Важнейшей проблемой современной медицины стало массовое распространение лекарственной устойчивости у условно-патогенных бактерий и грибов.
Одним из решений этой проблемы является создание новых антимикробных лекарственных препаратов и разработка способов преодоления их лекарственной устойчивости.
Кроме того, современное состояние фармацевтического рынка (из-за присутствия большого количества дженериков) часто дезориентирует врача в плане выбора оптимального антибиотика, а высокая стоимость наиболее эффективных из них уменьшает спектр используемых антимикробных средств и часто обусловливает возврат к уже апробированным, ставшими «традиционными», препаратам, применение которых уже не дает ожидаемых результатов.
Выбрать идею (направление исследований) помог случай, когда по ошибке диски с антибиотиками были помещены на поверхность свежеприготовленной питательной среды Эндо с культурой полирезистентного штамма лактозонегативных эшерихий (среда была схожа по цвету с мясопептонным агаром и чашки Петри с ней не были промаркированы лаборантом). Интерес вызвали необычно большие диаметры зон задержки роста культуры: для тетрациклина - 52 мм, эритромицина (к которому штамм был резистентен) - 19 мм. Полученные данные о потенцировании действия антибиотиков в использованных условиях проведения опыта побудили нас рассмотреть компоненты питательной среды Эндо на предмет синергидного действия с препаратами тетрациклинового, пенициллинового ряда, макролидами и левомицетином (к ним большинство условно-патогенных энтеробактерий, выделенных от больных в г. Самаре, были резистентны). Таковым оказался фуксин.
Цель исследования - создание универсального способа преодоления лекарственной резистентности микробов на основе комбинированного применения антимикробных препаратов (к которым микробы резистентны) в средних терапевтических дозах и анилиновых красителей (метиленового синего, бриллиантового зеленого и фуксина) в субингибирующих концентрациях.
Материал и методы исследования
Чувствительность условно-патогенных микробов к различным вариантам комбинированных антимикробных рецептур определялась у 1062 антибиотикорезистентных штаммов диско-диффузионным методом, руководствуясь общепринятыми методиками [3; 4], инструкциями производителей бумажных дисков.
Красители (метиленовый синий, бриллиантовый зеленый, фуксин) вводили в расплавленные плотные питательные среды при температуре 45‒46 °С. Разведения метиленового синего и бриллиантового зеленого готовили в стерильной дистиллированной воде, начиная с 1 % растворов. Фуксин разводили в этаноле (96 %) до концентрации 1 %, последующие разведения производили стерильной дистиллированной водой и сразу же добавляли в питательную среду.
При подборе субингибирующих концентраций красителей в питательном агаре делали лунки с помощью фламбированных металлических цилиндров диаметром 10 мм. Затем дно лунок заливали той же питательной средой (слоем 1‒1,5 мм) в целях предупреждения затекания раствора красителя под агаровую пластинку в чашке Петри. Измерение диаметров зон подавления роста микробов проводили штангенциркулем.
Для планирования эксперимента по выбору оптимального соотношения антимикробного препарата и анилинового красителя использовали метод оптимизации процесса по схеме ортогональных латинских прямоугольников: 2 фактора на трех уровнях [1].
Результаты исследования и их обсуждение
Исследования планировалось провести в два этапа:
- на первом предстояло выбрать ориентировочные минимальные подавляющие концентрации анилиновых красителей для математического планирования последующих экспериментов;
- на втором установить оптимальные концентрации красителей с помощью метода ортогональных латинских прямоугольников.
1-й этап
При проведении экспериментов было также установлено, что различные штаммы одного и того же вида бактерий имеют различия в минимальных подавляющих концентрациях (мпк) анилиновых красителей, поэтому в табл. 1 приведены минимальные и максимальные величины.
Таблица 1
Значения мпк анилиновых красителей в отношении бактерий и грибов, %
Исследованные микробы |
Минимальные и максимальные значения мпк |
||
фуксин основной |
метиленовый синий |
бриллиантовый зеленый |
|
Энтеробактеры (spp.) (n = 5) |
0,00500-0,01000 |
0,00250-0,00500 |
0,00250-0,00500 |
Золотистый стафилококк (n = 5) |
0,00250 |
0,00250-0,00500 |
0,00125-0,00250 |
Эпидермальный стафилококк (n = 7) |
0,00125-0,00500 |
0,00250-0,00500 |
0,00125-0,00250 |
Коринебактерии (spp.) (n = 5) |
0,00125-0,00250 |
0,00125-0,00250 |
0,00063-0,00125 |
Клебсиеллы (spp.) (n = 5) |
0,00250-0,01000 |
0,00250-0,01000 |
0,00125-0,00500 |
Грибы Candida albicans (n = 12) |
0,00250-0,01000 |
0,00125-0,00250 |
0,00125-0,00500 |
Как видно из табл. 1, для большинства исследованных микроорганизмов межштаммовые различия в мпк анилиновых красителей незначительны (не более, чем в 2 раза). Обращает на себя внимание необходимость использования для подавления роста этих микробов и энтеробактеров более высоких концентраций фуксина и бриллиантового зеленого, чем в отношении стафилококков и коринебактерий.
Учитывая, что при математическом планировании экспериментов будет использовано несколько уровней концентраций анилиновых красителей, представленные в табл. 1 данные указывают на целесообразность выбора в качестве «средних» величин следующих значений: для бриллиантового зеленого - 0,00063 %; для метиленового синего и фуксина - 0,00125 %.
2-й этап
Для антибиотиков и других антимикробных лекарственных средств в качестве уровней их концентрации в жидкой питательной среде выбрали следующие значения:
- минимальные, соответствующие средним терапевтическим дозам (к ним микроб чувствителен);
- средние, соответствующие максимальным терапевтическим дозам (к ним микроб промежуточен по чувствительности);
- максимальные (при них микроб считается резистентным).
При проведении экспериментов с использованием плотной питательной среды в качестве среднего уровня содержания антимикробных препаратов были приняты 20 мг (соответствует таковому в стандартных бумажных дисках). Минимальные и максимальные отличались от среднего в 2 раза.
Результирующим признаком выбрали величины зон подавления роста полирезистентных клинических изолятов бактерий (золотистого и эпидермального стафилококка, коринебактерий, клебсиеллы, энтеробактера) и грибов Candida albicans на плотной питательной среде, мм, при использовании бумажных дисков с различным содержанием антимикробного препарата, либо количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл жидкой питательной среды через 1 сутки культивирования.
Полученные результаты в табл. 2‒4 показывают, что увеличение содержания антимикробных препаратов приводило к повышению ингибирования роста различных микроорганизмов (исключение составляло только действие левомицетина в жидкой питательной среде). В плотной питательной среде такое же явление наблюдалось в действии на бактерии анилиновых красителей, сочетавшихся с цефазолином, тетрациклином и фурагином. А у красителей закономерности «доза - эффект» не наблюдалось. Это было дополнительным доказательством, что выбранные концентрации данных веществ действительно были субингибирующими и самостоятельного антимикробного действия не проявляли.
Таблица 2
Результаты эксперимента с бактериями по схеме ортогонального латинского прямоугольника 2×3 в плотной питательной среде, мм
Факторы |
Уровни факторов |
Эффекты уровней факторов при подавлении бактерий |
|||||
Klebsiella pneumoniae (БрЗ) |
Enterobacter agglomerans (БрЗ) |
Staphylococcus epidermidis (МС) |
|||||
цефазолин |
ципрофлоксацин |
цефазолин |
тетрациклин |
ципрофлоксацин |
фурагин |
||
Антимик-робный препарат |
I II III |
+6,3 -0,4 -5,7 |
+5,6 +0,6 -6,1 |
+10,6 -1,0 -2,4 |
+3,6 -0,8 -2,8 |
+4,9 -1,1 -3,7 |
+5,6 -0,1 -5,4 |
Краситель |
I II III |
+1,6 -0,7 -0,7 |
+0,2 +2,9 -3,1 |
+0,6 +1,6 -2,4 |
+2,2 +0,6 -2,8 |
-1,4 -0,3 +1,2 |
+0,3 -0,1 -0,2 |
Примечания:
1. Количество повторностей опыта - 3.
2. БрЗ - бриллиантовый зеленый, МС - метиленовый синий.
Таблица 3
Результаты эксперимента с бактериями по схеме ортогонального латинского прямоугольника 2×3 в жидкой питательной среде, в колониеобразующих единицах
Факторы |
Уровни факторов |
Эффекты уровней факторов при подавлении бактерий |
||||||||
Corynebacterium urealyticum |
Staphylococcus aureus |
Staphylococcus epidermidis |
||||||||
Гентамицин + МС |
Эритромицин + Ф |
Эритромицин + Брз |
Гентамицин + МС |
Гентамицин + Брз |
Ципрофлоксацин + Брз |
Левомицетин + МС |
Левомицетин + Брз |
Фурагин + МС |
||
Антимикробный препарат |
I II III |
-205 -89 +294 |
-165 +24 +142 |
-22 -17 +39 |
-10 -10 +20 |
-7 -7 +14 |
-87 +6 +81 |
+46 -30 -17 |
+6 +9 -15 |
-23 +7 +16 |
Краситель |
I II III |
-34 +4 +31 |
-146 +18 +129 |
-4 -4 +8 |
+9 -5 -4 |
+8 -5 -3 |
+72 +40 -112 |
+30 -14 -16 |
+20 -47 +26 |
-53 +32 +21 |
Примечания:
1. Количество повторностей опыта - 3.
2. БрЗ - бриллиантовый зеленый, МС - метиленовый синий, Ф - фуксин.
Таблица 4
Результаты эксперимента с грибами Candida albicans по схеме ортогонального латинского прямоугольника 2×3 в плотной питательной среде, мм
Факторы |
Уровни |
Эффекты уровней факторов при подавлении грибов, резистентных к антимикотикам |
||
флуконазол |
итраконазол |
кетоконазол |
||
Антимикробный препарат |
I II III |
+4,6 +1,3 -6,0 |
+5,3 +0,9 -6,1 |
+6,6 +1,6 -7,9 |
Метиленовый синий |
I II III |
-0,7 +1,6 -1,0 |
+0,2 -0,4 +0,3 |
-0,9 -0,2 +1,1 |
Примечание. Количество повторностей опыта - 3.
Основываясь на полученных данных, было принято решение - применять в последующих исследованиях анилиновые красители в максимальных (из испытанных) субингибирующих концентрациях (местно) и минимальных (парентерально и per os): метиленовый синий - 0,0025 % (местно) и 0,00063 % (парентерально и per os); бриллиантовый зеленый - 0,00125 % (местно); фуксин основной - 0,0025 % (местно).
Выводы
Таким образом, в результате проведенных исследований разработан новый способ преодоления лекарственной устойчивости микроорганизмов к антимикробным препаратам с различным механизмом действия путем их комбинированного применения с анилиновыми красителями. При этом один компонент (вспомогательный, т.е. анилиновый краситель, применяемый в субингибирующей концентрации) обеспечивает эффективность другого (основного, к которому резистентен микроорганизм). Отмечается синергидное взаимодействие компонентов комбинированного препарата [2].
Нами сформулированы основные положения разработанного способа преодоления лекарственной устойчивости бактерий и грибов:
1. Потенцирование действия антимикробных препаратов, к которым устойчивы микробы, путем их совместного применения с анилиновыми красителями.
2. Использование красителей в субингибирующих концентрациях, при которых отсутствует их самостоятельное антимикробное действие.
3. Универсальность, заключающаяся в возможности преодоления резистентности различных микроорганизмов (бактерий, грибов) к препаратам разных групп (антибиотикам, фторхинолонам, нитрофуранам, антимикотикам).
Рецензенты:
Кулагин О.Л., д.м.н., профессор, профессор кафедры фармакологии ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, г. Самара;
Жестков А.В., д.м.н., профессор, зав. кафедрой микробиологии ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, г. Самара.
Работа поступила в редакцию 10.08.2011.
Библиографическая ссылка
Абдалкин М.Е. НОВЫЙ УНИВЕРСАЛЬНЫЙ СПОСОБ ПРЕОДОЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ // Фундаментальные исследования. – 2011. – № 10-2. – С. 247-250;URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=28786 (дата обращения: 17.08.2024).