Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Журавлева З.Н. 1 Журавлев Г.И. 2 Муганцева Е.А. 1

---

1 ФГБУН «Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН»

2 ФГБУН «Институт биофизики клетки РАН»

С помощью световой и электронной микроскопии проведено исследование роли астроцитарных глиальных клеток в развитии и функционировании интраокулярных нейротрансплантатов, характеризующихся нормальной или эпилептиформной активностью. Для трансплантации в переднюю камеру глаза использовали эмбриональные закладки септума, выделенные из мозга 17-дневных плодов крыс Вистар; реципиентами служили взрослые самцы той же породы. Электрофизиологическое тестирование типа активности и микроскопическое изучение трансплантатов проводили через 3 месяца после операции. При визуальной микроскопической оценке не обнаружено различий между двумя экспериментальными группами в количестве синаптических контактов и соотношении нейронов и глиальных клеток. Морфометрический анализ показал, что размеры активных зон синапсов также не различаются. Вместе с тем, в трансплантатах с патологической активностью было обнаружено значительное уменьшение степени окружения синаптических окончаний астроцитарными отростками. Таким образом, при развитии трансплантированной нервной ткани в условиях изоляции от мозга происходит нарушение глиально-синаптических взаимодействий, что приводит к генерации эпилептиформной активности.

Статья в формате PDF

391 KB

интраокулярная нейротрансплантация

септум

эпилептиформная активность

ультраструктура

трехчастный синапс

перисинаптические астроцитарные отростки

1. Журавлева З.Н. Гиппокамп и нейротрансплантация // Журн. высш. нервн. деят. – 2004. – Т. 54, № 2. – С. 149–162.

2. Журавлева З.Н., Косицын Н.С. Морфофункциональные взаимодействия периферических нервных волокон радужки с нейронами, развивающимися в передней камере глаза крысы // Морфология. – 2009. – Т. 135, № 3. – С. 41–46.

3. Сахаров Д.А. Множественность нейротрансмиттеров: функциональное значение // Ж. эвол. биохим. физиол. – 1990. – Т. 26, №. 5. – С. 733–740.

4. Agnati L.F., Guidolin D., Guescini M., Genedani S., Fuxe K. Understanding wiring and volume transmission // Brain Res. Rev. – 2010. – Vol. 64. – P. 137–159.

5. Araque A., Parpura V., Sanzgiri R.P., Haydon P.G. Tripartite synapses: glia, the unacknowledged partner // Trends Neurosci. – 1999. – Vol. 22. – P. 208–215.

6. Bjorklund A., Lindvall O. Cell replacement therapies for central nervous system disorders // Nature Neurosci. – 2000. – Vol. 3. – P. 537–544.

7. Bragin A.G., Vinogradova O.S. Comparison of neuronal activity in septal and hippocampal grafts developing in the anterior eye chamber of the rat // Brain Res. – 1983. – Vol. 312, № 2. – P. 279–286.

8. Genoud C., Quairiaux C., Steiner P., Hirling H., Welker E., Knott G. Plasticity of astrocytic coverage and glutamate transporter expression in adult mouse cortex // Plos Biology. – 2006. – Vol. 4, № 11. – P. 2057–2064.

9. Eulenburg V., Gomeza J. Neurotransmitter transporters expressed in glial cells as regulators of synapse function // Brain Res Rev. – 2010. – Vol. 63, № 1–2. – P. 103–112.

10. Oberheim N.A., Tian G-F., Han X., Peng W., Takano T., Ransom B., Nedergaard M. Loss of astrocytic domain organization in the epileptic brain // J. Neurosci. – 2008. – Vol. 28, №13. – P. 3264–3276.

11. Racca C., Stephenson F. A., Streit P., Roberts J.D.B., Somogyi P. NMDA receptor content of synapses in stratum radiatum of the hippocampal CA1 area // J. Neurosci. – 2000. – Vol. 20, № 7. – P. 2512–2522.

12. Seifert G., Carmignoto G., Steinhauser C. Astrocyte dysfunction in epilepsy // Brain Res. Rev. – 2010. – Vol. 63. – P. 212–221.

13. Witcher M.R., Park Y.D., Lee M.R., Sharma S., Harris K.M., Kirov S.A. Three-dimensional relationships between perisynaptic astroglia and human hippocampal synapses // Glia. – 2010. – Vol. 58, № 5. – P. 572–587.

Нейротрансплантация фетальной и эмбриональной ткани используется в медицине и экспериментальной нейробиологии для восстановления поврежденных нейронов и нарушенных функций мозга [6]. В трансплантированной ткани дифференцируются типичные для донорской структуры нервные и глиальные клетки, отростки которых формируют сложный нейропиль внутри трансплантата и простираются в мозг реципиента. В организацию синаптических связей между нейронами вовлекаются отростки астроцитарных глиальных клеток. Они окружают синаптические комплексы и участвуют в физиологических процессах. На этом основании предложена концепция трехчастного синапса, в состав которого включают не только пре- и постсинаптические компоненты, но и окружающие их астроцитарные отростки [5]. Вместе с тем, вокруг трансплантированного материала может формироваться глиомезодермальный рубец, препятствующий реципрокным взаимодействиям между трансплантатом и мозгом. В этих условиях трансплантированные нейроны образуют функциональные синаптические связи друг с другом и представляют собой источник патологической активности. Удобной экспериментальной моделью для изучения особенностей развития и функционирования изолированной нервной ткани являются интраокулярные трансплантаты. Передняя камера глаза (ПКГ), как и мозг, обладает иммунной привилегированностью, а химический состав ее содержимого аналогичен цереброспинальной жидкости. Питание и иннервацию имплантированная ткань получает из радужной оболочки. Несмотря на дефицит нормальных афферентных источников, в трансплантатах формируется нейропиль, по плотности синаптических контактов не уступающий мозгу in situ
[1, 2]. Большинство этих синапсов принадлежит собственным нервным элементам, что приводит к формированию в части трансплантатов замкнутых морфофункциональных сетей, в которых группы нейронов отвечают на импульсы синхронно [7]. Целью настоящей работы было сравнительное морфометрическое изучение ультраструктурных параметров синаптических окончаний в комплексе с перисинаптическими астроцитарными отростками в трансплантатах септум, характеризующихся нормальной или эпилептиформной активностью.

Материал и методы исследования

Работа выполнена на крысах породы Вистар с соблюдением рекомендаций по гуманному обращению. Все процедуры с животными проводили под нембуталовым или эфирным наркозом. В качестве донорской структуры для трансплантации использовали септальную область мозга, выделенную из плодов крыс 17 дней гестации. Имплантацию в ПКГ производили крысам-самцам путем введения донорской эмбриональной ткани специальным шприцем через разрез в роговице. Через 3 мес. после операции на основании электрофизиологического тестирования трансплантаты разделили на 2 группы: с нормальной активностью (n = 3) и с эпилептиформной активностью (n = 3). В контрольной группе на одиночный электрический стимул нейроны отвечали одиночными разрядами, а в экспериментальной группе – множественными популяционными спайками. Затем трансплантаты фиксировали для гистологического и ультраструктурного анализа. Фиксацию производили 2,5 %-м раствором глутарового альдегида и дофиксацией 1 %-м раствором четырехокиси осмия. Детально процедура трансплантации и подготовки материала описана ранее [1, 2]. Ультраструктурное исследование проводили на электронном микроскопе JEOL JEM-100B. Для морфометрического анализа использовали по 100 микроизображений возбуждающих синаптических окончаний из обеих экспериментальных групп. Изображения отцифровывали, сохраняли в виде компьютерных файлов и анализировали с помощью программы UTHSCSA Image Tool. Сравнение производили по следующим параметрам: размер активной зоны синапсов (по длине постсинаптического уплотнения), периметр пресинаптической терминали (Т), длина астроцитарного отростка, находящегося в контакте с терминалью (А). Степень развития глиального окружения синапса (перисинаптическая глия) вычисляли как отношение параметров А и Т. Схематическое изображение возбуждающего синапса приведено на рис. 1. Достоверность различий определяли по критерию Стьюдента. Статистически значимыми считались различия при p ≤ 0,05.

Рис. 1. Схема возбуждающего синаптического окончания в комплексе с перисинаптическим астроцитом (трехчастный синапс):
1 – пресинаптическая терминаль с синаптическими везикулами;
2 – постсинаптический дендритный шипик;
3 ‒ синаптическая щель;
4 – постсинаптическое уплотнение;
5 – ядро астроцита; 6 – перисинаптический астроцитарный отросток

Результаты исследования
и их обсуждение

Трансплантаты септума, развивающиеся в ПКГ в течение 3-х месяцев, представляли собой сферические или овальные образования размером 1–2 мм, располагающиеся между роговицей и радужной оболочкой. Поверхность трансплантатов была покрыта сплошной глиальной оболочкой, которая в некоторых участках была многорядной. В то же время соотношение нервных и глиальных клеток внутри трансплантатов визуально соответствовало нативной цитоархитектонике септальной области мозга. Нейроны располагались диффузно, и большинство из них имело типичную для септума мультиполярную форму (рис. 2).

Электронно-микроскопическое изучение трансплантированной ткани показало, что нейроны представляют собой зрелые дифференцированные элементы, а их дендриты и аксоны активно формируют синаптические взаимодействия. Принципиальных структурных различий как между самими нейронами, так и их многочисленными синаптическими связями в трансплантатах с нормальным или патологическим типом функциональной активности микроскопически не было обнаружено. Возбуждающие синаптические контакты, имеющие асимметричные активные зоны, преимущественно локализовались на дендритных шипиках, а тормозные контакты –
на телах нейронов и стволах дендритов. Нейропильные области трансплантатов представляли собой сложное переплетение нейрональных и глиальных отростков. Астроцитарные отростки, которые располагались вблизи синаптических окончаний, так называемые перисинаптические глиальные отростки, имели нерегулярную форму и окружали синаптические профили по периметру в разной степени. В некоторых синапсах тонкие астроцитарные отростки находились в непосредственной близости от синаптической щели. Главной функцией астроцитарных отростков, окружающих синаптические окончания, является поддержание метаболического, ионного и трансмиттерного гомеостаза вблизи синаптического контакта. Между синапсами и перисинаптической глией существуют двунаправленные взаимодействия [9, 12].

Рис. 2. Общий вид интраокулярного трансплантата септальной области мозга,
развивающегося в течение 3-х месяцев:
1 – роговица; 2 – трансплантат; 3 – радужная оболочка. Масштаб – 100 мкм

Для морфометрического исследования были отобраны синаптические контакты, отвечающие структурным характеристикам возбуждающих синапсов и имеющие выраженные постсинаптические уплотнения (ПСУ). Известно, что размер постсинаптической специализации положительно коррелирует с количеством в них рецепторов и отражает силу синаптической связи [11]. В нашем материале в обеих экспериментальных группах размеры ПСУ сильно варьировались (от 0,1 до 1,28 мкм), что свидетельствует о значительной разнице функциональной силы индивидуальных синапсов. При этом в каждом из них длина ПСУ коррелировала с размером (периметр и площадь) пресинаптического бутона, содержащего синаптические везикулы с нейромедиатором. Однако при сравнении средних значений в трансплантатах с эпилептиформной и нормальной активностью эти параметры достоверно не различались. Не наблюдалось разницы также и по средним значениям площади постсинаптических дендритных шипиков (таблица). Это является показателем того, что каждый синаптический контакт работает в своем индивидуальном режиме и его сила не определяет общую гипервозбудимость нейронов в эпилептическом фокусе. Аналогичные результаты были получены при изучении морфофункциональной корреляции в синапсах неокортекса мышей. Так, в поле бареллов при сенсорной стимуляции вибрисс общая протяженность возбуждающих активных зон не изменялась, хотя происходило значительное увеличение экспрессии транспортеров глутамата [8].

Вместе с тем, наши морфометрические данные показали, что степень астроцитарного окружения пресинаптических бутонов в трансплантатах с эпилептиформной активностью в 2 раза ниже, чем в трансплантатах с нормальной активностью (см. таблицу). Известно, что терминальные разветвления отростков астроцитов очень пластичны и быстро реагируют на изменение нейрональной активности. Контролируя ионный баланс, они очищают перисинаптические пространства от ионов калия, которые в большом количестве освобождаются во время синаптической активности [12]. С помощью мембранных транспортеров они захватывают излишки нейромедиатора из синаптической щели, ограничивая его дальнейшее распространение. Возбуждающий нейромедиатор глутамат в астроцитах деактивируется в глутамин и доставляется обратно в нейроны [9, 12]. Обнаруженное нами ослабление астроцитарного барьера вокруг синапсов в трансплантатах с эпилептиформной активностью позволяет нейромедиаторам более свободно диффундировать из синаптической щели в межклеточные пространства и активировать экстрасинаптические рецепторы и соседние активные зоны. По современным представлениям межклеточные коммуникации в мозге происходят не только при взаимодействии нервных элементов посредством аксональных волокон и синаптических контактов (wiring transmission, проводная нейропередача), но и в результате передачи нейроактивных метаболитов по экстраклеточным пространствам (volum transmission, объемная нейропередача) [4]. Более того, предполагается, что при организации нейрональных ансамблей в мозге беспозвоночных животных преобладает беспроводной, несинаптический способ трансдукции сигналов [3]. Наши результаты показывают, что в эпилептизированной ткани, развивающейся в передней камере глаза, также возрастает роль объемной передачи нейроактивных веществ, что способствует синхронизации нейрональной активности.

Данные морфометрического анализа возбуждающих синапсов в трансплантатах септума с нормальной и эпилептиформной активностью, (M ± m)

Примечание. * – Достоверность различий (p ≤ 0,05) между параметрами синапсов в трансплантатах с разной функциональной активностью.

Структурные и функциональные нарушения астроцитов в эпилептическом мозге отмечают и другие исследователи. Обычно гиперактивность и синхронизацию связывают с реактивным астроглиозом, исчезновением доменной организации астроцитов и распространением возбуждающих кальциевых волн по астроцитарным сетям
[10; 12]. Однако молекулярные и клеточные основы эпилептизации чаще изучают на образцах ткани, полученных от животных с экспериментально вызванными судорогами или от больных с резистентной формой болезни после нейрохирургических операций. Морфологические изменения в такой ткани являются результатом регулярных судорожных событий и долговременной антиконвульсантной терапии. При этом нарушения в эпилептическом очаге на уровне синаптических контактов практически не исследованы. Существуют единичные данные о том, что в случаях тяжелой формы височной эпилепсии у людей параллельно с исчезновением нейронов, дендритных шипиков и синапсов разрушается и перисинаптическая глия [13]. В отличие от большинства исследований, констатирующих значительные постсудорожные дегенерационные изменения в мозге, экспериментальная модель, предложенная нами, позволяет изучать начальные эпилептогенные нарушения, происходящие на субмикроскопическом уровне.

Заключение

Микроскопическое и ультраструктурное исследование интраокулярных нейротрансплантатов септума с нормальной и эпилептиформной активностью при визуальной оценке не выявило между ними различий по нейронально-глиальному соотношению и количеству синаптических контактов. Данные морфометрического анализа показали, что размеры активных зон, являющиеся показателем функциональной силы синапсов, в двух экспериментальных группах также не различаются. Вместе с тем, в трансплантатах с патологической активностью было обнаружено значительное уменьшение степени окружения синаптических окончаний астроцитарными отростками. В свете современных представлений о синапсе как трехчастном комплексе, включающем в свой состав также и перисинаптические отростки [5], такая аномалия в организации функциональных контактов в трансплантатах с эпилептиформной активностью приводит к ухудшению обратного захвата возбуждающих нейромедиаторов, их более широкому распространению по экстраклеточным пространствам и гиперсинхронизации нейрональных ответов. Таким образом, нарушение глиально-синаптических взаимодействий, которые возникают при дифференцировке трансплантированной нервной ткани в изоляции от естественных мозговых влияний, является важным эпилептогенным фактором.

Авторы выражают благодарность А.Г. Брагину за выполнение электрофизиологического тестирования нейротрансплантатов. Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (грант № 12-04-00812).

Рецензенты:

Куликов А.В., д.б.н., зав. сектором ФГБУН «Институт теоретической и экспериментальной биофизики» РАН, г. Пущино;

Архипов В.И., д.б.н., ведущий научный сотрудник ФГБУН «Институт теоретической и экспериментальной биофизики» РАН, г. Пущино.

Работа поступила в редакцию 10.09.2012.

Библиографическая ссылка