Основной задачей энзимологии с момента ее возникновения является построение единой теории ферментативного катализа [1, 5, 6].
Нами предлагается кинетический подход к кластерной организации ферментативного катализа. Основным положением данной гипотезы является то, что в процессе ферментативного катализа изменяется кластерно-кинетическая организация фермента в среде.
Кинетический энзимокла́стер (англ. cluster - скопление) - динамическое объединение нескольких гомо- (гетеро-) конформеров фермента в процессе катализа, которое может рассматриваться как самостоятельная единица, обладающая определёнными свойствами.
Предполагается, что для любых ферментов как минимум существуют два основных ферментативных конформера: каталитический и агрегационный (рис. 1). Каталитический конформер характеризуется тем, что при объединении субъединиц в единое целое все активные центры фермента остаются активными. В противоположность ему агрегационный конформер характеризуется такой пространственной организацией, при которой часть активных центров фермента экранируются (см. рисунок). В целом, каждый энзимокластер представлен взаимодействием различного отношения каталитических и агрегационных конформеров между собой. В результате получаются три кинетических варианта энзимокластера:
-
При равном количестве каталитических и агрегационных конформеров у фермента практически не проявляются кооперативные свойства его субъединиц (коэффициент кооперативности (Kn) = 1).
-
Когда количество каталитических конформеров больше, чем агрегационных, у фермента имеет место положительная кооперативность взаимодействия субъединиц (Kn > 1).
-
Если больше агрегационных конформеров, чем каталитических, то фермент обладает отрицательной кооперативностью (Kn < 1).
В процессе кинетики ферментативной реакции происходят постоянные динамические кластеро-кинетические переходы белка-фермента из одной формы в другую, которые можно экспериментально выявить.
Схема образования энзимокластера: a - каталитический конформер; б - агрегационный конформер; в - энзимокластер
Целью исследования явилось применение кластеро-кинетической гипотезы ферментативного катализа для объяснения особенностей кинетических свойств некоторых оксидоредуктаз (алкогольдегидрогеназы (АДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ)).
Материал и методы исследования
Исследования проводили на очищенном препарате АДГ из печени лошади («Sigma», США) и очищенном препарате ЛДГ из мышцы свиньи (фирмы Reanal). Определяли каталитическую активность алкогольдегидрогеназы в прямой (АДГпр) и обратной реакциях (АДГобр), активность лактатдегидрогеназы в прямой (ЛДГпр) и обратной реакции (ЛДГобр). Рассчитывали интегративные кинетические характеристики: Кt (показатель сродства фермента к субстрату), Vmax (максимальная скорость реакции фермента), Kn (коэффициент кооперативности) [2, 3, 4]. Статистический анализ результатов исследований выполнен с использованием программы Statistica 6.
Результаты исследования и их обсуждение
В результате проведенных исследований кинетических свойств очищенных ферментов установлено, что сродство энзимокластера ЛДГ к субстратам реакции, максимальная скорость и каталитическая эффективность в целом выше, чем у энзимокластера АДГ (табл. 1).
Таблица 1 Кинетические показатели ферментов
|
Лактатдегидрогеназа |
Алкогольдегидрогеназа |
||
Кинетические показатели |
ЛДГпр |
ЛДГобр |
АДГпр |
АДГобр |
Kt1 |
1,62 ± 0,02 |
2,23 ± 0,04 p = 0,0021 |
5,33 ± 0,06 |
7,04 ± 0,07 p = 0,0035 |
Vmax1 |
10,33 ± 0,23 |
22,41 ± 0,24 p = 0,0008 |
3,64 ± 0,12 |
98,13 ± 0,26 p = 0,0002 |
Kn1 |
0,81 ± 0,03 |
0,85 ± 0,02 |
1,12 ± 0,03 |
0,94 ± 0,02 |
Примечание: p - различия статистически значимы между показателями прямой и обратной реакций.
Из табл. 1 видно, что сродство к субстратам реакции выше для ЛДГпр по сравнению с ЛДГобр. Максимальная скорость реакции в 2 раза больше для обратной лактатдегидрогеназной реакции по сравнению с прямой. Таким образом, Kt1 ЛДГпр < Kt1 ЛДГобр, а Vmax1 ЛДГобр > Vmax1 ЛДГпр. В данном случае имеет место кластеро-кинетический механизм ферментативной реакции по типу псевдоактивации ЛДГ. Следует отметить, что у ЛДГ проявляется отрицательная кооперативность ее субъединиц, которая указывает на образование агрегационных конформеров данного фермента.
Для АДГпр и АДГобр наблюдается схожая кинетическая зависимость, только с другими значениями сродства к субстратам реакции и Vmax. Для алкогольдегидрогеназы кластеро-кинетический механизм ферментативной реакции представлен по типу псевдоактивации. При этом АДГпр имеет положительную кооперативность взаимодействующих субъединиц фермента, а АДГобр - отрицательную. Можно предположить, что прямая алкогольдегидрогеназная реакция связана с каталитическими конформерами фермента, а обратная - преимущественно с агрегационными конформерами.
Несомненно, что определяющим фактором изменения кинетических характеристик оксидоредуктаз является физико-химическое состояние среды, в которой происходит ферментативная реакция.
Для изменения физико-химических условий проведения ферментативной реакции оксидоредуктаз в среду буфера добавлялись сразу два фермента (ЛДГ, АДГ) и определялась каталитическая активность каждого в отдельности (табл. 2).
Таблица 2 Кинетические показатели ферментов (в среде одновременно присутствуют два фермента в равных количествах)
|
ЛДГ и АДГ (1:1) |
АДГ и ЛДГ (1:1) |
||
Кинетические показатели |
ЛДГпр |
ЛДГобр |
АДГпр |
АДГобр |
Kt2 |
1,29 ± 0,04 |
8,83 ± 0,06* p = 0,0034 |
4,67 ± 0,03 |
4,5 ± 0,02* |
Vmax2 |
4,88 ± 0,05* |
31,9 ± 0,24* p = 0,0004 |
2,54 ± 0,26 |
31,83 ± 0,18* p = 0,0001 |
Kn2 |
0,78 ± 0,01 |
0,95 ± 0,02 p = 0,0078 |
0,91 ± 0,01 |
0,91 ± 0,02 |
Примечание: p - различия статистически значимы между показателями прямой и обратной реакций; * - различия статистически значимы по сравнению с показателями очищенного фермента при наличии в растворе одного фермента (p ≤ 0,05).
Из табл. 2 следует, что присутствие в растворе одновременно двух ферментов в равном количестве оказывает влияние на кинетические свойства как ЛДГ, так и АДГ. Для ЛДГпр кинетика ферментативной реакции изменяется по типу неконкурентного ингибирования, когда Kt1 ЛДГпр = Kt2 ЛДГпр, а Vmax2 ЛДГпр < Vmax1 ЛДГпр. Кинетика лактатдегидрогеназы в обратной реакции представлена по типу двухпараметрической рассогласованной активации, Kt2 ЛДГобр > Kt1ЛДГ обр, а Vmax2 ЛДГобр > Vmax 1ЛДГобр. Кинетические показатели прямой алкогольдегидрогеназной реакции практически не изменяются при наличии в растворе одновременно двух ферментов. Для АДГобр кинетика ферментативной реакции представлена по типу бесконкурентного ингибирования, где Kt 2АДГобр < Kt1 АДГобр, а Vmax2 АДГобр < Vmax1 АДГ (см. табл. 1, 2).
При этом присутствие в среде одновременно двух ферментов существенно сказывается на их отрицательной кооперативности в процессе образования энзимо- кластеров.
В итоге можно сделать заключение, что изменение микроокружения фермента, в частности оксидоредуктаз (алкогольдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы), приводит к трансформации их конформеров (каталитических и агрегационных), что в свою очередь сказывается на образовании энзимокластера, проявляющего различные кинетические свойства. Данный кинетический подход, несомненно, важен для дальнейшего развития исследований в области современной энзимологии, особенно при изучении свойств ферментов, входящих в состав сложной гетерогенной системы клетки.
Рецензенты:
-
Корягин А.С., д.б.н., профессор кафедры физиологии и биохимии человека и животных ГОУ ВПО «ННГУ им. Н.И. Лобачевского», г. Нижний Новгород;
-
Веселов А.П., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биохимии и физиологии растений, декан биологического факультета ГОУ ВПО «ННГУ им. Н.И. Лобачевского», г. Нижний Новгород.
Работа поступила в редакцию 05.07.2012.
Библиографическая ссылка
Зимин Ю.В., Уланова А.А., Соловьева А.Г. КЛАСТЕРО-КИНЕТИЧЕСКАЯ ГИПОТЕЗА ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 9-3. – С. 559-562;URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=30308 (дата обращения: 16.08.2024).