Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ АЛЬФА-ДЕФЕНЗИНОВ В ЛЕГКИХ ПРИ РЕСПИРАТОРНОМ ДИСТРЕСС-СИНДРОМЕ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Пруткина Е.В. 1 Сепп А.В. 1 Цыбиков Н.Н. 1
1 ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России
На нелинейных крысах-самцах воспроизводили острый респираторный дистресс-синдром по оригинальной методике. Животным путем пункции трахеи вводили лизат 45-55 тысяч крысиных нейтрофилов в 0,2 мл 0,9% раствора хлорида натрия (способ защищен патентом РФ). В каждую стадию развития синдрома методом иммуногистохимии определяли экспрессию α-дефензинов различными клетками в легких. Показали, что α-дефензины экспрессируют нейтрофилы, макрофаги и альвеолоциты. Обнаружили, что наибольший уровень экспрессии во все стадии синдрома характерен для нейтрофилов. В экссудативную фазу ОРДС экспрессия α-дефензинов нейтрофилами и макрофагами самая значительная, в пролиферативную фазу она вдвое уменьшается, и наименьшая – в фибротическую. Экспрессия пептидов альвеолоцитами во все стадии остается неизменной.
экспериментальный респираторный дистресс-синдром
α-дефензины
клетки легких
1. Аверьянов А.В., Поливанова А.Э. Нейтрофильная эластаза и болезни органов дыхания // Пульмонология. - 2006. - №5. - С. 74-79.
2. Будихина А.С., Пинегин Б.В. Дефензины - мультифункциональные катионные пептиды человека // Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2008. - №2. - С. 31-40.
3. Катионные противомикробные пептиды как молекулярные факторы иммунитета / В.Н. Кокряков [и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2006. - №2. - С. 98-105.
4. Острый респираторный дистресс-синдром: Практическое руководство / под ред. Б.Р. Гельфанда, В.Л. Кассиля- М.: Литтера, 2007. - 232 с.
5. Содержание дефензинов в крови при пневмониях у больных гриппом А/Н1N1 / Е.Н. Романова [и др.] // Медицинская иммунология. - 2012. - Т. 14, №3. - С. 239-242.
6. Antibacterial activity and specificity of the six human α-defensins / B. Ericksen [et al.] // Antimicrobial agents and chemotherapy. - 2005. - Vol. 49, №1. - P. 269-275.
7. Imatinib mesylate inhibits cell invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor induced by platelet-derived growth factor-BB / M. Aoki [et al.] // Laboratory Investigation. - 2007. - Vol.87. - Р. 767-779.
8. Human defensins / J.J. Schneider [et al.] // J. Mol. Med. - 2005. - Vol.83, №8. - P. 587-595.
9. Lee W.L., Downey G.P. Leukocyte elastase physiological functions and role in acute lung injury // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 2001. - Vol. 164. - P. 896-904.
10. Sumako Yoshioka, Hiroshi Mukae, Hiroshi Ishii. Alpha-defensin enhances expression of HSP 47 and collagen-1 in human lung fibroblasts // Life Sci. - 2007. - Vol. 20. - 17367817.

Несмотря на активное изучение, острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) остается одной из основных проблем современной реаниматологии. В связи с большим количеством и гетерогенностью причин механизмы развития синдрома изучены недостаточно, что затрудняют диагностику процесса, особенно его начальной стадии - фазы острого повреждения легких (ОПЛ). Основным звеном патогенеза ОПЛ является выраженная адгезия нейтрофилов к эндотелию сосудов малого круга кровообращения и инфильтрация ими паренхимы легких [4]. В итоге происходит гиперактивация полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) с высвобождением ферментов азурофильных гранул (эластазы, металлопротеиназ и др.) в экстраклеточное пространство. Вклад в развитие ОПЛ/ОРДС дисбаланса между секрецией нейтрофилами протеаз и их ингибированием активно изучается [1, 4, 9], при этом в тени остается роль таких многофункциональных пептидов, как дефензины.

Катионные антимикробные пептиды - α-дефензины - составляют 30-50% от общего содержания белка азурофильных гранул ПМЯЛ, также они обнаружены в NK-клет­ках, Т- и В-лимфоцитах, макрофагах, эпителиальных клетках [2]. Дефензины обладают микробицидным эффектом, участвуют в иммунных реакциях, репарации, свертывании крови. Исследование их в качестве потенциальных «антибиотиков животного происхождения» показало, что пептиды обладают неоднозначными дополнительными эффектами: оказывают токсическое действие в отношении собственных как трансформированных, так и неизмененных клеток [2, 3, 6, 8].

Изучение динамики содержания α-де­фен­зинов в крови в качестве возможного предиктора развития ОРДС дало неоднозначные результаты. Одни исследования свидетельствуют о повышении концентрации пептидов, которое авторы связывают с развитием системной воспалительной реакции [2]; другие, напротив, выявили разнонаправленные сдвиги, вплоть до уменьшения их содержания [5]. В связи с чем роль дефензинов в патогенезе респираторного дистресс-синдрома требует уточнения, при этом более точное представление можно получить, исследуя экспрессию пептидов непосредственно в месте развития процесса, т.е. в легких.

Цель работы: определить экспрессию α-дефензинов различными клетками в легких в зависимости от стадии развития экспериментального ОПЛ/ОРДС.

Материал и методы исследования

Модель ОПЛ/ОРДС воспроизводили по оригинальной методике на половозрелых нелинейных крысах-самцах, для чего животным путем пункции трахеи однократного вводили лизат 45-55 тысяч крысиных нейтрофилов в 0,15-0,20 мл физиологического раствора (заявка на изобретение РФ № 2010130728/14, решение о выдаче патента от 31.01.2012). Животных выводили из эксперимента путем передозировки кетамина на 1 (n = 25), 3 (n = 21) и 6 (n = 19) сутки эксперимента. Развитие ОПЛ/ОРДС во всех случаях подтверждали морфологически.

Иммуногистохимическое исследование выполнялось с использованием парафиновых срезов легочной паренхимы. Для определения экспрессии α-дефензинов использовали первичные антитела фирмы «Hycult biotech» (Нидерланды) в рабочем разведении 1:250. В качестве хромогена применялся 3,3-диаминобензидина тетрахлорид, входящий в коммерческий набор детекции SPD-125 («Spring bioscience», США). Дополнительная докраска клеточных ядер производилась раствором гематоксилина Гаррисона. Оценка экспрессии искомых антигенов проводилась с использованием светового микроскопа Olympus Cx 41. Уровень экспрессии α-дефензинов в исследуемом срезе определялся для всех продуцирующих клеток раздельно: производился подсчет не менее 100 целевых клеточных элементов, в 10 случайно выбранных полях зрения. В каждом поле зрения количественная оценка уровня экспрессии антигена оценивалась в баллах по следующей шкале. Экспрессия считалось отрицательной, если позитивных клеток было менее 10% в поле зрения; 1 балл - при наличии 10-25% клеток; 2 балла - 25-50% клеток; 3 балла - 50-75% клеток; 4 балла - в случае окрашивания более 75% клеток [7].

Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета программ BIOSTAT версии 3.03. При сравнении групп использовался критерий χ2, различия считали значимыми при р < 0,05. Результаты представлены в виде процентного содержания по отношению к исследованному числу полей зрения в срезе.

Результаты исследования и их обсуждение

При развитии экспериментального ОПЛ/ОРДС α-дефензины в разной степени экспрессировали 3 вида клеток: нейтрофилы, макрофаги и альвеолоциты.

В первые сутки эксперимента определялась острая (экссудативная) стадия развития синдрома, морфологический эквивалент непосредственно ОПЛ [4], которая характеризовалась проявлениями «острого неинфекционного диффузного альвеолита», с накоплением в просвете альвеол нейтрофилов, мононуклеарных клеток и других клеточных элементов, десквамированных эпителиоцитов, отечной жидкости. В просвете сосудов отмечались множественные нейтрофильно-лейкоцитарные агрегаты. Наблюдался выход и накопление эритроцитов в просвете альвеол. На этом фоне наибольшая экспрессия α-дефензинов отмечалась нейтрофилами (84% полей зрения суммарно), в меньшей степени макрофагами (57% полей зрения) и наименее выраженная - альвеолоцитами (17% полей зрения) (рис. 1, табл. 1).

Таблица 1 Уровень экспрессии α-дефензинов в 1 фазу ОПЛ/ОРДС (n = 25, 250 полей зрения)

Клетки

0 баллов (% полей зрения)

1-2 балла
(% полей зрения)

3-4 балла (% полей зрения)

Значение различий

Нейтрофилы

16,3

72,5

11,2

 

Макрофаги

42,6

53,7

3,7

р = 0,000*

Альвеолоциты

82,5

17,5

0

р = 0,000*

р1 = 0,000*

Примечания:

р - значение различий в сравнении с нейтрофилами;

р1 - значение различий в сравнении с макрофагами; * - значимые различия.

На 3 сутки эксперимента в легких микроскопически отмечалось разрешение от отека, регистрировались признаки миграции мононуклеарных клеток, пролиферации фибробластов и синтеза коллагена, что является характерным для пролиферативной фазы ОРДС [4]. В эту стадию синдрома содержание α-дефензинов по-прежнему наибольшим оставалось в ПМЯЛ, 68% полей зрения (табл. 2), но оно было значимо ниже, чем в 1 фазу процесса (р = 0,001). Экспрессия пептидов макрофагами, так же как и в 1 стадию ОПЛ/ОРДС, была меньшей, чем нейтрофилами (около 33% полей зрения), и значимо уменьшалась при сравнении с ее интенсивностью в начале процесса (р = 0,003). Содержание α-дефензинов в альвеолоцитах было наименьшим и не изменялось по сравнению с 1 фазой (р = 0,06) (рис. 2).

На 6 сутки от момента введения лизата в легких животных отмечались морфологические маркеры фибротической фазы ОРДС: увеличение объема соединительной ткани в интерстиции; изменения в интиме артериол в виде гипертрофии мышечного слоя, иногда вплоть до их полной облитерации; появление гиалиновых мембран [4]. В эту стадию экспрессия α-дефензинов всеми клетками была наименьшей, а ее уровень в макрофагах и альвеолоцитах стал одинаковым (табл. 3). При этом в сравнении со 2-й фазой ОПЛ/ОРДС содержание пептидов в макрофагах уменьшилось почти вдвое (р = 0,000), а их содержание в альвеолоцитах осталось прежним (р = 0,25).

Рис. 1. Микрофото легочной паренхимы: острая (экссудативная) стадия процесса: накопление воспалительного клеточного инфильтрата, представленного преимущественно мононуклеарами с примесью сегментоядерных нейтрофилов, десквамированных альвеолоцитов. Иммуногистохимическое окрашивание, хромоген - продукты реакции с диаминобензидином (позитивные элементы коричневого цвета), фоновое докрашивание гематоксилином Гаррисона. Увеличение х200

Рис. 2. Микрофото легочной паренхимы: ранняя пролиферативная фаза: разрешение от отека, миграция мононуклеарных клеток и пролиферации фибробластов. Иммуногистохимическое окрашивание, хромоген - продукты реакции с диаминобензидином (позитивные элементы коричневого цвета), фоновое докрашивание гематоксилином Гаррисона. Увеличение х400

Таблица 2 Уровень экспрессии α-дефензинов во 2-ю фазу ОПЛ/ОРДС (n = 21, 210 полей зрения)

Клетки

0 баллов (% полей зрения)

1-2 балла (% полей зрения)

3-4 балла (% полей зрения)

Значение различий

Нейтрофилы

32,2

43,2

24,6

 

Макрофаги

66,7

30,8

2,5

р = 0,000*

Альвеолоциты

81,7

18,3

0

р = 0,000*

р1 =

0,013*

Примечания: те же, что к табл. 1.

Таблица 3 Уровень экспрессии α-дефензинов в 3-ю фазу ОПЛ/ОРДС (n = 19, 190 полей зрения)

Клетки

0 баллов (% полей зрения)

1-2 балла (% полей зрения)

3-4 балла (% полей зрения)

Значение различий

Нейтрофилы

75,8

20,8

3,4

 

Макрофаги

88,3

11,7

0

р = 0,015*

Альвеолоциты

89,2

10,8

0

р = 0,011*

р1 = 0,98

Примечания: те же, что к табл. 1.

Полученные результаты свидетельствуют об участии α-дефензинов в патогенезе всех трех стадий развития ОПЛ/ОРДС. Известно, что дефензины, помимо микробицидной активности, обладают как про- так и противовоспалительными эффектами, вектор которых зависит от концентрации [2, 3, 8]. В 1 стадию процесса - фазу собственно ОПЛ - нами зафиксирована наибольшая локальная экспрессия α-дефензинов как за счет нейтрофилов (в большей степени), так и макрофагов. В этот момент в интерстициальном пространстве создавалась высочайшая концентрация дефензинов, сопряженная с их повреждающими эффектами. Доказано, что при достижении уровня более 50 мкг/мл α-дефензины индуцируют высвобождение ИЛ-8 и нейтрофил-активирующего белка 78 из эпителиальных клеток дыхательных путей, что приводит к дополнительному рекрутированию ПМЯЛ в очаг воспаления [2]. Избыточная аккумуляция нейтрофилов в легочной паренхиме и капиллярах приводит к формированию локального «протеазного взрыва» с повреждением компонентов сурфактанта, базальной мембраны альвеол, эндотелиоцитов. Кроме того, α-дефензины в высокой концентрации повышают проницаемость микроциркуляторного русла как на прямую, так и путем стимуляции дегрануляции тучных клеток [2, 3, 8]. Указанные механизмы в итоге приводят к выходу жидкой части крови в альвеолы и формированию отека легких.

Несмотря на уменьшение по сравнению с предыдущей фазой, в пролиферативную стадию ОРДС экспрессия α-дефензинов оставалась достаточно высокой: в 70% полей зрения по-прежнему регистрировались позитивные нейтрофилы и в 30% - макрофаги (табл. 2). Этот сдвиг, вероятно, приводит к торможению смены субпопуляций лейкоцитов в очаге воспаления легочной паренхимы (нейтрофилы продолжают кумулироваться), в итоге повреждение аэрогематического барьера усугубляется.

На 6 сутки эксперимента α-дефензины экспрессировались нейтрофилами почти в четверти полей зрения, а также в равной степени макрофагами и альвеолоцитами (около 12% полей зрения). Ранее сообщалось, что α-дефензины в малых концентрациях являются фиброгенными медиаторами и участвуют в патогенезе идиопатического нейтрофил-индуцированного фиброза легких, стимулируя синтез коллагена и его молекулярного шаперона HSP 47 фибробластами органа [10]. На наш взгляд, этот механизм и является основным триггером развития фибротической фазы ОРДС.

Невысокая экспрессия α-дефензинов альвеолоцитами во все стадии процесса, скорее всего объясняется тем, что основными антимикробными пептидами, которые синтезируют эпителиальные клетки респираторного тракта, являются β-субсемейство дефензинов [1]. Конститутивный тип синтеза α-дефензинов альвеолоцитами, скорее всего, является достаточным для антибактериального эффекта против попадаемых с воздухом микроорганизмов и предохраняет эпителий от самоповреждения.

Выводы

  1. При экспериментальном ОПЛ/ОРДС в легких α-дефензины экспрессируют нейтрофилы, макрофаги и альвеолоциты.
  2. В экссудативную фазу ОРДС (собственно ОПЛ) экспрессия α-дефензинов нейтрофилами и макрофагами самая значительная, в пролиферативную фазу она вдвое уменьшается, в фибротическую - наименьшая.
  3. Наибольший уровень экспрессии во все стадии синдрома характерен для нейтрофилов. Экспрессия пептидов альвеолоцитами во все стадии остается неизменной.

Рецензенты:

  • Бишарова Г.И. д.м.н., профессор, директор Читинского филиала ГУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН», г. Чита;
  • Патеюк А.В. д.м.н., профессор кафедры СПП и ППО ФГБОУ ВПО «Забайкальский государственный университет», г. Чита.

Работа получена редакцией 25.06.2012.


Библиографическая ссылка

Пруткина Е.В., Сепп А.В., Цыбиков Н.Н. АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ АЛЬФА-ДЕФЕНЗИНОВ В ЛЕГКИХ ПРИ РЕСПИРАТОРНОМ ДИСТРЕСС-СИНДРОМЕ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 7-2. – С. 385-389;
URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=30147 (дата обращения: 25.09.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074