Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Туровская М.В. 1 Туровский Е.А. 1 Зинченко В.П. 1

---

1 Институт биофизики клетки РАН, Пущино

В работе показано, что активация NMDA-рецепторов, с последующими кратковременными эпизодами гипоксии, способна приводить к появлению спонтанного транзиторного увеличения концентрации цитозольного кальция (s[Ca2+]i) в период реоксигенации, амплитуда которого может возрастать при последующих эпизодах гипоксии, что является признаком постгипоксической гипервозбудимости нейронов. Генерация s[Ca2+]i никогда не происходит во время кратковременных эпизодов гипоксии без предварительной активации NMDA-рецепторов селективным агонистом, либо в отсутствие эпизодов гипоксии при активации NMDA-рецепторов. Постгипоксический Са2+ импульс наблюдается также в бескальциевой среде, но с меньшей амплитудой, что свидетельствует о минорной роли входа кальция снаружи в механизме генерации s[Ca2+]i. Ингибитор SERCA – тапсигаргин в концентрациях, вызывающих опустошение кальциевых запасов эндоплазматического ретикулума, предотвращает появление s[Ca2+]i во всех нейронах. А использование малых концентраций тапсигаргина (100нМ) приводит к увеличению амплитуды s[Ca2+]i, что является подтверждением ведущей роли внутриклеточных запасов Са2+ в генерации s[Ca2+]i. Ингибиторы фосфолипазы С препятствуют появлению признаков постгипоксической гипервозбудимости. Ингибитор рианодинового рецептора – рианодин ‒ не влияет на появление и нарастание амплитуды s[Ca2+]i. Таким образом, в механизме формирования постгипоксической гипервозбудимости нейронов гиппокампа ведущую роль играет мобилизация кальция при активации IP3-рецептора эндоплазматического ретикулума.

Статья в формате PDF

745 KB

гипоксия

реоксигенация

гипервозбудимость

Са2+

NMDA-рецептор

IP3-рецептор

1. Banker G.A., Maxwell Cowan W. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. // Brain Res. 1977. Vol. 126, no. 3. pp. 397–425.

2. Belousov A.B., Godfraind J. M., Krnjevic K. Internal Ca2+ stores involved in anoxic responses of rat hippocampal neurons. // J. Physiol. 1995. Vol. 486, no. 3. pp. 547–556.

3. Berridge M.J. Capacitative calcium entry. // Biochem. J. 1995. Vol. 312, no. 1. pp. 1–11.

4. Bleasdale J.E., Thakur N.R., Gremban R.S., Bundy G.L., Fitzpatrick F.A., Smith R.J, Bunting S. Selective inhibition of receptor-coupled phospholipase C-dependent processes in human platelets and polymorphonuclear neutrophils // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1990. Vol. 255, no. 2. pp. 756–768.

5. Fan Y., Deng P., Wang Y.C., Lu H.C., Xu Z.C., Schulz P.E. Transient cerebral ischemia increases CA1 pyramidal neuron excitability. // Exper. Neurology. 2008. Vol. 212, no. 2. pp. 415–421.

6. Friedman L. K. A role for neuroprotection and sustained adaptation. / Calcium. // Mol. Intervations. 2006. Vol. 6, no. 6. pp. 315–329.

7. Godukhin O., Savin A., Kalemenev S., Levin S. Neuronal hyperexcitability induced by repeated brief episodes of hypoxia in rat hippocampal slices: involvement of ionotropic glutamate receptors and L-type Ca2+ channels. // Neuropharmacology. 2002. Vol. 42. pp. 459–466.

8. Levin S. G., Shamsutdinova A. A., Godukhin O. V. Apamin, a selective blocker of SKCa channels, inhibits posthypoxic hyperexcitability but does not affect rapid hypoxic preconditioning in hippocampal CA1 pyramidal neurons in vitro. // Neurosci. Lett. 2010. Vol. 484 no. 1. pp. 35–38.

9. Semenov D.G., Belyakov A.V., Samoilov M.O. Moderate hypobaric hypoxia modifies Ca2+-mediated glutamatergic signal transduction in rat cerebral cortex. // Neuroscience and Behavioral Physiology. 2002. Vol. 40, no. 9. pp. 1012–16.

10. Turovskaya M.V., Turovsky E.A., Zinchenko V.P., Levin S.G., Shamsutdinova A.A., Godukhin O.V. Repeated brief episodes of hypoxia modulate the calcium responses of ionotropic glutamate receptors in hippocampal neurons // Neurosci. Lett. 2011. Vol. 496, no.1. pp. 11–14.

Известно, что кратковременные эпизоды гипоксии защищают нейроны от гибели при глобальной гипоксии и ишемии. При этом кратковременные эпизоды гипоксии подавляют увеличение концентрации Са2+ в цитозоле ([Ca2+]i), вызванное последующей глобальной ишемией [9]. Однако, наряду с защитным эффектом, кратковременные эпизоды гипоксии часто вызывают симптомы постгипоксической гипервозбудимости, которая, как известно, является фактором, приводящим к гибели клеток [10].

Увеличение концентрации внутриклеточного кальция при действии глутамата может вызывать широкий спектр реакций нейронов, начиная с нормальной синаптической нейропластичности и регуляции возбудимости нервных клеток до формирования нейротоксических эффектов, приводящих к апоптозу. Продолжительный вход Са2+ в цитозоль через активированные глутаматом рецепторы-каналы и потенциал-управляемые кальциевые каналы представляет собой ключевой фактор гибели нейронов при гипоксии и ишемии [6].

Цель данного исследования состоит в определении механизма формирования постгипоксической гипервозбудимости нейронов гиппокампа, а также роли внутриклеточного кальциевого депо в формировании постгипоксического спонтанного кальциевого импульса (s[Ca2+]i).

Материалы и методы исследования

В экспериментах использовали смешанную нейроглиальную культуру клеток гиппокампа крысы, выделенную из мозга новорожденных (2–4 дня) крыс породы Spraque Dawley в соответствии с общепринятой методикой [1]. Исследовали влияние кратковременных эпизодов гипоксии на амплитуду кальциевого ответа нейронов гиппокампа при аппликации агониста NMDA-рецепторов – N-methyl-d-aspartate в безмагниевой среде. Концентрацию цитозольного кальция измеряли с помощью флуоресцентного зонда Fura-2. Уровень цитозольного кальция в клетках, нагруженных кальциевым зондом, регистрировали с помощью системы анализа изображений «Cell observer» (Carl Zeiss, Германия), на базе моторизованного микроскопа Axiovert 200M. В эксперименте использовали культуру гиппокампа 8-10 DIV. Измерения проводили при температуре 28 °С. Для подачи веществ использовали систему, позволяющую производить добавки агонистов и антагонистов рецепторов при полной смене среды. Для создания гипоксии в ячейку с клетками подавали среду (солевой раствор Хенкса с 20 мМ HEPES), из которой предварительно в течение 20 минут вытеснялся кислород с помощью продувки аргоном, при этом воздушная часть ячейки также была заполнена аргоном.

Эксперимент состоял из 3-кратковременных эпизодов гипоксии по 3 минуты, каждый из которых сменялся 10-минутной реоксигенацией. Аппликация NMDA производилась перед первым эпизодом гипоксии (контроль) и после каждого из трех эпизодов гипоксии-реоксигенации. Время аппликации агонистов составляло 30 секунд с последующей отмывкой агониста 10 мл среды и реоксигенацией в течение 10 минут.

Для построения графиков и статистической обработки использовали программу OriginPro 8.0. В случае кратковременного (транзитного) сигнала амплитуду измеряли по максимальному значению флуоресценции за период аппликации вещества. Ошибка среднего при измерении амплитуд составляла 0,04. Исходный уровень сигнала в клетках обычно составлял 0,23 ± 0,07 (здесь и далее среднее значение ± стандартное отклонение).

Результаты исследования
и их обсуждение

Изменение [Ca2+]i, вызываемое активацией NMDA-рецепторов и кратковременной гипоксией.

Кратковременная аппликация агониста NMDA-рецепторов – N-methyl-d-aspartate в концентрации 10 мкМ в безмагниевой среде вызывает резкое увеличение [Ca2+]i в нейронах гиппокампа. После отмывки NMDA клетки быстро восстанавливают базальный уровень Са2+ в цитозоле. Амплитуды кальциевых ответов (АКО) индивидуальных нейронов различаются, но строго повторяются в каждой клетке при повторных кратковременных добавках NMDA. Эпизоды гипоксии вызывают незначительное увеличение [Ca2+]i в 45 ± 08 % нейронов гиппокампа (не показано). Амплитуда индуцированного гипоксией увеличения Са2+ в цитозоле составила в среднем 0,03 ± 0,01 относительных единиц флуоресценции Fura-2. Возвращение флуоресценции Fura-2
к исходному уровню происходит у всех прореагировавших на гипоксию нейронов в течение 2 минут реоксигенации. Кратковременные эпизоды гипоксии вызывают прогрессирующее уменьшение АКО нейронов гиппокампа на NMDA (рис. 1). Кроме того, после активации NMDA-рецепторов и кратковременных эпизодов гипоксии во время каждого периода реоксигенации наблюдается спонтанное (синхронное) транзитное увеличение Са2+ в цитозоле (s[Ca2+]i)
у 50 % нейронов (см. рис. 1). Подобный эффект никогда не наблюдался во время кратковременных периодов гипоксии без добавления NMDA, а также при активации NMDA-рецепторов без создания условий гипоксии. Амплитуда s[Ca2+]i может увеличиваться от первого эпизода гипоксии к третьему эпизоду, что, вероятно, является симптомом постгипоксической гипервозбудимости нейронов гиппокампа, которое также наблюдается в нейронах срезов гиппокампа после кратковременных эпизодов гипоксии [7].

Рис. 1. Изменение [Ca2+]i в нейронах гиппокампа в ответ на аппликацию
NMDA 10 мкМ (1), при действии кратковременных эпизодов гипоксии (2)
и во время периода реоксигенации (3). Аппликация NMDA производилась в среде без магния. Представлен усредненный ответ 52 нейронов. Здесь и далее звездочкой *
отмечена генерация s[Ca2+]i во время периода реоксигенации

Постгипоксический спонтанный Са2+ импульс сохраняется в безкальциевой среде и ингибируется тапсигаргином.

Постгипоксический спонтанный Са2+-импульс наблюдается также во время реоксигенации в безкальциевой среде, при этом амплитуда s[Ca2+]i уменьшается в 2-3 раза (не показано). Как известно, для генерации Са2+ сигналов клетки используют наружный и запасенный во внутриклеточных депо кальций [3]. Эндоплазматический ретикулум (ЭПР) представляет собой основное внутриклеточное депо Са2+ [4]. Появление s[Ca2+]i в нейронах гиппокампа во время реоксигенации в безкальциевой среде свидетельствует об участии внутриклеточного кальциевого пула в механизме постгипоксической гипервозбудимости. Однако уменьшение амплитуды s[Ca2+]i говорит также о существенном вкладе входа кальция снаружи в формирование Са2+ импульса.

Для исследования регуляторной роли ЭПР в генерации постгипоксического кальциевого импульса клетки перед третьей аппликацией NMDA обрабатывали тапсигаргином в различных концентрациях. В концентрации 1мкМ тапсигаргин вызывает быстрое опустошение ЭПР, что сопровождается временным увеличением Са2+ в цитозоле и откачкой его во внеклеточную среду. Такая обработка клеток тапсигаргином не изменяла Са2+ ответ на NMDA, но предотвращала появление s[Ca2+]i. в период реоксигенации (рис. 2).

Рис. 2. Действие ингибитора SERCA – тапсигаргина на изменение [Ca2+]i в нейронах гиппокампа в ответ на аппликацию NMDA 10 мкМ (1) во время кратковременных эпизодов гипоксии (2) и периодов реоксигенации (3). Аппликация тапсигаргина (ТГ) в концентрации 1 мкМ подавляет появление s[Ca2+]i в период реоксигенации

Рианодин не влияет на генерацию s[Ca2+]i.

Преинкубирование нейронов гиппокампа с рианодином в течение 10 минут, в концентрации 1 мкМ, после второго периода реоксигенации перед третьей аппликацией NMDA не влияет на возникновение s[Ca2+]i
в период реоксигенации. На рис. 3 показано, что во время двух первых периодов реоксигенации в нейронах наблюдается появление s[Ca2+]i, а после преинкубирования клеток с рианодином амплитуда s[Ca2+]i
даже несколько увеличивается, но в пределах изменений в контроле. Таким образом, рианодиновый рецептор не участвует в формировании постгипоксической гипервозбудимости нейронов гиппокампа.

Рис. 3. Действие ингибитора рианодинового рецептора – рианодина ‒ на изменение [Ca2+]i в нейронах гиппокампа в ответ на аппликацию NMDA 10мкМ (1) во время кратковременных эпизодов гипоксии (2) и периодов реоксигенации (3). Аппликация рианодина (Rya) в концентрации
1 мкМ не влияет на появление s[Ca2+]i в период реоксигенации

Постгипоксический кальциевый импульс подавляется ингибитором фосфолипазы С (PLC).

Для исследования вклада IP3-рецепторов в высвобождение Са2+ из ЭПР при генерации s[Ca2+]i использовали один из ингибиторов PLC – U73122 [4]. Концентрации U73122, используемые в данном исследовании, не вызывают проявления неспецифических эффектов. На рис. 4 показано, что преинкубирование нейронов гиппокампа в течение 10 мин с 1–5 мкМ U73122 предотвращает появление s[Ca2+]i в период реоксигенации после активации NMDA-рецепторов и действия кратковременного эпизода гипоксии во всех нейронах. Таким образом, появление s[Ca2+]i в сетевых нейронах гиппокампа в культуре, в период реоксигенации, после активации NMDA-рецепторов и кратковременных эпизодов гипоксии не зависит от активации рианодинового рецептора, а включает высвобождение Са2+ через IP3-рецептор из тапсигаргин-чувствительного пула.

Рис. 4. Действие ингибитора фосфолипазы С – U73122 на изменение [Ca2+]i в нейронах гиппокампа в ответ на аппликацию NMDA 10мкМ (1) во время кратковременных эпизодов гипоксии (2) и периодов реоксигенации (3). Аппликация U73122 в концентрации 1 мкМ подавляет появление s[Ca2+]i в период реоксигенации

Известно, что кратковременные эпизоды аноксии (2–3 минуты) сами могут вызывать Са2+-ответы в нейронах гиппокампа крысы за счет выброса кальция в цитозоль из IP3-чувствительных внутриклеточных депо [2]. Как видно из рис. 4, ингибирование PLC не только препятствует появлению постгипоксического Са2+ импульса, но также подавляет повышение Са2+ в период гипоксии.

Считается, что в условиях гипоксии или кратковременной ишемии головного мозга возбудимость пирамидных нейронов СА1 области гиппокампа возрастает вследствие изменения активности Са2+-зависимых К+-каналов [8], а также активации неселективных катионных каналов, активируемых гиперполяризацией мембраны [5].

Заключение

В настоящей работе показано, что эффект постгипоксической гипервозбудимости возникает в сетевых нейронах гиппокампа в период реоксигенации после кратковременных эпизодов гипоксии и проявляется в возникновении спонтанного, синхронного постгипоксического Са2+-импульса, который происходит за счет активации PLC – IP3 пути мобилизации Са2+ из тапсигаргин-чувствительного пула ЭПР.

Рецензенты:

Асланиди К.Б., д.ф.-м.н., лаборатория регуляции внутриклеточных процессов Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН (ИТЭБ РАН), г. Пущино;

Мошков Д.А., д.б.н., профессор лаборатории ультраструктуры нейрона Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН (ИТЭБ РАН), г. Пущино.

Работа поступила в редакцию 09.10.2012.

Библиографическая ссылка