Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Миронов В.А. 1 Ширшиков Ф.В. 1 Калачёва Н.В. 1 Черепнёв Г.В. 2

---

1 Казанский (Приволжский) федеральный университет

2 Отдел лабораторной медицины Казанской государственной медицинской академии

Изучено влияние двух различных концентраций (40 мкг/мл и 400 мкг/мл) биназы (РНКазы Bacillus intermedius) на развитие спонтанного и пероксид-индуцированного апоптоза в субпопуляциях лейкоцитов крови человека с помощью метода проточной лазерной цитофлуориметрии. Установлено, что биназа в концентрации 400 мкг/мл избирательно активирует спонтанный апоптоз моноцитов крови человека и не модифицирует апоптоз лимфоцитов и гранулоцитов в обеих исследованных концентрациях. В условиях оксидативного стресса, вызванного H2O2, биназа оказывает дифференцированное влияние на апоптоз моноцитов в зависимости от концентрации. В низкой концентрации она значительно увеличивает долю жизнеспособных моноцитов, обработанных пероксидом водорода. При концентрации 400 мкг/мл протекторный эффект биназы в отношении моноцитов исчезает. В то же время в концентрации 400 мкг/мл биназа меняет динамику Н2О2-индуцированного апоптоза, повышая долю моноцитов в стадии раннего апоптоза. При этом она достоверно не модифицирует Н2О2-индуцированный апоптоз гранулоцитов и лимфоцитов. Обнаружено сходство апоптозмодулирующего эффекта биназы в моноцитах крови человека и перитонеальных макрофагах крысы.

Статья в формате PDF

765 KB

биназа

спонтанный и пероксид-индуцированный апоптоз

апоптоз модулирующий эффект

мононуклеарные фагоциты

1. Голубенко И. А., Балабан Н.П., Лещинская И.Б. Рибонуклеаза Bacillus intermedius 7P. Очистка хроматографией на фосфоцеллюлозе и некоторые характеристики гомогенного фермента. Биохимия. - 1979. - Т. 44. - С. 640-648.

2. Сравнительная цитотоксичность биназы по отношению к опухолевым и нормальным клеткам: ученые записки Казанского университетата / Э.А. Кабрера Фуентес, П.В. Зеленихин, А.И. Колпаков, К.Т. Прайсснер, О.Н. Ильинская. - 2010. - Т. 152. Кн. 3. - С. 143-148.

3. Калачева Н.В., Куриненко Б.М. Влияние рибонуклеаз и их модифицированных производных на функциональную активность перитонеальных макрофагов крысы // Биомедицинская химия. - 2005. - Т. 3. - С. 303-309.

4. Меньшиков В.В. Клиническая лабораторная аналитика. - М., 1999. - Т.2.

5. Debby G.B., Сess W.J., Oomens, P.T., Carlijn М.С. Evolution of a continuous quantification method of apoptosis and necrosis in tissue cultures. Cytotechnology. - 2004. - V. 46. - P. 139-150.

6. Frantz S., Kelly R.A. Role of TLR-2 in the Activation of Nuclear Factor κB by oxidative stress in Cardiac Myocytes. The Journal of Biological Chemistry. - 2001. - V. 276. - P. 5197-5203.

7. Huang J.M., Roberto M.L., Ragione, Nanez A., Simon M. Immunostimulatory activity of Bacillus spores. Immunol. Med. Microbiol. - 2008. - V. 53. - P. 195-203.

8. Joshi, S.G., Francis C.W., Silverman D.J. Nuclear factor κB protects against host cell apoptosis during Rickettsia rickettsii infection by inhibiting activation of apical and effector caspases and maintaining mitochondrial integrity. Infection and Immunity. - 2003. - V. 71. - рр. 4127-4136.

9. Michael V.L., Satish K.N. Intracellular TLR Signaling: A Structural Perspective on Human Disease. The Journal of Immunology. - 2006. - V. 177 (1). - P. 11-16.

10. Mower D.A., Peckhman D.W. Decreased membrane phospholipid packing and decreased cell size precede DNA cleavage in mature B cell apoptosis. J.Immunol. - 1994. - V. 152. - P. 4832-4842.

В настоящее время в отечественной и зарубежной литературе активно обсуждается роль апоптоза клеток в норме и патологии. Пристальное внимание уделяется изучению влияния активных форм кислорода на апоптоз и некроз. Оксидативный стресс, определяемый как нарушение баланса между оксидантами и антиоксидантами в пользу первых, является одним из основных патофизиологических индукторов гибели клетки. В связи с этим поиск соединений, стимулирующих или подавляющих апоптоз, составляет одно из актуальных направлений современной биофармакологии.

Объект настоящего исследования - РНКаза Bacillus intermedius (биназа), которая обладает рядом биологических эффектов, в том числе способностью избирательно подавлять рост некоторых линий онкотрансформированных клеток, переводя их на путь апоптоза [2].

В работе исследовано влияние биназы на спонтанный и индуцированный апоптоз субпопуляций лейкоцитов периферической крови человека. Индукцию апоптоза осуществляли в модели оксидативного стресса, вызванного пероксидом водорода.

Биназа (РНКаза Bacillus intermedius) - катионный белок с молекулярной массой 12,3 кДа, изоэлектрической точкой pI 8,9 и максимальной каталитической активностью при рН 8,5. В работе использовали гомогенный препарат РНКазы, полученный по методу [1].

Апоптоз субпопуляций лейкоцитов периферической крови человека исследовали методом лазерной проточной цитометрии с помощью флуорохромов Мероцианина 540 (МС-540) (Sigma) и (TO-PRO-3) дийодид (Invitrogen). Индуктор апоптоза - пероксид водорода (Sigma). Для морфологической оценки апоптоза методом световой микроскопии использовали красители: трипановый синий и Романовского-Гимза (Sigma).

Гепаринизированную венозную кровь условно здоровых доноров отстаивали в течение 30 минут при 37°С, отбирали слой сыворотки с лейкоцитами и отмывали клетки центрифугированием (200 g, 10 мин). Полученный осадок лейкоцитов ресуспензировали в фосфатно-солевом буфере (pH 7,4) до конечной концентрации 10⁶ клеток/мл и раскапывали по 250 мкл в пробирки для проточной цитометрии (Falcon 352054, BD). В опытные пробы вносили раствор биназы в фосфатно-солевом буфере (конечная концентрация 400 и 40 мкг/мл) и пероксид водорода (конечная концентрация 3 мМ). В контрольные пробы вносили фосфатно-солевой буфер в эквивалентном объеме. Клетки инкубировали 3 часа в СО₂-инкубаторе при 37°С и 100% влажности. После инкубации клетки дважды промывали в фосфатно-солевом буфере центрифугированием при 250 g в течение 5 минут, ресуспензировали в 500 мкл буфера и вносили флуорохромы МС540 и TO-PRO-3 йодид. Пробы инкубировали 10 минут в атомосфере 5% СО₂ при 37°С и анализировали на проточном цитофлуориметре.

Определение экспрессии фосфатидилсерина и проницаемости цитоплазматической мембраны методом проточной цитометрии

Цитометрический анализ субпопуляций лейкоцитов проводили на проточном лазерном цитофлуориметре FacsCalibur (Becton Dickinson, USA), оснащенном двумя лазерами с длиной волны 488 и 635 нм. Экспрессию фосфатидилсерина (ФС) и проницаемость плазматической мембраны на уровне отдельной клетки оценивали по модифицированному протоколу [10]. В суспензию, содержащую 10⁶ клеток/мл, за 10 мин. перед цитометрическим анализом вносили ФС-связывающий флуорохром МС-540 в конечной концентрации 0,2 мкг/мл. Для оценки проницаемости плазматической мембраны в клеточную суспензию одновременно с MC-540 вносили TO-PRO-3-йодид в конечной концентрации 0,2 мкМ. МС540 связывается с остатками фосфатидилсерина, экспонированного на мембране апоптозных клеток. ДНК-тропный флуорохром TO-PRO-3 через поврежденную цитоплазматическую мембрану проникает внутрь клетки и окрашивает ДНК. Лимфоидную, моноцитарную и гранулоцитарную субпопуляции выделяли по показателям прямого (FSC, диаметр клетки) и бокового (SSC, гранулярность клетки) светорассеяния. После исключения дебриса и выделения лимфоидного, моноцитарного и гранулоцитарного гейтов, определяли долю:

1. интактных клеток [фенотип MC540(-)TO-PRO-3(-)];
2. клеток на ранней стадии апоптоза [фенотип MC540(+)TO-PRO-3(-)];
3. клеток на поздней стадии апоптоза [фенотип MC540(+)TO-PRO-3(+)];
4. некротических клеток [фенотип MC540(-)TO-PRO-3(+)].

На каждый вариант опыта просчитывали не менее 25000 клеточных событий. Результаты измерений обрабатывали в программе CellQuest Pro (BD Biosciences), статистический анализ полученных результатов выполняли по критерию хи-квадрат с коррекцией Yates в пакете прикладных программ STATISTICA 6.0.

Выделение перитонеальных макрофагов крысы

В экспериментах использовали перитонеальные макрофаги белых беспородных крыс 5-6 недельного возраста. Работу с крысами проводили с соблюдением принципов Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. Крыс забивали декапитацией под эфирным наркозом. Перитонеальные макрофаги выделяли из перитонеальных смывов, вводя животным в брюшную полость холодный 0.9% раствор NaCl. Клетки промывали физиологическим раствором, суспендировали в среде PRMI (Sigma, США), разводили до концентрации 1,2∙10⁶ кл/мл и использовали в эксперименте.

Изучение влияния биназы на жизнеспособность, некроз и апоптоз макрофагов

Макрофаги, разведенные в среде RPMI 1640 до концентрации 1,2∙10⁶ кл/мл, наносили на покровные стекла в объеме 0,1 мл и оставляли на 20 мин при 37°C для адгезии клеток. Затем клетки на стёклах дважды промывали средой и к опытным образцам добавляли раствор биназы в среде RPMI в конечной концентрации 100 и 200 мкг/мл. Стекла помещали на 0,5 часа в СО₂-инкубатор (37°C), после чего заменяли среду с ферментом на среду, содержащую 2 мМ Н₂О₂, и инкубировали 3 час. В качестве контролей использовали интактные клетки, инкубированные в питательной среде, а также клетки, в которые добавляли раствор Н₂О₂ без предварительной инкубации с ферментом.

Идентификацию жизнеспособных, некротических и апоптотических клеток осуществляли методом световой микроскопии. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью витального красителя трипанового синего. Некротическую и апоптотическую гибель клеток дифференцировали по характерным морфологическим признакам [5] после окрашивания клеток по методике Романовского-Гимза [4]. Апоптотическими считали клетки только с фрагментированными ядрами (т.е. в позднем апоптозе). Анализировали несколько полей зрения на каждом стекле (не менее 600 клеток) и рассчитывали относительное содержание каждой клеточной популяции. Различия долей полагали достоверными при значениях Р ≤ 0,05.

Влияние биназы на апоптоз исследовали в гранулоцитарной, моноцитарной и лимфоидной популяциях лейкоцитов. Согласно результатам, полученным нами ранее [3], биназа в концентрации до 100 мкг/мл стимулировала функциональную активность макрофагов, а в концентрации выше 100 мкг/мл ингибировала её. Тенденция сохраняется и в отношении других клеток, в том числе онкотрансформированных, для которых цитотоксичными являются высокие концентрации РНКаз [2]. В связи с этим в работе мы исследовали две концентрации биназы: 40 мкг/мл (нетоксичная) и 400 мкг/мл (токсичная).

При действии биназы в концентрации 40 мкг/мл распределение моноцитов по стадиям апоптоза не отличается от контрольного (рис. 1Б, В). При концентрации биназы 400 мкг/мл доля моноцитов в поздней стадии апоптоза увеличивается на 92,2% (рис. 1В). Биназа в концентрациях 40 и 400 мкг/мл не модифицирует апоптоз лимфоцитов и гранулоцитов (рис. 2Б, В и 3Б, В). Пероксид водорода в концентрации 3 мМ эффективно стимулирует программированную клеточную гибель моноцитов (рис. 1б, в), лимфоцитов (рис. 2 Б, В) и гранулоцитов (рис. 3 Б, В). Биназа в концентрации 40 мкг/мл на 72,3% увеличивает долю MC540(-)TO-PRO-3(-) жизнеспособных моноцитов, обработанных пероксидом водорода (рис. 1А). Протекторный эффект биназы в отношении моноцитов исчезает при концентрации 400 мкг/мл. Биназа в концентрации 400 мкг/мл модифицирует динамику Н₂О₂-индуцированного апоптоза моноцитов, увеличивая накопление клеток в стадии раннего апоптоза на 24,9% (рис. 1Б). Биназа в концентрациях 40 и 400 мкг/мл не увеличивает долю MC540(-)TO-PRO3(-) жизнеспособных лимфоцитов и гранулоцитов, обработанных пероксидом водорода (рис. 2А и 3А), и достоверно не модифицирует Н₂О₂-индуцированный апоптоз гранулоцитов и лимфоцитов (рис. 2Б, В и 3Б, В).

Таким образом, биназа в концентрации 400 мкг/мл избирательно стимулирует апоптоз моноцитов. В условиях оксидативного стресса, вызванного H₂O₂, биназа оказывает дифференцированное влияние на апоптоз моноцитов в зависимости от концентрации (рис. 4).

Поскольку моноциты являются предшественниками макрофагов и гистогенетически представляют собой один тип клеток (мононуклеарные фагоциты), мы сопоставили эффекты биназы в моноцитах донорской крови с таковыми для перитонеальных макрофагов крысы (рис. 5). Биназа в концентрации 200 и 400 мкг/мл стимулирует апоптоз макрофагов. Через 18 часов инкубации монослойной культуры макрофагов с биназой доля апоптотических клеток составляла более 50% по сравнению с 5-7% в контроле (данные не показаны). В условиях оксидативного стресса предварительная инкубация макрофагов с биназой приводила к снижению гибели перитонеальных макрофагов от некроза, переводя клетки на доминирующий путь апоптоза. При концентрации 200 мкг/мл наблюдалась тенденция к увеличению доли жизнеспособных клеток (рис. 5).

Согласно результатам, у моноцитов крови человека в модели оксидативного стресса после инкубации с биназой в низкой концентрации также увеличивалась жизнеспособность, а при высокой концентрации биназы наблюдалась ко-стимуляция апоптогенного эффекта Н₂О₂ и торможение процесса перехода клеток из ранней стадии апоптоза в позднюю. Таким образом, в мононуклеарных фагоцитах крысы и человека биназа проявляет сходный апоптоз-модулирующий эффект.

На основании полученных результатов, а также данных публикаций, мы высказываем следующее предположение о возможных путях реализации обнаруженных эффектов биназы на клеточном уровне. Принимая во внимание, что бактерии рода Bacillus взаимодействуют с макрофагами через TLR-2 и TLR-4 рецепторы [7], а биназа концентрационно зависимо модулирует функциональную активность макрофагов [3], мы полагаем, что дифференцированный эффект биназы в популяциях лейкоцитов может быть опосредован Toll-подобными рецепторами (TLR). Как свидетельствуют многочисленные исследования последних лет, TLR участвуют в передаче про- и антиапоптогенных сигналов в клетке [8, 9]. Вместе с тем имеются работы, в которых показано, что пероксид водорода также инициирует TLR-зависимую апоптогенную сигнализацию [6]. В связи с этим можно предположить, что адсорбция биназы на клеточной поверхности прямо или косвенно будет оказывать влияние на TLR-опосредованные апоптогенные сигнальные пути и, в зависимости от условий, модулировать апоптоз в мононуклеарных фагоцитах. Изучение потенциальных TLR-зависимых механизмов избирательного действия биназы в мононуклеарных фагоцитах заслуживает дальнейшего исследования.

Выводы

1. Биназа избирательно активирует апоптоз моноцитов крови человека и не влияет на программированную клеточную гибель лимфоцитов и гранулоцитов.
2. В условиях оксидативного стресса предварительная инкубация лейкоцитов с биназой увеличивает субпопуляцию жизнеспособных моноцитов и меняет динамику Н₂О₂-индуцированного апоптоза, повышая долю моноцитов в стадии раннего апоптоза.
3. Биназа не модифицирует Н₂О₂-инду­ци­рованный апоптоз лимфоцитов и гранулоцитов.

Рецензенты:

• Багаева Т.В., д.б.н., профессор, зав.кафедрой биотехнологии Института фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета Минобрнауки РФ, г. Казань;
• Жданов Р.И., д.х.н., профессор кафедры фармакологии Института фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета Минобрнауки РФ, г. Казань.

Работа поступила в редакцию 25.06.2012.

Библиографическая ссылка