Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Туровский Е.А. 1 Туровская М.В. 1 Толмачева А.В. 1 Долгачева Л.П. 1 Зинченко В.П. 1 Дынник В.В. 1

---

1 Институт биофизики клетки РАН, Пущино

В экспериментах на культивируемых белых адипоцитах мышей с использованием флуоресцентной микроскопии и систем анализа изображений показано, что нейротрансмиттер норадреналин или агонисты β-адренорецепторов – изопротеренол, BRL-37344 в присутствии антагониста α1/2-адренорецепторов фентоламина вызывали увеличение [Ca2+]i в клетках. Селективный антагонист всех трех подтипов β-адренорецепторов – пропраналол подавлял этот Са2+ -ответ. Максимальная амплитуда [Ca2+]i наблюдалась при аппликации активатора β3-адренорецепторов – BRL-37344. Увеличение [Ca22+]i, инициированное активацией β-адренергических рецепторов, осуществляется аденилатциклазной системой трансдукции сигналов. С помощью селективных активаторов аденилатциклазной системы – форсколин, 8-Bromo-cAMP и ингибиторов протеинкиназы А (H-89) и рианодинового рецептора (рианодин) − показано, что сАМР, протеинкиназа А и рианодиновые рецепторы являются участниками пути генерации медленно-развивающегося Са2+ -ответа в культивируемых адипоцитах белого жира мыши.

Статья в формате PDF

379 KB

адипоциты

Са2+

изопротеренол

β-адренорецепторы

протеинкиназа А

IP3 и RyR

1. Bartness T.J., Song C.K. Thematic review series: adipocyte biology. Sympathetic and sensory innervation of white adipose tissue // J Lipid Res. – 2007. – Vol. 48. – P. 1655–1672.

2. Bruce J.I., Straub S.V., Yule D.I. Crosstalk between cAMP and Ca2 + signaling in non-excitable cells. // Cell Calcium. – 2003. – Vol. 34, № 6. – P. 431–444.

3. Dolgacheva L.P., Abzhalelov B.B., Zhang S.J., Zinchenko V.P., Bronnikov G.E. Norepinephrine induces slow calcium signaling in murine brown preadipocytes through the beta-adrenoceptor/cAMP/protein kinase A pathway. // Cell Signal. – 2003. – Vol. 15, № 2. – P. 209–216.

4. Hayato R., Higure Y., Kuba M., Nagai H., Yamashita H., Kuba K. β₃-Adrenergic activation of sequential Ca(2+) release from mitochondria and the endoplasmic reticulum and the subsequent Ca(2+) entry in rodent brown adipocytes. // Cell Cal-

cium. – 2011. – Vol. 49, № 6. – P. 400–414.

5. Langin D., Ekholm D., Ridderstråle M., Lafontan M., Belfrage P. cAMP-dependent protein kinase activation mediated by beta 3-adrenergic receptors parallels lipolysis in rat adipocytes. // Biochim Biophys Acta. – 1992. – Vol. 1135, № 3. – P. 349–352.

6. Morimoto S., O-Uchi J., Kawai M., Hoshina T., Kusakari Y., Komukai K., Sasaki H., Hongo K., Kurihara S. Protein kinase A-dependent phosphorylation of ryanodine receptors increases Ca2 + leak in mouse heart. // Biochem Biophys Res Commun. – 2009. – Vol. 390, № 1. – P. 87–92.

7. Mottillo E.P., Shen X.J., Granneman J.G. Beta3-adrenergic receptor induction of adipocyte inflammation requires lipolytic activation of stress kinases p38 and JNK. // Biochim Biophys Acta. – 2010. – Vol. 1801, № 9. – P. 1048–1055.

8. Turovsky E.A., Turovskaya M.V., Berezhnov A.V., Tolmacheva A.V., Kaimachnikov N.P., Dolgacheva L.P., Zinchenko V.P., Maevskii E.I., Dynnik V.V. Convergence of Ca2+ -signaling pathways in adipocytes. The role of L-arginine and protein kinase G in generation of transient and periodic Ca2+ -signals. // Biochemistry (Moscow). – 2012. – Vol. 6, № 1. – P. 35–44.

Симпатическая нервная система и нейротрансмиттер норадреналин (НА) играют важную роль в процессе липолиза триглицеридов белой жировой ткани [1]. Взаимодействие норадреналина с ?-адренорецепторами приводит к активации Gs-белков, аденилатциклазы, увеличению уровня сАМР и активации протеинкиназы А (PKA). Фосфорилирование протеинкиназой А гормон-чувствительной липазы и перилипина инициирует липолиз [5]. На клетках бурого жира показано, что активация β-адренорецепторов может вызывать рост не только сАМР, но и Са ²⁺ [4]. Механизмы β-адренорецептор-зависимого повышения [Ca ²⁺ ]_i в адипоцитах белой жировой ткани неизвестны. В данной работе на первичной культуре белых адипоцитов мышей предполагалось установить участие β-адренорецепторов и их подтипов в формировании Са ²⁺ -сигнала, пути передачи этих сигналов, участие Са ^{2 +} каналов эндоплазматического ретикулума.

Материалы и методы исследования

В экспериментах использовали первичную культуру белых адипоцитов мыши на 9 день культивирования (9 DIV), полученную из мезенхимальной фракции стволовых клеток эпидидимального жирового депо в соответствии с общепринятой методикой [8]. Измерение динамики цитозольного кальция ([Ca ²⁺ ]_i) проводили с помощью системы анализа изображений «Cell observer» (Carl Zeiss, Германия) на базе моторизованного микроскопа Axiovert 200M с высокоскоростной черно-белой CCD-камерой AxioCam HSm. Источником света служила ртутная лампа НВО 100. Возбуждение флуоресценции Fura-2 проводили при двух длинах волн (340 и 387 нм) с использованием запирающих светофильтров BP 340/30 и BP 387/15, регистрация в области (465–555) нм (светофильтр эмиссии ВР 510/90). Для формирования изображения использовали объектив Plan Neofluar 20×/0.3. В эксперименте получали серии изображений культуры с интервалом 3 сек. Для обработки серий изображений использовали программу Image J 1.44). Клетки загружали кальций-чувствительным зондом Fura-2 (Molecular probes, USA) в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS), содержащем 10 мМ HEPES, pH 7,4 при 37 °С в течение 40 мин с последующей отмывкой от красителя в течение 15 мин. Построение графиков осуществляли помощью программы Origin-8. Результаты, представленные в работе, получены на 4-х клеточных культурах с 5-ю повторами для каждой культуры.

Результаты исследования и их обсуждение

Ранее нами было показано на культуре белых адипоцитов, что норад­реналин (НА) в физиологических концентрациях вызывает 3 типа кальциевых ответов у белых адипоцитов. Поскольку НА взаимодействует с α1-, α2- и β-адренорецепторами адипоцитов белого жира, то для выделения Са2+ -ответа, инициируемого β-адренорецепторами, эксперименты были проведены в присутствии ингибитора ?1- и ?2-адренорецепторов – фентоламина (рис. 1). Как следует из рисунка, Са2+ -ответ начинается после лаг-периода и представляет собой медленное увеличение цитозольного кальция.

Похожие Са ^{2 +} -ответы были зарегистрированы под действием изопротеренола (агонист β1, β2, β3-адренорецепторов), и BRL (агонист β3-адренорецепторов) (рис. 2). Максимальная амплитуда увеличения [Ca2+]i наблюдалась при аппликации агониста β3-адренорецепторов, что согласуется с данными о том, что β3-адренорецепторы селективно экспрессированы в зрелых адипоцитах [7]. Следует отметить, что изменения [Ca2+]i под действием каждого из трех агонистов обычно развивается медленный двухфазный ответ.

Рис. 1. Изменение [Ca2 + ]i в адипоцитах белого жира при активации ?-адренорецепторов норадреналином (НА)на фоне антагониста ?1,2-адренорецепторов – фентоламина

Рис. 2. Увеличение [Ca2 + ]i в дифференцированных белых адипоцитах при активации ?-адренорецепторов и протеинкиназы А. Активация ?-адренорецепторов селективными агонистами – изопротеренол (?1,2,3, кривая 1), BRL-37344 (?3, кривая 2), аденилатциклазы (форсколин, кривая 3) и протеинкиназы А (8-Bromo-cAMP, кривая 4) ? приводит к медленному увеличению [Ca2+]i

Для доказательства специфичности Ca2+ -ответа были использованы селективные ингибиторы β-адренорецепторов пропраналол и α1-, α2-адренорецепторов фентоламин. Как следует из табл. 1, пропраналол полностью подавлял Са2+ -ответ под действием изопротеренола, а фентоламин не оказывал влияния на этот ответ.

Для определения источника увеличения Са2+ были проведены эксперименты с ингибиторами различных Са2+ -транспортирующих систем (каналов). В табл. 1 показано, что в присутствии ксестоспонгина (ингибитора IP3-рецепторов) происходит подавление амплитуды Са2+-ответа на 84 %. Таким образом, повышение Са2+ является следствием активации IP3-рецепторов. Известно, что для целого ряда невозбудимых клеток мобилизация Са2+ является IP3- и Са2+ -зависимой, а активность IP3R регулируется фосфорилированием различными протеинкиназ.

Таблица 1

Изменение [Са2+]i под действием 3 µM изопротеренола и антагонистов рецепторов

В последующих экспериментах мы показали, что Са ²⁺ -ответ, инициированный активацией β-адренергических рецепторов, сопряжен с активацией аденилатциклазной системы. Активация b-адренорецепторов адипоцитов приводит к опосредованной G-белками стимуляции аденилатциклазы и к образованию вторичного мессенджера – сАМР. Эти события можно имитировать либо добавлением форсколина – непосредственного активатора аденилатциклазы, либо добавлением к клеткам проникающего через плазматическую мембрану аналога сАМР – 8-Br-cAMP. Соединение 8-Br-cAMP является более резистентным к действию фосфодиэстераз, чем сАМР и активирует РКА.

Как следует из рис. 2, медленное увеличение внутриклеточного кальция происходит также при активации аденилатциклазы и протеинкиназы А с помощью проникающего аналога сАМР. Таким образом, воздействия, влияющие на увеличение в клетке сАМР, также вызывают повышение [Ca²⁺]_i . Основной мишенью сАМР в клетках является ПКА. Добавление к клеткам ингибитора протеинкиназы А Н-89 подавляло Ca2+ -ответы под действием сАМР (табл. 2), что указывает на участие этого фермента в повышении [Ca²⁺]_i под действием сАМР в адипоцитах белого жира. Для ряда клеток показано, что протеинкиназа А фосфорилирует IP3- и рианодиновые рецепторы энодлазматического ретикулума, и это приводит к увеличению активности Са²⁺ -каналов этих рецепторов [6]. Как следует из табл. 2, ингибитор IP3-рецепторов подавлял амплитуду Са²⁺ сигнала на 83 %, а ингибитор рианодиновых рецепторов полностью подавлял Са²⁺ сигнал у 20 % клеток.

Таблица 2

Изменение [Ca²⁺]_i под действием 5 µM 8-Br-cAMP и ингибиторов

Адипоциты белой жировой ткани играют главную роль в поддержании энергетического гомеостаза организма при голодании и физической нагрузке за счет липолиза запасенных триглицеридов. Процесс липолиза активируется адреналином и норадреналином через β-адренорецепторы, аденилатциклазу, сАМР, РКА и фосфорилирование гормончувствительной липазы и перилипина [5]. Мишенями протеинкиназы А являются и Са2+ -транспортирующие системы клетки, такие как Са2+ -каналы эндо/саркоплазматического ретикулума и плазматической мембраны и Са2+ -АТРазы [6]. Ранее было показано, что активация β-адренорецепторов клеток бурого жира вызывает увеличение [Ca²⁺]_i  [3]. В данной работе показано, что агонисты β-адренорецепторов, активатор аденилатциклазы форсколин или проникающий негидролизуемый аналог сАМР – 8-Br-cAMP вызывают медленное (по сравнению с Са²⁺ -ответами на агонисты α-адренорецепторов) повышение [Са²⁺]. В генерации этого Са²⁺ -сигнала участвуют не только протеинкиназы А, Са²⁺ -каналы IP₃R- и RyR-рецепторов, но и Са²⁺ -каналы плазматической мембраны (неопубликованные данные). Эти факты свидетельствуют в пользу того, что один агонист (НА), активируя α- и β-рецепторы, создает условия для конвергенции таких сигнальных путей, регулирующих уровни cAMP, cGMP и Ca2+, как аденилатциклазный и фосфоинозитидный [8].

Заключение

Представленный в данной работе медленный Са²⁺ -сигнал, по-видимому, необходим клеткам для повышения базового уровня кальция, который влияет на частоту и амплитуду Са²⁺ -ответов на множество гормонов и трансмиттеров, сопряженных с активацией Са²⁺ -систем сигнализации. В таких параметрах, как частота и амплитуда, закодирована сигнальная информация, передаваемая в ядро на экспрессию специ­фических генов [2].

Работа выполнена при финансовой поддержке: ФНМ – 01201258223; ГК 16.512.11.2092 – 01201179771; ФНМ – 01201256033; РФФИ № 10-04-01306.

Библиографическая ссылка