разработки косвенного метода определения гепарина в лекарственных препаратах.

Работа выполнена в рамках государственного задания «Наука» по теме 3.2702.2011.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Президента Российской Федерации МК-7366.2013.8.

Рецензенты:

Слепченко Г.Б., д.х.н., профессор кафедры физической и аналитической химии, ФГБОУ ВПО «Национальный исследовательский Томский политехнический университет», г. Томск;

Колпакова Н.А., д.х.н., профессор кафедры физической и аналитической химии, ФГБОУ ВПО «Национальный исследовательский Томский политехнический университет», г. Томск.

Работа поступила в редакцию 01.07.2013.

Библиографическая ссылка