Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Землянухина О.А. 2 Моисеева Е.В. 1 Баранова Т.В. 1 Калаев В.Н. 1 Карпеченко K.А. 2 Вепринцев В.Н. 2

---

1 ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет», Воронеж

2 ФГУП «Научно-исследовательский институт лесной генетики и селекции», Воронеж

Были проведены исследования биохимических свойств некоторых представителей семейства (Ericaceae DC): Rhododendron lúteum Sweet, Rh. japonicum (Gray) Suringar, Rh. ledebourii Pojark., Rh. schlippenbachii Maxim., Erica tetralix L. Изучена ферментативная активность изоцитратдегидрогеназы, изоцитратлиазы, NADH -. дегидрогеназы, пероксидазы. Получены данные об отсутствии активности малик-фермента и низкой активности изоцитратлиазы у изучаемых объектов. Выявлены широкие пределы активности NADH-дегидрогеназы у разных представителей семейства вересковых. Сделаны предварительные выводы о том, что этот фермент у изучаемой группы растений берет на себя функцию отсутствующей пероксидазы и позволяет растениям адаптироваться при интродукции в условиях Центрального Черноземья. Результаты исследований свидетельствуют о стабилизации биохимических показателей к 3-7-летнему возрасту у разных видов рододендронов и об увеличении адаптации растений.

Статья в формате PDF

334 KB

биохимическая активность

ферментативная активность

семейство вересковые (Ericaceae D.C.)

Центральное Черноземье

1. Александрова М.С. Рододендроны. – М.: ЗАО «Фитон», 2001. – 192 с.

2. Деревья и кустарники. – М., Л., 1960. – 543 с.

3. Землянухин А.А., Землянухин Л.А. Большой практикум по физиологии и биохимии растений. – Воронеж: ВГУ, 1996. – С. 97–98.

4. Землянухина О.А., Машкина О.С., Саблина И.В., Исаков Ю.Н., Епринцев А.Т. // Межрегион. сб. науч. работ. – Вып. 5. – Воронеж, 2003. – С. 46–52.

5. Левитес Е.В. Генетика изоферментов растений. – Новосибирск: Наука, 1986. – 145 с.

6. Davis B.J. Disc Electrophoresis II. Method and application to human serum proteins // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 1964. – V. 121. – P. 404–427.

7. Wendel J.F., Weedel N.F. Isozymes in plant biology. Edited by D.E. Soltis, P.S. Soltis // Visualization and Interpretation of Plant Isozymes. – Chapter 1. – P. 5–45.

Роды рододендрон (Rhododendron L.) и эрика (Erica L.) относятся к семейству вересковые (Ericaceae D.C.), куда входят более 1000 видов и около 12000 сортов [1]. По своим свойствам рододендроны являются одними из наиболее декоративных кустарников во всем мире. По срокам цветения рододендроны можно разделить на несколько групп: раннецветущие (апрель); когда другие растения пребывают еще в состоянии начала вегетации; среднецветущие (май - начало июня), которые не менее декоративны при цветении. Вместе с тем, представители этого семейства недостаточно широко введены в культуру Центрального Черноземья. Интродукция представителей семейства вересковых на базе ботанического сада им. проф. Б.М. Козо-Полянского Воронежского госуниверситета начата еще в 70-е годы. В настоящее время на территории сада произрастают цветущие и плодоносящие 30-летние растения рододендрона желтого (Rh. lúteum Sweet), рододендрона японского (Rh. japonicum (Gray) Suringar), рододендрона Ледебура (Rh. ledebourii Pojark.) и рододендрона Шлиппенбаха (Rh. schlippenbachii Maxim.). В настоящее время особенное внимание уделяется изучению онтогенеза и морфологии вересковых, но литературные данные о биохимических особенностях этой группы растений в условиях Центрального Черноземья практически отсутствуют.

В связи с этим целью работы являлось изучение биохимических показателей рододендронов в условиях культуры ботанического сада Воронежского госуниверситета.

В качестве материала для исследований использовали листья 4 видов рододендронов, а также листья эрики четырехмерной (Erica tetralix L.), произрастающих на территории ботанического сада Воронежского госуниверситета.

1. Рододендрон желтый. Родина: Украина, Белоруссия, Кавказ, Малая Азия. Листопадный кустарник, высотой 1-2 м. Цветки золотисто-желтые или оранжевые, по 7-12 в соцветии [2]. В условиях ботанического сада Воронежского госуниверситета цветет в середине мая начале июня, однократно. Засухоустойчив, в холодные зимы подмерзает. Изучались пять возрастов кустарника: 1-, 3-, 5-, 7- и 30-летние в культуре ботанического сада. Кроме того, однолетние растения включали экземпляры рододендрона желтого, завезенные семенами из Клагенфурта (Австрия) и Санкт-Петербурга.
2. Рододендрон японский. Родина: Япония. Листопадный кустарник, 1-2 м высотой. Цветки желтые, лососевые, ярко-красные с большим оранжевым пятном, по 6-12 в соцветии [2]. В условиях ботанического сада цветет в середине мая начале июня, однократно. Засухоустойчив, в холодные зимы подмерзает. Изучались 3 возраста растения: 1-, 7- и 30-летние.
3. Рододендрон Ледебура. Родина: Алтай, Саяны, Монголия. Полувечнозеленый кустарник, 0,5-2 м высотой. Почки имеют по одному цветку. Цветки розово-фиолетовые [2]. В условиях ботанического сада цветет в середине-конце апреля, возможно до 4-х повторных цветений. Зимостоек, засухоустойчив. Изучались 3 возраста растения: 1-, 3- и 30-летние.
4. Рододендрон Шлиппенбаха. Родина: Дальний Восток, Китай, Корея, Япония. Листопадный кустарник, высотой 1-3 м. Цветки бледно-розовые с пурпурными крапинками, по 3-6 в соцветии [2]. В условиях ботанического сада цветет с конца апреля, однократно. Засухоустойчив, в холодные зимы подмерзает. Изучались 4 возраста растений: 1-, 3-, 7- и 30-летние. Однолетние растения включали дополнительно экземпляр, завезенный из Штутгарта (Германия);
5. Эрика четырехмерная. Родина: Северо-Западная Европа. Кустарничек 60-70 см высотой. На вершине стеблей компактные соцветия по 2-4 малиновых или белых цветков [2]. В условиях ботанического сада в вегетирующем состоянии, засухоустойчива, зимостойка. Изучались 2 возраста растений: 1-, 2-летние.

Для изучения особенностей видов рододендронов были использованы методы определения активности энзимов и изоферментый анализ в листьях растений. Определение ферментативной активности проводили по Землянухину А.А. [3] и Землянухиной О.А. [4]. Изоферментный анализ по методу Дэвиса в ПААГ [6] осуществляли, используя несколько источников [5-7]. Изучались активности и изозимные спектры ферментов: пероксидазы (ПО; КФ 1.11.17), глюкозо-6-Ф-дегидрогеназы (гл.-6-Ф-ДГ; КФ 1.1.1.49), изоцитратдегидрогеназы (ИДГ; КФ 1.1.1.42), малик-фермента (КФ 1.1.1.39), изоцитратлиазы (ИЦЛ; КФ 4.1.3.1), малатдегидрогеназы (МДГ; КФ 1.1.1.37), NADH-дегидрогеназы (NADH-ДГ; КФ 1.6.99.1), неспецифической 1-эстеразы (ЭСТ; КФ 3.1.1.1) [3]. Все измерения проводили в трех биологических повторностях. В таблице и на рисунках даны значения средних арифметических данных, вычисленных на основании трех измерений.

Одним из способов выявления и оценки генетического разнообразия в природе является измерение активности ферментов, поскольку белки, являясь непосредственным продуктом генной активности, наиболее адекватно отражают изменения в этой структуре. Другим способом служит изоферментный анализ с помощью электрофоретического разделения белков. Почти все животные и растительные клетки в норме аэробны и все органическое «топливо» окисляют полностью до СО₂ и Н₂О. Говоря о дыхании, мы обычно имеем в виду его физиологический или макроскопический аспект, т.е. процесс поглощения кислорода и выделения СО₂ в легких. Биохимики же и цитологи вкладывают в этот термин другой смысл: они рассматривают дыхание на микроскопическом уровне, т.е. интересуются молекулярными механизмами процессов потребления кислорода и образования СО₂ в клетке.

Цикл лимонной кислоты, называемый также циклом трикарбоновых кислот или циклом Кребса, является второй стадией клеточного дыхания. На этой стадии ацетильные группы ацетил-КоА расщепляются ферментативным путем с образованием высокоэнергетических атомов водорода и высвобождением СО₂, который представляет собой конечный продукт окисления органического топлива. В цикле трикарбоновых кислот на различных регуляторных пунктах функционирует множество ферментов, изучались лишь некоторые из них. Под действием изоцитратдегидрогеназы изоцитрат дегидрируется с образованием 2-оксоглутарата и СО₂. Суммарная реакция процесса окисления выглядит так:

Изоцитрат + NADP → 2-оксоглутарат + СО₂ + (NADPH) + H⁺.

Этот тип фермента NADP-зависимый, встречается как в митохондриях, так и в цитозоле, что связано с регуляцией цикла.

Результаты измерения активности фермента представлены на рис. 1.

По величине активности изоцитратдегидрогеназы изучаемые виды семейства вересковые можно разделить на 2 группы: первая, куда входят рододендрон желтый и рододендрон японский, и вторая, включающая рододендрон Ледебура, рододендрон Шлиппенбаха и эрику четырехмерную. В однолетнем возрасте все виды рододендрона, кроме рододендрона Шлиппенбаха (образец №12), обнаруживают значения общей активности фермента, близкие или равные нулю. Однако у рододендронов желтого и японского в возрасте 5-7 лет активность фермента начинает расти, достигая максимума у первого (0,305 ФЕ/мл) и продолжающего подъем активности вплоть до 30 летнего возраста у рододендрона японского (0,231 ФЕ/мл). Активность фермента у рододендрона Ледебура и рододендрона Шлиппенбаха характеризуется низкими значениями и практически не зависит от возраста растения. Общая активность изоцитратдегидрогеназы эрики в возрасте 1-2 года близка к нулю. Проводилось исследование и других ферментов цикла трикарбоновых кислот, а именно: малик-фермента (КФ 1.1.1.39) и малатдегидрогеназы (МДГ; КФ 1.1.1.37). Малик-фермент имеет митохондриальную локализацию, хотя и встречается в цитозоле. Обнаруживается обычно во всех растительных тканях, где протекают интенсивные биосинтетические и энергетические процессы, например, в листьях. Однако результаты исследований не показали видимой активности фермента ни у одного из исследованных видов. Что же касается активности малатдегидрогеназы, то ее активность наблюдается лишь в растениях эрики 2-летнего возраста (0,021 ФЕ/мл). Возможно, это объясняется тем, что концентрация пула малата в цикле трикарбоновых кислот рододендронов достаточно велика, поэтому необходимость функционирования данных ферментов отпадает.

У растений и некоторых микроорганизмов ацетильные группы часто служат не только высокоэнергетическим «топливом», но и источником метаболитов, из которых строятся углеродные скелеты углеводов. В таких клетках действует модификация цикла трикарбоновых кислот, называемая глиоксилатным циклом. В глиоксилатном цикле ацетил-КоА взаимодействует с оксалоацетатом, в результате чего образуется цитрат. Однако расщепление изоцитрата происходит не в обычной изоцитратдегидрогеназной реакции, как в цикле трикарбоновых кислот, а под действием фермента изоцитратлиазы с образованием сукцината и глиоксилата. Цикл распространен среди масличных растений и растений, накапливающих оксалаты. Активность изоцитратлиазы в листьях рододендронов хотя и низкая, но измеряемая, результаты представлены на рис. 2.

Хотя листья рододендронов содержат эфирные масла, о чем свидетельствует сильный запах растений, однако значительных различий в активности изоцитратлиазы не обнаружено. Возможно, низкая активность фермента связана с индивидуальными особенностями семейства, но вероятно также снижение его активности в связи с осенним сезоном. Рододендроны относятся к С₃-растениям, поэтому осенью происходит замедление фотосинтеза и, в общем, снижение процессов дыхания.

Рододендроны оказались малоинформативны и с точки зрения изоферментных спектров. Во-первых, все растительные экстракты, кроме рододендрона Ледебура, содержали слизеподобные вещества, возможно, в связи с высоким содержанием дубильных веществ, которые препятствовали нормальному разделению макромолекул. Во-вторых, низкие значения активности измеряемых ферментов не привели к их концентрации в ходе электрофореза. Ферментативной активности глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы, являющейся первым ферментом пентозо-фосфатного пути, не обнаружено. Это свидетельствует как о слабом биосинтезе жирных кислот в листьях рододендронов, так и о хорошей приспособленности растений к почвам ботанического сада. Измерение активности пероксидазы, широко распространенного фермента среди практически всех растений, дало отрицательный результат. Однако общая активность энзима у эрики показала значительные величины пероксидазной активности: 0.380 ФЕ/мл у однолетнего экземпляра и 0,523 ФЕ/мл у двулетнего.

Дыхание растений происходит с запасанием энергии (цикл трикарбоновых кислот) и без него. Второй тип окисления называется свободным дыханием, происходящим в митохондриях. Он обуславливает адаптацию к изменению температурных условий, состава атмосферы, светового режима и других параметров. За функционирование свободного дыхания отвечает фермент NADH-дегидрогеназа, сосредоточенный в митохондриях. Наши исследования показали, что активность этого фермента колеблется в широких пределах у рододендронов (от 0 до 0,358 ФЕ/мл в зависимости от вида и возраста) и практически равна нулю у эрики (таблица).

Возможно, данный фермент у рододендронов берет на себя функцию отсутствующей пероксидазы и позволяет растениям адаптироваться при интродукции в условиях Центрального Черноземья. Но результаты исследований неоднозначны: у рододендрона Ледебура и рододендрона Шлиппенбаха наибольшее значение активности фермента отмечено у трехлетних экземпляров, у рододендрона желтого - увеличение с возрастом, у рододендрона японского - снижение показателя.

Таким образом, изучение ферментативной активности изоцитратдегидрогеназы позволяет разделить исследуемые виды на две группы по изменению способа клеточного дыхания в цикле лимонной кислоты. У первой, в которую входит рододендрон желтый и рододендрон японский, в онтогенезе происходит рост активности фермента, а у второй ее уровень остается постоянным на минимальном (рододендрон Ледебура и рододендрон Шлиппенбаха) или нулевом уровне (эрика). За адаптивные процессы у рододендронов отвечает фермент NADH-дегидрогеназа, в отличие от других растений, где роль стрессорного энзима берет на себя пероксидаза. Активность изоцитратлиазы увеличивается пропорционально возрасту у рододендрона Ледебура, уменьшается - у рододендрона Шлиппенбаха, у 3-, 5-, 30-летних экземпляров рододендрона желтого и рододендрона японского остается практически на одном уровне. Наибольшее значение - у рододендрона желтого (7 лет). Результаты исследований свидетельствуют о стабилизации биохимических показателей к 3-7-летнему возрасту у разных видов рододендронов и об увеличении адаптации растений.

Общая активность NADH-дегидрогеназы у разных представителей семейства вересковых (обозначения как на рис. 1 и 2)

Работа выполнена в рамках и при поддержке государственного контракта на выполнение научно-исследовательских и опыт­но-конструкторских работ федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» № 16.518.11.7099.

• Ершова А.Н., д.б.н., профессор, зав. кафедрой биологии растений и животных естест­вен­но-географического факультета ФГБОУ ВП­О «Воронежский государственный педагогический университет», г. Воронеж;
• Корнеева О.С., д.б.н., профессор, зав. кафедрой микробиологии и биохимии ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий», г. Воронеж.

Работа поступила в редакцию 12.02.2012

Библиографическая ссылка