Роговица – это верхний слой глаза, состоящий из многослойного плоского эпителия, боуменовой мембраны, стромы, содержащей толстые волокна коллагена, протеогликаны, гликозаминогликаны и кератиноциты, и слоя эндотелиальных клеток. Она выполняет две основные функции: защищает внутренние ткани глазного яблока от воздействия агрессивных факторов внешней среды и участвует в проведении и преломлении света на поверхность сетчатки [24].
Защитная функция роговицы реализуется за счет плотных межклеточных контактов многослойного плоского эпителия и его способности к непрерывному обновлению [16]. Нарушение синхронности пролиферации клеток базального слоя с дифференциацией клеток в супрабазальных слоях многослойного плоского эпителия может приводить к развитию помутнения роговицы и соответственно к снижению остроты зрения [16].
Регенерация эпителия играет важную роль в процессе заживления роговицы при язвах, а также при фоторефракционной кератэктомии (эксимер-лазерная операция коррекции зрения). Данный обзор посвящен роли свободных радикалов в процессах регенерации роговицы при данных состояниях.
Роль свободных радикалов в жизнедеятельности клеток
Свободные радикалы – это молекулы, имеющие на внешней орбитали неспаренный электрон. Так как для устойчивого состояния молекулам на внешних орбиталях необходимы парные электроны, свободные радикалы активно стремятся отнять недостающий электрон у других молекул, что придает им высокую реакционную способность [2, 3].
Взаимодействуя с молекулами белков, жиров, углеводов и нуклеиновых кислот, свободные радикалы вызывают их окисление, что приводит к развитию мутаций и повреждению клеток [3]. Поэтому долгое время считалось, что продукция свободных радикалов является нежелательным процессом, участвующим в патогенезе большинства заболеваний.
Однако в последнее время показано, что свободные радикалы, окисляя тиоловые группы сигнальных молекул, могут выполнять и регуляторную роль, участвуя в редокс-регуляции (reduction – «восстановление», oxidation – «окисление»). Важными сигнальными каскадами, активируемыми при окислительном стрессе, являются рецепторы с тирозинкиназной активностью (рецепторы инсулина, инсулиноподобного фактора роста-1, ростовых факторов), митоген-активируемые протеинкиназы (Mitogen-Activated Protein Kinases – MAPK), зависимый от фосфатидилинозит-3-киназы и протеинкиназы В (Akt/PKB-зависимый путь) [1].
Роль свободных радикалов в регенерации эпителия роговицы в опытах invitro
Для изучения влияния свободных радикалов на регенерацию роговицы был проведен ряд исследований in vitro.
Было показано, что окислительный стресс, вызванный повышением концентрации кислорода в культуре клеток, может снижать пролиферацию кератиноцитов, а применение антиоксидантов нормализует данный процесс [23].
С другой стороны, в исследовании на культуре клеток роговичного эпителия выявлено, что Н2О2 в концентрациях 10–50 мкмМ повышает жизнеспособность, адгезию и миграцию клеток с активацией рецептора EGF (эпидермального фактора роста), причем данный процесс подавляется антиоксидантом N-ацетилцистеином (Y845). В то время как Н2О2 в концентрациях 60 и 70 мкмМ снижает их жизнеспособность [18, 21].
В другом исследовании установлено, что низкие концентрации Н2О2, образующиеся после повреждения эпителия роговицы, могут стимулировать его пролиферацию и миграцию и индуцировать фосфорилирование ERK 1/2 через рецептор EGF. p38 MAPK также фосфорилируется после воздействия H2O2, но это существенно не влияет на миграцию клеток [17].
Показано, что EGF (5 нг/мл) индуцирует продукцию свободных радикалов. Данный процесс подавляется N-ацетилцистеином, маннитолом, ингибиторами НАДФН-оксидазы или липоксигеназы. Генерация свободных радикалов, вызванная EGF, коррелирует с клеточным ростом и активацией Акt (протеинкиназы В) и MAPK сигнальным путем [15].
Также выявлено, что кератиноциты более устойчивы к воздействию H2O2 (250 и 500 μM), чем фибробласты. На совместной культуре кератиноцитов и фибробластов показано, что Н2О2 увеличивает реэпителизацию, в то время как антиоксидант N-ацетилцистеин задерживает ее [17].
Роль свободных радикалов в регенерации роговицы при гнойной язве
При бактериальном кератите в роговице можно выделить две основные группы источников свободных радикалов: ультрафиолетовое излучение солнечного света [8] и мигрирующие в роговицу нейтрофилы и макрофаги (в результате функционирования НАДФН2-оксидазного комплекса и миелопероксидазы) [6].
Активные формы кислорода вызывают непосредственное повреждение стромальных гликозаминогликанов с последующим нарушением их свойств[11], что приводит в конечном итоге к разрушению роговицы и язвообразованию [19]. Поэтому в комплексном лечении язвы роговицы патогенетически оправдано применение антиоксидантов. При проведении таких исследований были получены следующие результаты.
При закапывании 0,2 % раствора супероксиддисмутазы (СОД) при кератите, вызванном аппликацией 1 н раствора гидроксида натрия, происходило ускорение заживления повреждения роговицы, что дало возможность авторам сделать вывод о положительном влиянии [4].
Однако использование теми же авторами 0,2 % раствора супероксиддисмутазы при экспериментальной гнойной язве, вызванной Staphylococcus aureus, на фоне снижения выраженности оксилительного стресса, определяемого по хемилюминесценции люминола, приводило к усилению инфильтрации роговицы и существенно не влияло на клиническое течение репаративных процессов [5]
C другой стороны, в исследовании [20] применение препаратов СОД в течение первых 6 дней улучшало у морских свинок течение кератита, вызванного Pseudomonas aeruginosa, предотвращая пенетрацию роговицы и уменьшая повреждение эпителия под воздействием полиморфноядерных лейкоцитов.
Аналогичные результаты получены и в исследовании [7] по применению препаратов СОД и ацетилированной СОД (дольше удерживается на поверхности клеток) при экспериментальном кератите, вызванном липополисахаридом. На фоне введения антиоксидантов происходило снижение воспаления только в течение 6 дней эксперимента, в остальные сроки данный показатель от значений контроля не отличался.
Роль свободных радикалов в регенерации роговицы при фоторефракционной кератэктомии
Фоторефракционная кератэктомия (ФРК) является первой эксимер-лазерной операцией коррекции остроты зрения. Она включает в себя два этапа: первый – удаление эпителия (механическим или химическим путем), второй – воздействие эксимерным лазером (в УФ-спектре) на строму роговицы с формированием новой поверхности [25].
Рядом авторов показано, что эксимер-лазерная абляция роговицы ассоциируется с развитием хирургически вызванного окислительного стресса в тканях роговицы. Это ухудшает течение посттравматической воспалительной реакции и является одной из основных причин развития дисрегенеративных послеоперационных осложнений [14].
Среди причин окислительного стресса основной является продукция свободных радикалов и активных форм кислорода под действием эксимерного лазера. Кроме того, влияние эксимерного лазера ведет к ингибированию глутатион-зависимых ферментов антиоксидантной системы защиты роговицы [13].
В исследовании на кроликах показано, что ФРК сопровождается образованием свободных радикалов и развитием окислительного стресса в поверхностных слоях роговицы, что в свою очередь приводит к повреждению кератоцитов даже в отсутствии воспаления. Механическое выскабливание приводит к апоптозу также без участия воспаления. Гибель кератоцитов по механизму некроза наблюдается в более глубоких слоях роговицы и коррелирует с выраженностью воспаления [22].
В другом исследовании установлено, что сразу после воздействия фтор-аргонового лазера не отмечается достоверного повышения образования супероксидного-анион радикала, диеновых конъюгатов, ТБК-реактивных продуктов и гибели кератоцитов, однако в отсроченном периоде происходит увеличение данных показателей [10].
При использовании антиоксидантов в послеоперационном периоде были получены следующие результаты.
В исследовании на 8 кроликах установлено, что внутривенное введение аскорбиновой кислоты перед УФ-облучением (6,84 ДЖ/см2 306 нм 17 минут в течение 7 дней) уменьшало повреждение эпителиальных клеток, корнеальный хейз и неоваскуляризацию [26].
В двойном слепом рандомизированом исследовании на 40 пациентах показано, что пероральный прием 250000 МЕ ретинола пальмитата и 230 мг альфа токоферола никотината в дополнение к стандартной терапии глюкокортикостероидами в течение 90 дней приводит к ускорению реэпителизации (р = 0,029) [27].
В исследовании на кроликах установлено, что при ФРК (–6,00 ОД 5 мм) отмечается тенденция к улучшению заживления раны при применении цистеина и тенденция к ухудшению при использовании ЭДТА [12].
В исследовании на культурируемых кератоцитах кролика изучено влияние эксимерного лазерного излучения (12 и 45 мДж/см2) на развитие апоптоза. Показано, что данное излучение вызывает дозозависимую индукцию апоптоза, а предварительная обработка кератоцитов убихиноном Q10 значительно его уменьшает. При этом отмечается снижение концентрации конечного продукта пероксидации – малонового диальдегида [9].
Заключение
Согласно современным представлениям, продукция свободных радикалов может оказывать двоякую роль в жизнедеятельности клеток. Их умеренное образование играет регуляторную роль, модулируя редокс-статус клеток, а повышенная продукция приводит к повреждению белков, жиров, углеводов, нуклеиновых кислот, развитию окислительного стресса и, в конечном итоге, к гибели клетки по апоптотическому или некротическому механизмам.
Регенерация роговичного эпителия – важный процесс, обеспечивающий постоянное обновление верхнего слоя роговицы и тем самым защиту нижележащих тканей. Последние исследования показывают, что важную роль в нем играют низкие концентрации свободных радикалов. При этом повреждение роговичного эпителия может происходить при чрезмерной продукции свободных радикалов под действием ультрафиолетового излучения и мигрирующих лейкоцитов. Бесконтрольное применение антиоксидантов при повреждении эпителия роговицы далеко не всегда оказывается полезным, а зачастую даже замедляет процесс регенерации.
Таким образом, исходя из двойственной роли свободных радикалов в физиологии клеток и эпителия роговицы в частности, применение антиоксидантов в комплексной терапии должно быть дифференцированным и зависеть как от стадии патологического процесса, так и от выраженности окислительного стресса.
Работа поддержана грантом президента РФ № МК-4993.2012.7.
Рецензенты:
Боринский Ю.Н., д.м.н., профессор кафедры химии и биохимии, ГБОУ ВПО «Тверская ГМА» Минздрава России, г. Тверь;
Кунин В.Д., д.м.н., профессор, зав. глаукомным кабинетом поликлинического отделения, ГБУ РО «КБ им. Н.А. Семашко», г. Рязань.
Работа поступила в редакцию 07.06.2013.
Библиографическая ссылка
Щулькин А.В., Колесников А.В., Колесников А.В., Николаев М.Н., Баренина О.И. РОЛЬ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ В РЕГЕНЕРАЦИИ ЭПИТЕЛИЯ РОГОВИЦЫ // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 7-2. – С. 451-455;URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=31859 (дата обращения: 27.09.2024).