Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Марданов А.В. 1 Белецкий А.В. 1 Равин Н.В. 1

---

1 ФГБУН Центр «Биоинженерия» Российской академии наук

Термофильная анаэробная бактерия Thermosyntropha lipolytica, выделенная из щелочного озера Богория в Кении, способна расщеплять триглицериды и утилизировать жирные кислоты в симбиотическом синтрофном сообществе с метаногенными археями. В отсутствие симбионтов эта бактерия может сбраживать некоторые белковые субстраты. В результате определения полной нуклеотидной последовательности генома T. lipolytica идентифицирован набор гидролитических ферментов этой бактерии. Анализ аминокислотных последовательностей позволил идентифицировать ферменты, содержащие N-концевые сигнальные последовательности, которые могут обеспечивать секрецию из клетки в окружающую среду. Среди этих ферментов обнаружены протеазы различных типов, липазы и гликозил-гидролазы. Наличие этих секретируемых гидролаз объясняет способность T. lipolytica расти на белковых субстратах и липидах и свидетельствует о том, что эта бактерия может также обладать способностью использовать для роста и некоторые полисахариды. Идентифицированные гидролитические ферменты, активные при высокой температуре в щелочных условиях, перспективны для применения в промышленной биотехнологии.

Статья в формате PDF

282 KB

бактерия

геном

протеаза

липаза

термоалкалофил

1. Гумеров В.М., Марданов А.В., Колосов П.М., Равин Н.В. Выделение и характеристика липазы из термоалкалофильной бактерии Thermosyntropha lipolytica // Прикладная биохимия и микробиология. – 2012. – Т. 48. – № 4. – С. 376–382.

2. Antranikian G., Vorgias C.E., Bertoldo C. Extreme environments as a resource for microorganisms and novel biocatalysts // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. – 2005. – Vol. 96. – P. 219–262.

3. Bendtsen J.D., Nielsen H., von Heijne G., Brunak S.J. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0 // J. Mol. Biol. – 2004. – Vol. 340(4). – P. 783–795.

4. Besemer J., Borodovsky M. GeneMark: web software for gene finding in prokaryotes, eukaryotes and viruses // Nucleic Acids Res. – 2005. – Vol. 33. – P. 451–454.

5. Gooday G. The ecology of chitin degradation. In: Marshall K. (ed) Advances in microbial ecology. – 1990 – Plenum Press, New York. – P. 387–430.

6. Karlsson M., Stenlid J. (2008) Evolution of family 18 glycoside hydrolases: diversity, domain structures and phylogenetic relationships // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. – 2009. – Vol.16 (3–4). – P. 208–223.

7. Salameh M.A., Wiegel J. Purification and characterization of two highly thermophilic alkaline lipases from Thermosyntropha lipolytica // Appl. Environ. Microbiol. – 2007. – Vol. 73(23). – P. 7725–7731.

8. Schink B. Energetics of syntrophic cooperation in methanogenic degradation // Microbiol. Mol. Biol. Rev. – 1997. – Vol. 61. – P. 262–280.

9. Svetlitshnyi V., Rainey F., Wiegel J. Thermosyntropha lipolytica gen. nov., sp. nov., a lipolytic, anaerobic, alkalitolerant, thermophilic bacterium utilizing short and long chain fatty acids in syntrophic coculture with a methanogenic archaeum // Int. J. Syst. Bacteriol. – 1996. – Vol. 46. – P. 1131–1137.

Объектом исследования является термофильная анаэробная бактерия Thermosyntropha lipolytica, которая была выделена из щелочного озера Богория в Кении [9]. Этот относящийся к порядку Clostridiales микроорганизм растет в широком диапазоне температур от 52 до 70 °С при щелочных значения pH (7,15–9,5). В чистой культуре эта бактерия может расти на различных белковых субстратах (дрожжевой экстракт, триптон, мясной экстракт и др.), а также кротонате [9]. Основным продуктом сбраживания этих субстратов является ацетат. Слабый рост наблюдался также на пирувате, рибозе и ксилозе [9]. Особенностью T. lypolitica является способность расщеплять триглицериды (напр. растительного масла) и утилизировать жирные кислоты при росте в синтрофном симбиотическом сообществе с метаногенной археей (род Methanobacterium). В природе синтрофный метаболизм является важной промежуточной стадией в анаэробной конверсии биополимеров, таких как полисахариды, белки и липиды до углекислого газа и метана [8]. В реакциях метаногенеза архея использует водород и поддерживает его концентрацию на очень низком уровне, делающим сбраживание жирных кислот энергетически выгодным для T. lipolytica [9]. Синтрофный рост на липидах обеспечивается за счет липаз, секретируемых из клетки в окружающую среду [7]. При росте в отсутствии синтрофного партнера липазы также синтезируются и секретируются из клетки, однако в этих условиях T. lipolytica не способна использовать жирные кислоты и, следовательно, расти на липидах.

Способность микроорганизма использовать в качестве субстратов для роста сложные полимерные субстраты (белки, липиды, полисахариды и др.), которые не могут транспортироваться в клетку без предварительного расщепления, определяется наличием у него соответствующих гидролитических ферментов, секретируемых из клетки в окружающую среду. Идентифицировать такие ферменты можно в результате выделения, очистки и биохимической характеристики «внеклеточных» белков с последующим определением N-концевой аминокислотной последовательности белка и кодирующего его гена. Однако, помимо сложности и трудоемкости этих операций, немаловажным является тот факт, что далеко не все ферментативные активности, закодированные в геноме, экспрессируются при лабораторном культивировании микроорганизма, и подавляющее большинство их остается неизвестным исследователям. В последнее десятилетие в мировой практике расширилось применение нового подхода к поиску ферментов – определение полной геномной последовательности микроорганизма, позволяющее идентифицировать не какой-то один, а большую часть его ферментов (в оптимальном варианте – все) в результате анализа нуклеотидной последовательности. Ферменты, кодируемые идентифицированными генами, могут быть затем клонированы и экспрессированы в стандартных бактериях-продуцентах, таких как Escherichia coli. Таким образом, анализ геномных данных позволяет предсказать пути метаболизма микроорганизма и потенциальные субстраты для его роста, неизвестные из результатов его микробиологической характеристики в лабораторных условиях.

Цель исследования: идентифицировать в результате расшифровки геномной последовательности и охарактеризовать биоинформационными методами секретируемые гидролитические ферменты, кодируемые геномом T. lipolytica.

Материалы и методы исследования

Штамм T. lipolytica был выделен В.А. Светличным из щелочного озера Богория в Кении [9] и предоставлен нам для проведения данной работы. Нуклеотидная последовательность генома этой бактерии была определена нами методом пиросеквенирования на геномном анализаторе GS FLX [1]. Поиск открытых рамок считывания, способных кодировать белки, осуществляли с помощью программы GeneMark [4]. Для предсказания функций белков соответствующие аминокислотные последовательности сравнивали с базой данных NCBI с помощью BLASTP. Анализ аминокислотных последовательностей белков с целью идентификации N-концевых сигнальных последовательностей проводили с помощью программы SignalP v. 3.0 для грамположительных бактерий [3].

Результаты исследования и их обсуждение

Поиск гомологов белковых продуктов, предсказанных открытых рамок считывания, кодируемых в геномных последовательностях T. lipolytica по базе данных NCBI позволил идентифицировать гидролитические ферменты различных классов. Для изучения путей метаболизма T. lipolytica и возможности использования этой бактерией различных полимерных субстратов интерес представляют ферменты, секретируемые из клетки в окружающую среду. Для поиска таких ферментов с использованием программы SignalP 3.0 был проведен анализ того, содержат ли аминокислотные последовательности кодируемых белков N-концевые сигнальные последовательности, необходимые для секреции из клетки. Список гидролитических ферментов, в которых были идентифицированы такие сигнальные последовательности, приведен в таблице.

Наибольшую долю среди потенциально секретируемых гидролаз составляют протеолитические ферменты различных типов, что согласуется с возможностью роста T. lipolytica на белковых субстратах. Отметим, что не все пептидазы, содержащие сигнальные пептиды, обязательно участвуют в деградации присутствующих в среде белков, некоторые из них могут обеспечивать процессинг собственных белков клетки.

В гидролизе внеклеточных белков, вероятно, ключевую роль играет продукт гена 1588, Tlip_1588. Этот фермент является сериновой протеазой семейства S8/S53, аналогом субтилизина. Его гомологи кодируются в геномах многих протеолитических термофильных бактерий и архей (напр. пиролизин в Pyrococcus furiosus DSM3638), некоторые их них функционально охарактеризованы. Ближайшие гомологи Tlip_1588 найдены в геномах родственных T. lipolytica термофильных фирмикут родов Thermaerobacter, Thermincola и Tepidanaerobacter. Аминокислотная последовательность протеазы Tlip_1588 содержит три копии SLH домена (S-layer domain, pfam00395) в N-концевой области и каталитический домен первого субсемейства пептидаз семейства S8 (Peptidase S8 family domain, subfamily 1). Многие функционально охарактеризованные гомологи Tlip_1588 активны при высоких температурах в присутствии денатурирующих агентов [2] и рассматриваются в качестве перспективных ферментов для биотехнологического применения.

Важную роль в гидролизе белковых субстратов вне клетки может также играть Tlip_1807. Это сериновая протеаза, относящаяся к трипсиноподобным ферментам. Она содержит С-концевой PDZ домен, вовлеченный в белок-белковые взаимодействия и обеспечивающий распознавание субстрата. Аналогичную доменную структуру («трипсиновый» домен и PZD домен) имеет трипсиноподобная протеаза Tlip_2148.

Гидролитические ферменты T. lipolytica, содержащие N-концевые сигнальные последовательности

Функции остальных протеаз, последовательности которых содержат сигнальные пептиды, либо неясны, либо связаны с клеточным метаболизмом. Так, Tlip_0069 относится к С-концевым пептидазам, которые участвуют в деградации некорректно синтезированных белков и защите от теплового и осмотического стресса. Tlip_1204 – карбоксипептидаза семейства М14, гомологичные ей ферменты участвуют в процессах споруляции. Tlip_1317 – сингнальная пептидаза, обеспечивающая процессинг сигнальных пептидов. Tlip_2037 – металлопротеаза семейства М50, представители которого также принимают участие в споруляции.

Внеклеточный гидролиз липидов по всей вероятности обеспечивается двумя липазами, кодируемыми генами Tlip_0788 и Tlip_1200. Ранее из T. lipolytica были выделены и функционально охарактеризованы две липазы, проявлявшие максимум активности при температуре около 96 °С и рН 9,5 [7], однако соответствующие гены не были идентифицированы. Недавно мы клонировали, экспрессировали в E. coli и функционально охарактеризовали рекомбинантную липазу, являющуюся продуктом гена Tlip_0788 [1]. Было установлено, что эта липаза способна осуществлять гидролиз триацилглицеридов, в том числе растительных масел, на которых T. lipolytica способна расти в ассоциации с метаногенными археями.

Лишь три «внеклеточных» фермента могут принимать участие в процессах утилизации полисахаридов. Это гликозил-гидролаза семейства GH18, включающего хитиназы II типа [6], и две полисахарид деацетилазы, возможно, обладающие хитин-деацетилазной активностью. Возможность роста T. lipolytica на хитине не была исследована, однако известно, что этот полимер в больших количествах имеется в содовых озерах, являясь компонентом панциря обитающих в них креветок рода Artemia [5]. Отсутствие других секретируемых гликозил-гидролаз согласуется с неспособностью T. lipolytica расти на полисахаридных субстратах [9].

Выводы

Геном термоалкалофильной бактерии T. lipolytica кодирует набор гидролитических ферментов, которые могут секретироваться из клетки в окружающую среду. Идентифицированные протеазы различных типов и липазы обеспечивают использование T. lipolytica белковых субстратов и липидов соответственно. Идентифицированные гидролитические ферменты, активные при высокой температуре в щелочных условиях, перспективны для применения в промышленной биотехнологии.

Работа была выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 – 2013 годы, государственный контракт П479).

Рецензенты:

Бонч-Осмоловская Е.А., д.б.н., зам. директора по научной работе ФГБУН Института микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, г. Москва;

Замчук Л.А., д.б.н., ведущий научный сотрудник ФГБУН Центра «Биоинженерия» Российской академии наук, г. Москва.

Работа поступила в редакцию 07.11.2012.

Библиографическая ссылка