Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

ВЛИЯНИЕ 1,6-α-D-ГЛЮКАНА ИЗ ДАЛЬНЕВОСТОЧНОЙ МИДИИ «CRENOMYTILUS GRAYANUS» (МИТИЛАНА) НА ЛИПИДНЫЙ СПЕКТР И ЦИТОКИНОВЫЙ ПРОФИЛЬ СЫВОРОТКИ КРОВИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ АТЕРОСКЛЕРОЗЕ

Турмова Е.П. 1 Маркелова Е.В. 1 Красников В.Е. 1 Бычков Е.А. 1 Лукьянов П.А. 2 Чикаловец И.В. 2 Григорюк А.А. 2
1 ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России, Владивосток
2 Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток
Оценивали влияние 1,6-α-D-глюкана из мидии «Crenomytilus grayanus» (Митилана) на цитокиновый профиль (IL-1β, IFN-γ, TNF-α, IL-10), содержание металлопротеиназы-9 (MMP-9) и липидный спектр у 30 крыс линии Вистар на 6 месяце, в моделе экспериментального атеросклероза. Митилан обладает иммуномодулирующим, ранозаживляющим, гиполипидемическим, противовоспалительным и радиопротекторным эффектами. Определение цитокинов в сыворотке крови производили методом иммуноферментного анализа с использованием наборов: Rat «R&D Diagnostics Inc.», USA. Липидный спектр крови исследовали с помощью стандартного колориметрического метода. В крови крыс с экспериментальным атеросклерозом без назначения Митилана отмечалось повышение содержания общего холестерина, β-липопротеинов, холестерина липопротеинов низкой плотности, индекса атерогенности, увеличение уровней IFN-γ, IL-1, TNF-α и IL-10. При назначении Митилана зарегистрировано снижение содержания IFN-γ, IL-1, повышение уровня IL-10 и нормализация липидного спектра крови.
атеросклероз
гиперлипидемия
цитокины
крысы
1. Амчиславский Е.И., Фрейдлин И.С. Влияние цитокинов на адгезионную и миграционную активность эндотелиальных клеток // Медицинская иммунология . – 2005. –
Т. 7. – № 2–3. – С. 109.
2. Реакция цитокиновой сети больных с критической ишемией нижних конечностей на некоторые виды лечебного воздействия / Н.В. Буркова, Ю.А. Эйнсмонт, С.П. Нохрин, С.В. Яковлев и др. // Медицинская иммунология. – 2006. –
Т. 8, № 2–3. – С. 394–395.
3. Кипрюшина Ю.О., Одинцова Н.А. Лукьянов П.А. Влияние митилана на устойчивость к ультрафиолетовому облучению личинок морских беспозвоночных и лимфоцитов человека // Биология моря. – 2010. – Т. 36, № 4. –
С. 297–302.
4. Кропотов А.В. Влияние цимифуги даурской и калужницы лесной на некоторые показатели обмена липидов и половую систему (экспериментальное исследование): автореф. дис. ... канд. мед. наук. – Владивосток, 1975. – 19 с.
5. Куликов В.А., Чиркин А.А. Особенности метаболизма липопротеинов у крыс // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2004. – № 1. – С. 26–27.
6. Лобанова Е.Г., Караман Ю.К. Взаимосвязь липидных и иммунных нарушений на различных этапах развития экспериментальной гиперлипидемии // Медицинская иммунология. – 2011. – T. 13, № 1. – С. 61–66.
7. Коррекция липидного обмена у пациентов с облитерирующим атеросклерозом сосудов нижних конечностей сульфатированным полисахаридом из бурой водоросли Fucus Evanascens / К.В. Майстровский, Т.С. Запорожец,
В.Г. Раповка, Т.Н. Звягинцева, Н.М. Шевченко // Тихоокеанский медицинский журнал. – 2010. – № 4. – С. 47–50.
8. Рагино Ю.И. Уровни липидных и нелипидных биомаркеров в крови у мужчин с коронарным атеросклерозом в Новосибирске // Российский кардиологический журнал. ‒ 2009. – № 2. – С. 31–35.
9. Санникова А.А., Чучкова Н.Н., Гайсина Э.Ш. Иммуномодулирующее действие глюкозаминилдипептида при измененном липидном обмене и атеросклерозе // Вестник уральской медицинской академической науки. – 2008. –
№ 1. – С. 64–66.
10. Биологически активные вещества из отходов переработки пищевой мидии / О.В. Черников, В.И. Молчанова, И.В. Чикаловец, П.А. Лукьянов, Г.К. Кондратьева // сб. матер. III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, (Челябинск, 11 дек. 2009 г.). – Челябинск, 2009. – С. 1–3.
11. Маркеры воспаления в процессе развития атеросклероза / А.П. Шаврин, Я.Б. Ховаева, В.А. Черешнев,
Б.В. Головской // Кардиоваскулярная терапия и профилактика – 2009. – Т. 8, № 3. – С. 13–15.
12. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for experimental and other scientific purposes. – Strasburg: Council of Europe, 1986. – 51 p.
13. Helle F., Vagnes O.B. Iversen B.M. Angiotensin II-induced calcium signaling in the afferent arteriole from rats with two-kidney, one clip hypertension // Am. J. Physiol.Renal Physiol. – 2006. V. 291. – P. 140–147.
14. Oyedemi S.O., Yakubu M.T. Afolayan A.J. Effect of aqueous extract of Leonotis leonurus (L.) R. Br. leaves in male Wistar rats // Human and Experimental Toxicology. – 2010. – № 29. – P. 377–384.

Согласно современным представлениям о патогенезе атеросклероза большое значение отводится иммуноопосредованному воспалению в артериальной стенке [2, 7, 8, 11].
Гипертензия и гиперхолестеринемия коррелируют с развитием атеросклеротического процесса [2, 7, 9, 14]. Являясь промоторными факторами, они усиливают пролиферацию гладкомышечных клеток и стимулируют образование атеросклеротических бляшек [1]. Однако нередко атеросклеротический процесс развивается у лиц с нормальным содержанием холестерина и даже при низких его концентрациях [7, 8]. Изменения реагирования эндотелия с клетками иммунной системы на уровне цитокинов являются ранним проявлениями атерогенеза [2, 8]. Цитокиновый дисбаланс влияет на образование, рост атеросклеротической бляшки и вносит свой вклад в ее дестабилизацию с дальнейшим тромбообразованием. При этом известно, что в физиологических концентрациях IL-6, IL-1β и TNF-α играют важную роль в регуляции иммунного ответа и тканевого гомеостаза, а в высоких концентрациях эти интерлейкины обладают эффектами, способствующими прогрессированию атеросклеротического процес- са [8]. TNFα и IL1-β достоверно усиливают адгезию эндотелиальных клеток, при этом IL1-β только в высоких концентрациях достоверно стимулирует миграцию эндотелиальных клеток [1].

Подтверждена связь изменений уровней провоспалительных цитокинов с разной степенью стеноза, распространенностью, локализацией поражений, нестабильностью атеросклеротических бляшек [2, 8]. Однако аспекты цитокиновой регуляции атерогенеза остаются еще до конца не выясненными и часто противоречиво трактуются разными авторами [2, 8, 11]. Экспериментальная оценка воспалительного повреждения артериальной стенки с позиций местного и системного цитокинового дисбаланса, влияющего на процессы миграции, активации и пролиферации Т-лимфоцитов, макрофагов и гладкомышечных клеток, позволит выявить и обосновать применение иммуномодулирующей терапии в регуляции иммунного воспаления при атеросклерозе.

Крысы часто используются в моделировании гиперлипидемии (ГЛ) и артериальной гипертензии (АГ) как факторов риска атеросклероза [4, 5, 6, 9, 14]. Их приобретение и содержание относительно недороги, животные просты в обращении, хорошо размножаются в неволе. Из всех экспериментальных животных у них лучше всего изучен метаболизм [5, 14]. Разработка адекватной экспериментальной модели повреждения эндотелия является необходимым шагом в целях диагностики, профилактики и лечения атеросклероза. Учитывая особенности обменных процессов крыс, способствующие формированию их резистентности к жировой нагрузке, нами применено сочетание экзогенной гиперлипидемии, угнетение обменных процессов и артериальной гипертензии для создания наиболее выраженного атеросклеротического повреждения [4, 5, 6, 9].

Митилан – полисахаридный гликогеноподобный 1,4; 1,6-α-D-глюкан, выделенный из мидии Crenomytilus grayanus, производства ТИБOX ДВО РАН. Обладает иммуномодулирующим, ранозаживляющим, гиполипидемическим, противовоспалительным, УФ- и радиопротекторным эффектами, не токсичен. Производство биогликанов из мидии является экологически безопасным процессом, не требующим дорогостоящего оборудования и материалов. Мидийный отвар, необходимый для производства Митилана является отходом производства рыбоперерабатывающей промышленности. Физико-химические и биологические свойства Митилана подробно изучены в области косметологии. Долгое время этот биоглюкан применялся в составе косметических кремов, выпускаемых рядом предприятий России. В экспериментальных исследованиях доказано, что преинкубация лимфоцитов с Митиланом способствует подавлению апоптоза клеток, существенно снижает уровень метаболитов NO [3, 10]. Препарат «Митилан» проявляет дозозависимое действие, в концентрации 10 мг/кг его противовоспалительная активность сравнима с действием нестероидного противовоспалительного препарата диклофенака (ортофена) в дозе 5 мг/кг. Митилан способен стимулировать перитонеальные макрофаги мышей, что выражается в увеличении лизосомальной активности клеток и в усилении формирования активных форм кислорода в них. Эти этапы предшествуют и сопутствуют процессу фагоцитоза макрофагами. Все это свидетельствует в пользу того, что исследуемый биогликан оказывает иммуномодулирующее воздействие на клеточное звено иммунитета [10].

Целью работы явилось: изучить влияние препарата «Митилан» на цитокиновый профиль и липидный спектр сыворотки крови крыс в модели экспериментального атеросклероза.

Материалом и методы исследования

Материалом исследования явились крысы линии Vistar – 30 голов, массой 350 г. Поставка крыс осуществлялась из вивария Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток. Опытная группа крыс – 20 голов, в течение 6 месяцев (180 суток), находились на диете с добавлением в корм холестерина, мерказолила – 1 мг/кг и витамина Д в количестве 2,5 МЕ на кг массы тела крыс (моделирование ГЛ) [4]. В целях создания АГ за 15 дней перед началом кормления животным была произведена операция: наложение лигатуры на почечную ножку правой почки нерассасывающимся шовным материалом и прошивание верхнего полюса левой почки (моделирование симптоматической реноваскулярной артериальной гипертензии), в модификации [13]. Животные опытной группы I – 10 крыс перед выведением из эксперимента получали препарат «Митилан» – per os в количестве – 10 мг, через день, в течение 1 месяца. Опытная группа II – 10 крыс не получали иммуномодулирующей терапии. Контролем являлись 10 здоровых крыс со стандартным рационом. Эвтаназию животных проводили путем декапитации под эфирным наркозом на 6 месяце эксперимента в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных 86/609 [12]. Содержание общего холестерина (ОХС); триглицеридов (ТГ); β-липопротеинов; липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП), липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) сыворотки крови исследовали с помощью стандартного колориметрического метода с использованием реагентов: «Ольвекс диагностикум» (Россия). Вычисляли индекс атерогенности (ИА) по формуле: общий холестерин – ЛПВП/ЛПВП. Определение цитокинов (TNF-α, IL-1β, IFN-γ, IL-10) и MMP-9 в сыворотке крови крыс производили методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием наборов: Rat «R&D Diagnostics Inc.», USA.

Развитие атеросклероза подтверждали с помощью метода магниторезонансной томографии (МРТ) (томограф «PharmaScan US 70/16» (Bruker, Германия)). Гистологические препараты аорты и бедренных артерий окрашивали гематоксилином/эозином и суданом-4 (метод Окамото). Для математической обработки полученных данных использовали программу StatPlus 2009. Сравнение средних значений в выборках осуществляли с помощью непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

Результаты исследования и их обсуждение

? ??????? ??????? ???? ????????? ?????? ??? ???????? ??????? ???????? ?????, ??????????? ??????????? ???????, ?? ????????????? ????????????????. ?????????????? ????????? ???????????? ????????? ????????????? ???????????? ???????, ???????? ???? ???????? ?? ?????????, ????????? ???????????? ??????, ????????? ?????????, ????????? ???????? ??????? ?????????. ???????? ??????? ????????????? ?????????? ??????????. ???????? ???? ????????????? ???????? ????????? ??????? ???? ????? ???????????.

? ???? ?? ???? ???????? ?????????? ???, ?-?????????????, ????, ??O?? ??В опытных группах крыс с помощью метода МРТ выявлено сужение просвета аорты, подвздошных и бедренных артерий, их неравномерное контрастирование. Гистологически в сосудах определялось изменение архитектоники эластических волокон, смещение ядер миоцитов на периферию, клеточная инфильтрация стенки, утолщение эндотелия, отложение в стенке жировых включений. Отмечена хорошая переносимость «Митилана» у животных. В группе крыс с применением Митилана изменения сосудов были менее выраженными.

У крыс ГЛ и АГ выявлено увеличение ОХС, β-липопротеинов, ЛПНП, ЛПOНП и ИА. Отмечена хорошая переносимость препарата Митилан у крыс. Применение иммуномодулятора способствовало достоверному снижению уровней ОХС, β-липопротеинов, ЛПНП и ИА, что подтверждает его гиполипидемические свойства [10] (табл. 1).

Таблица 1

Липидный спектр сыворотки крови крыс

Группы

ОХС ммоль/л

ТГ ммоль/л

ЛПВП ммоль/л

ЛПНП ммоль/л

ЛПОНП ммоль/л

β-липо- протеины

ИА у.е.

Опытная группа I

2,6
(2,44–4,79)

р1-р2 = 0,02

0,8 (0,8–1,4)

р1-р2 = 0,14

1,1 (1,0–1,5)

р1-р2 = 0,62

1,1 (0,7–2,1)

р1-р2 = 0,01

0,4
(0,3–0,64)

р1-р2 = 0,14

24,5 (22–37,2)

р1-р2 = 0,02

1,3 (1,3–1,6)

р1-р2 = 0,01

Опытная группа II

6,1 (5,5–7,22)

р2-р3 = 0,009

0,6 (0,5–0,9)

р2-р3 = 0,29

1,12 (1,0–2,1)

р2-р3 = 0,17

4,2 (3,8–5,4)

р2-р3 = 0,009

0,3 (0,2–0,4)

р2-р3 = 0,29

54 (46,5–69,2)

р2-р3 = 0,009

3,1 (2,7–4,4)

р2-р3 = 0,009

??????????? ??????Контрольная группа

2,2 (2,0–3,1)

р1-р3 = 0,32

0,5 (0,4–0,7)

р1-р3 = 0,02

1,5 (1,4–1,9)

р1-р3 = 0,62

0,9(0,7–1,4)

р1-р3 = 0,62

0,2 (0,2–0,3)

р1-р3 = 0,02

12 (11,2–12,7) р1-р3 = 0,01

1,1 (0,9–1,2)

р1-р3 = 0,62

 

 

Примечание. Данные представлены в виде Медианы, верхнего и нижнего квартилей. р1-р2 – достоверность различий между I и II опытными группами; р2-р3 – достоверность различий между II опытной группой (ГЛ + АГ) и контрольной группой крыс; р1-р3 – достоверность различий между I опытной группой (Митилан) и контрольной группой.

Выявлено увеличение уровня TNF-α, IL-1β, IFN-γ и IL-10 в сыворотке крови крыс II группы, что согласуется с данными литературы о повышении содержания этих цитокинов при АГ и ГЛ (табл. 2) [2, 6, 8, 11]. Известно, что TNF-α, IL-1β и IFN-γ индуцируют активацию макрофагов, способствуют формированию дефектов функции рецепторов к ЛПНП и стимулируют прогрессирование атеросклероза [4, 8, 10, 12]. IFN-γ способен существенно влиять на соотношение ХС и эфиров холестерина в сторону накопления последних, тормозить захват и удаление ХС из клеток с помощью ЛПВП, что приводит к трансформации макрофагов в пенистые клетки [11]. Увеличение значений IL-10 у крыс с ГЛ и АГ объясняет компенсаторное противовоспалительное действие цитокина в условиях повышенной жировой нагрузки и циркуляторной гипоксии при артериальной гипертензии. Данными литературы установлено, что IL-10 по принципу отрицательной обратной связи вызывает замедление продукции провоспалительных цитокинов, подавляет экспрессию IСАМ-1 и VCAM-1 в IL-1β–активированных эндотелиальных клетках, снижает выработку IL-8 и IL-6, ингибирует TNF–α и TGF-β-индуцированную пролиферацию гладкомышечных клеток аорты человека [8, 11]. Другие источники подтверждают, что IL-10 подавляет активность макрофагов, стимуляцию эндотелия модифицированными липопротеинами и высвобождение металлопротеиназ из макрофагов (ответственных за нестабильность бляшки). Он также стимулирует синтез тканевого ингибитора металлопротеиназы-1 моноцитами [11].

При применении Митилана зафиксировано снижение уровней IFN-γ, IL-1β и увеличение IL-10 (см. табл. 2). Не выявлено достоверных отличий между группами по содержанию MMP-9, изменения носили характер тенденции к увеличению ее уровня в группе с применением Митилана (см. табл. 2).

Таблица 2

Содержание цитокинов (IL-1β, IFN-γ, TNF-α, IL-10) и MMP-9 в сыворотке крови крыс

Группы

№ п/п

TNF-α, пг/мл

IL-1β, пг/мл

IFN-γ, пг/мл

IL-10, пг/мл

MMP-9, нг/мл

Опытная группа I

1

0,4 (0,3–0,6) р1-р2 = 0,64

0,01 (0,01–1,8) р1-р2 = 0,08

4,4 (2,5–10,1) р1-р2 = 0,04

34,7 (22,4–106,8)

р1-р2 = 0,06

32,1 (24,3–130,4) р1-р2 = 0,20

Опытная группа II

2

0,35 (0,3–0,5) р2-р3 = 0,01

4,3 (0,6–29,5) р2-р3 = 0,01

16,3 (13,9–23,9) р2-р3 = 0,08

8,7 (2,4–26,4)

р2-р3 = 0,05

8,7 (8,1–93,5) р2-р3 = 1

Контрольная группа

3

0,27 (0,26–0,29)

р1-р3 = 0,06

0,01 (0,01–0,01) р1-р3 = 0,32

3,2 (1,9–13,12) р1-р3 = 1

2,2 (2,1–2,7)

р1-р3 = 0,01

13,9 (10,3–32,7) р1-р3 = 0,14

 

 

Примечание. Данные представлены в виде медианы, верхнего и нижнего квартилей. р1-р2 – достоверность различий между I и II опытными группами; р2-р3 – достоверность различий между II опытной группой (ГЛ + АГ) и контрольной группой крыс; р1-р3 – достоверность различий между I опытной группой (митилан) и контрольной группой.

Корреляционный анализ показал прямую зависимость между TNF-α и ЛПНП (r = 0,9; p < 0,04), IL-1 и ИА (r = 1,0; p < 0,05) и обратную связь между концентрацией IL-10 и ИА = (r = –0,9; р < 0,03). В каждой группе животных рассчитывали цитокиновый профиль – удельный вес средних значений исследуемых цитокинов в их общей сумме, которую принимали за 100 %. В профиле контрольной группы процент IFN-γ преобладал и составлял 56,6; 38,2 % занимало содержание IL-10, при этом соотношение IL-10 к IFN-γ было равно 0,67; 4,8 % приходилось на наличие TNF-α, тогда как процент IL-1β был менее 0,5 %. После 6-месячной жировой нагрузки и артериальной гипертензии в цитокиновом профиле происходило нарастание IL-1β практически в 15 раз, его процентное содержание стало составлять 14,6 %, при этом отмечалось достоверное снижение доли TNF-α, показатель IFN-γ практически не менялся, а отношение IL-10 к IFN-γ снизилось и стало составлять 0,53 в связи с уменьшением уровня IL-10. Под воздействием Митилана значительно возрос процент противовоспалительного цитокина – IL-10 – до 88 %, причем его доля стала в 2,3 раза выше, чем у контрольных крыс, и в 3 раза выше, чем в группе животных без Митилана. Соотношение IL-10 к IFN-γ при этом значительно увеличилось и стало составлять 7,5. Снизилось содержание TNF-α – в 4 раза по сравнению с контролем. Процентный показатель IFN-γ стал в 5 раз, чем у контрольных крыс и животных без назначения Митилана, а процент IL-1β приблизился к 0 уровню (рисунок).

Цитокиновый профиль крови крыс с экспериментальным атеросклерозом и у контрольных животных

Заключение

Результаты исследования показали, что Митилан снижает степень выраженности воспалительного процесса при экспериментальном атеросклерозе и обладает способностью нормализовать показатели липидного обмена. Сочетание противовоспалительных и гиполипидемических свойств Митилана патогенетически обоснованны и позволяют использовать этот препарат для профилактики и комплексной терапии атеросклероза. Необходимы дальнейшие исследования по изучению патогенетических свойств Митилана, разработке адекватных схем и режима его назначения для коррекции иммунных механизмов воспалительного процесса при атеросклерозе.

Рецензенты:

Кулаков Ю.В., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой госпитальной терапии ГБОУ ВПО ВГМУ, г. Владивосток;

Просекова Е.В., д.м.н., профессор, заведующая кафедрой биологической химии, клинической лабораторной диагностики, общей и клинической иммунологии ГБОУ ВПО ВГМУ, г. Владивосток.

Работа поступила в редакцию 09.08.2012.


Библиографическая ссылка

Турмова Е.П., Маркелова Е.В., Красников В.Е., Бычков Е.А., Лукьянов П.А., Чикаловец И.В., Григорюк А.А. ВЛИЯНИЕ 1,6-α-D-ГЛЮКАНА ИЗ ДАЛЬНЕВОСТОЧНОЙ МИДИИ «CRENOMYTILUS GRAYANUS» (МИТИЛАНА) НА ЛИПИДНЫЙ СПЕКТР И ЦИТОКИНОВЫЙ ПРОФИЛЬ СЫВОРОТКИ КРОВИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ АТЕРОСКЛЕРОЗЕ // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 11-1. – С. 46-50;
URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=30443 (дата обращения: 05.12.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074