Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Мухамадияров Р.А. 1 Веремеев А.В. 1 Марцияш Н.Е. 1 Зинчук В.Г. 1

---

1 НИИ комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний СО РАМН, Кемерово

В настоящее время одним из перспективных способов внутриклеточного направленного транспорта лекарственных средств является использование везикулярных наносистем – липосом. Однако до сих пор не решены вопросы стандартизации ‒ липосомальной композиции и возможности ee долговременного хранения. В настоящей работе использовали липосомы, приготовленные методами ультразвуковой сонификации и экструзии. Хранили полученные везикулы при 250 и 40°С. Оценивали накопление малонового диальдегида, диеновых и триеновых коньюгатов. Для везикул, полученных как методом экструзии, так и ультразвуковой сонификацией, повышение температуры хранения до 250°С способствует активации процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), что проявляется в накоплении продуктов липопероксидации. Везикулы, приготовленные методом экструзии, являются более стабильными к действию ПОЛ. Введение в состав липосомальной мембраны α-токоферола снижает образование диеновых, триеновых коньюгатов и малонового диальдегида. Таким образом, липосомы, приготовленные методом экструзии, в состав мембраны которых дополнительно введен α-токоферол, могут быть использованы как эффективная и безопасная лекарственная форма.

Статья в формате PDF

347 KB

липосомы

перекисное окисление липидов

α-токоферол

1. Безрукова А.Г., Розенберг О.А. Определение параметров липосом методом спектра мутности // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1981. – № 91.4. – C. 506–508.

2. Стальная И.Д. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты //Современные методы в биохимии / под. ред. В.Н. Ореховича. – М., 1977. – С. 66–68.

3. Fukuzawa K. Dynamics of lipid peroxidation and antioxidion of alpha-tocopherol in membranes // Journal of nutritional science and vitaminology. – 2008. – № 54(4). – P. 273–285.

4. Grattagliano I, Palmieri VO, Portincasa P, Moschetta A, Palasciano G. Oxidative stress-induced risk factors associated with the metabolic syndrome: a unifying hypothesis // The Journal of nutritional biochemistry. – 2008. – № 19(8). –

P. 491–504.

5. Mayer LD, Bally MB, Hope MJ, Cullis PR. Techniques for encapsulating bioactive agents into liposomes // Chemistry and Physics of Lipids.– 1986. – № 40. – P. 333–345.

6. Panwar P, Pandey B, Lakhera PC, Singh KP. Preparation, characterization and in vitro realize study of albendazol-encapsulated nanosize liposomes // International journal of nanomedicine. – 2010. – № 5. – P. 101–108.

7. Surendiran A., Sandhiya S., Pradhan S.C., Aditha C. Novel applications of nanotechnology in medicine // The Indian journal of medical research. – 2009. – № 130(6). – P. 689–701.

8. Tang L, Zhang Y, Qian Z, Shen X.The mechanism of Fe2+-initiated lipid peroxidation in liposomes: the dual function of ferrous ions, the roles of the pre-existing lipid peroxides and the lipid peroxyl radical // The Biochemical journal. – 2000. – № 352. – P. 27–36.

Наиболее распространенным и перспективным направлением использования везикулярных мембранных систем в биологии и медицине является создание липосомальных форм лекарственных препаратов [6, 7]. Однако широкому их применению препятствуют проблемы изменения физико-химических свойств мембран липосом при воздействии внешних факторов, таких как температура и время хранения, способ получения липосом. Очевидно, что одной из основных причин повреждения липосомальной мембраны является активация перекисного окисления липидов [8]. И поскольку наличие продуктов липопероксидации является определяющим в развитии повреждения мембраны и оказывает существенное влияние на их структуру и биологические свойства, то закономерно возникает вопрос о необходимости их стандартизации по содержанию продуктов перекиного окисления липидов (ПОЛ) и целесообразности включения антиоксидантных факторов в липидную фазу липосом.

В настоящем исследовании изучали влияние α-токоферола, включенного в липидную фазу, на динамику процессов липопероксидации в мембранах липосом, полученных методами экструзии и ультразвуковой сонификации, хранившихся при температуре 4 и 25°С.

Для приготовления липосом использовали фосфатидилхолин и холестерин в молярном соотношении 7:5 соответственно («стандартные» липосомы). В качестве антиоксидантного фактора использовали α-токоферол. Для приготовления липосом с α-токоферолом («α-ТФ» липосомы) соотношение фосфатидилхолин: холестерин: α-токоферол составило 6:3:1. Липосомы готовили методом экструзии («экструдерные липосомы») и методом ультразвуковой сонификации («ультразвуковые липосомы»). Весь материал разделили на четыре группы (табл. 1): «стандартные» экструдерные липосомы (I группа); «стандартные» ультразвуковые липосомы (II группа); «α-ТФ» экструдерные липосомы (III группа); «α-ТФ» ультразвуковые липосомы (IV группа). Хранили липосомы при температуре 4 и 25°С. В каждой группе определяли содержание диеновых и триеновых коньюгатов, малонового диальдегида. Детекцию продуктов ПОЛ проводили через 3, 24, 48 и 72 часа.

В колбу ротационного испарителя ИР-1М2 помещали раствор липидов, приготовленный на перегнанном хлороформе. Раствор упаривали в вакууме при температуре 55°С. После чего заливали буферный раствор (0,1 М трис-HCl, рН 7,4) либо раствор, содержащий соответствующее действующее вещество. Колбу интенсивно встряхивали в присутствии стеклянных шариков.

Озвучивание проводили с использованием ультразвукового дезинтегратора («type UD-20», TECHPAN, Польша). Суспензию мультиламелярных везикул помещали в толстостенный стеклянный стакан. Наконечник излучателя погружали непосредственно в суспензию и проводили «озвучивание» в течение 4-5 мин. Осаждали сохранившиеся мультиламелярные везикулы методом центрифугирования в рефрижераторной центрифуге 10000 g в течение 15 мин. Размер липосом контролировали по спектру мутности [4].

Перед экструзией для достижения максимального включения действующих веществ вводили дополнительную стадию гидратации липидов методом 5-кратного замораживания-оттаивания, рекомендуемую разработчиками метода [5]. Экструзию проводили 10-кратно через полкарбонатные фильтры Costar с размером пор 0,1 мкм (экструдер Lipex Biomembranes Inc., Канада).

МДА определяли стандартным методом [2] с помощью α-тиобарбитуровой кислоты (ТБК). В пробирки к смеси 1,5 мл 2% Н₃РО₄ и 0,5 мл 0,8% ТБК добавляли 0,05 мл раствора липосом и 45 мин кипятили на водяной бане, охлаждали. В контрольный образец вместо липосом добавляли дистиллированную воду. Смесь экстрагировали в 2 мл бутанола и центрифугировали 10 мин. Экстракт фотометрировали при длине волны 535 нм в кюветах с оптическим путем 10 мм. Активность вычисляли по формуле:

A = D_ОП·4/1,56·10⁵·0,05·25 ммоль/мг липида.

Для оценки содержания диеновых и триеновых коньюгатов использовали индекс Клейна (Klein). По этому методу ДК и ТК оцениваются по соотношениям оптической плотности D₂₃₃/D₂₁₅ и D₂₆₈/D₂₁₅ соответственно. Для этого 20 мкл препарата разбавляли в 2 мл этанола. Фотометрировали при длинах волн 215, 238 и 268 нм против этанола.

Статистическую обработку результатов эксперимента проводили с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0. Для описания признаков с отличным от нормального распределением указывали медиану и межквартильный размах - 25-й и 75-й процентилей. В качестве критерия сравнения выбирали дисперсионный анализ (ANOVA) для зависимых и независимых выборок. Различия считали достоверными при уровне значимости менее 0,05.

Результаты проведенных исследований показали, что исходный уровень и дальнейшая динамика накопления продуктов ПОЛ в липосомах зависят, как минимум, от трех факторов: липидного состава мембраны, способа получения и температуры хранения препарата. Безусловно, это не исключает потенциального наличия других факторов, влияющих на данные показатели [1].

Так, влияние способа получения липосом на показатели ПОЛ было отчетливо продемонстрировано при изучении динамики накопления вторичного продукта оксидации - МДА. Исходная концентрация МДА в группах липосом, полученных методом ультразвуковой сонификации (II₄ и II₂₅), почти в 3 раза превышала данный показатель в «экструдерных» липосомах (I₄ и I₂₅) (рис. 1).

Отмечена прямая зависимость накопления МДА от температуры хранения липосомальных препаратов. Так, на протяжении всего периода наблюдения происходило значительное нарастание концентрации МДА в липосомах II₂₅ и I₂₅ групп в 1,3 и 2,9 раза (р < 0,05) соответственно. В то же время содержание данного продукта к 72 часу в группах I₄ и II₄ достоверно (р > 0,05) не отличалось от исходных показателей. Кроме того, в группе II₄ имело место достоверное (p < 0,05) снижение концентрации МДА на первые и вторые сутки наблюдения.

Введение в состав липосомальной мембраны α-токоферола снижало накопление МДА вне зависимости от способа получения липосом. Так, исходные значения содержания МДА в группах III₄, III₂₅ и IV₄, IV₂₅, были в 2,5-9 раз ниже (р < 0,05), чем в I₄, I₂₅ и II₄, II₂₅ группах соответственно. Известно, что α-токоферол является ловушкой электронов и свободных радикалов, следовательно он работает как антиоксидант преимущественно на начальных стадиях процесса окисления липидов [3]. Поэтому можно предполагать, что, будучи в составе липосом, α-токоферол исключает негативное влияние свободных форм кислорода и других возможных прооксидантных факторов, сопровождающих процесс получения липосомальных препаратов.

Необходимо также отметить, что внутри блока «α-ТФ липосом» достоверных различий между группами не наблюдали (р > 0,05) вплоть до 48 часа наблюдения. В дальнейшем отмечали резкое увеличение концентрации МДА в группах III₂₅ и IV₂₅ - в 2,8 раза для обеих групп по сравнению с исходными величинами (р < 0,05), что, вероятно, обусловлено температурозависимой интенсификацией процессов ПОЛ и связанным с ней расходом пула α-токоферола.

В группах α-ТФ липосом, хранившихся при 4°С (III₄ и IV₄) концентрация МДА на всем протяжении эксперимента достоверно (р > 0,05) не отличалась от исходных показателей.

Несколько иная динамика была отмечена для другого вторичного продукта ПОЛ - триеновых коньюгатов (рис. 2). Исходная концентрация данного метаболита в липосомах II_4,25 групп (УЗС липосомы) была достоверно (р < 0,05) выше в 1,4 раза по сравнению с показателями I_4,25 групп (экструдерные липосомы). Максимальный уровень ТК был отмечен во II₂₅ и I₂₅ группах к третьим суткам наблюдения. Эти показатели более чем в 2 раза превышали исходный уровень (р < 0,05). Низкий уровень ТК наблюдали в I₄ и II₄ группах, где конечная концентрация превышала исходные значения лишь в 1,6 и 1,5 раза (р < 0,05) соответственно. В связи с этим можно сделать вывод о преимущественно термозависимом механизме накопления ТК в «стандартных» липосомах.

Для липосом, в состав которых включали α-токоферол, наблюдали следующие закономерности: исходная концентрация ТК практически не зависела от способа приготовления и температуры хранения. Кроме того, до 24 часов наблюдали недостоверную тенденцию к снижению уровня данного показателя во всех группах эксперимента. Только ко вторым суткам в группах III₂₅, IV₄ и IV₂₅ наблюдали достоверное (р < 0,05) нарастание концентрации ТК в 1,2 раза с дальнейшим выходом на плато, вплоть до 72 часов. В группе III₄ уровень данного метаболита к этому периоду достоверно не отличался (р > 0,05) от исходных показателей.

Важно отметить, что присутствие α-токоферола в мембране липосом предотвращало накопление ТК в течение всего периода исследования, о чем свидетельствуют достоверно (р < 0,05) меньшие в 0,5-2,5 раза значения в группах III_4,25 и IV_4,25 относительно показателей в группах I_4,25 и II_4,25.

Способностью α-токоферола гасить свободные радикалы можно объяснить и закономерности, полученные при изучении динамики накопления диеновых коньюгатов.

Так, исходный уровень ДК в «стандартных» липосомах был несколько выше, чем в «α-ТФ липосомах» (рис. 3).

Ко вторым суткам концентрация ДК в «стандартных» липосомах достоверно (р < 0,05) возрастала по сравнению с исходной, и эта тенденция сохранялась до третьих суток.

В то же время в «α-ТФ» липосомах достоверное увеличение уровня ДК было отмечено лишь в IV₂₅ группе, причем процесс нарастания ДК начался уже в первые сутки. В других группах достоверного увеличения ДК отмечено не было, более того, в липосомах, хранившихся при 4°С, вне зависимости от способа получения, в первые сутки было выявлено достоверное (р < 0,05) уменьшение концентрации ДК.

Таким образом, для липосом, полученных как методом экструзии, так и ультразвуковой сонификацией, повышение температуры хранения до 25°С способствует активации процессов ПОЛ, что проявляется в накоплении диеновых и триеновых коньюгатов, а также МДА. Липосомы, приготовленные методом экструзии, являются более резистентными к действию прооксидантных факторов. Введение в состав липосом α-токоферола стабилизирует липосомальную мембрану к воздействию ПОЛ, что проявляется значительно более низкими концентрациями маркеров ПОЛ на протяжении всего периода наблюдения.

• Плотников М.Б., д.б.н., руководитель лаборатории фармакологии кровообращения ФБГУ «Научно-исследовательский институт фармакологии» СО РАМН, г. Томск;
• Григорьев Е.В., д.м.н., заместитель директора по научной и лечебной работе, заведующий лабораторией критических состояний ФБГУ «Научно-исследовательский институт проблем сердечно-сосудистых заболеваний» СО РАМН, г. Кемерово.

Работа поступила в редакцию 09.04.2012.

Библиографическая ссылка