Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы

Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М., Молодых Н.А., Клинникова М.Г., Молодых О.П.

Изучена структурная реорганизации миокарда крыс при введении доксорубицина и тритерпеноидов (бетулоновой кислоты и ее β-аланиламида). Показано, что доксорубицин вызывает значительные некробиотические повреждения кардиомиоцитов, их гибель, обусловливая уменьшение массы сердца и общей численности кардиомиоцитов. Одновременно происходит значительное уменьшение репликативного пула миокарда – доли одноядерных кардиомиоцитов. При введении бетулоновой кислоты и ее β–аланиламида в схему химиотерапии отмечаются сходные морфофункциональные изменения миокарда, но степень выраженности изменений массы сердца, общей численности КМЦ и доли одноядерных клеток различна. При использовании обоих тритерпеноидов после однократного введения доксорубицина численность кардиомиоцитов в сердце снижается в меньшей степени, чем только после введения одного цитостатика. Установленная возможность восстановления численности кардиомиоцитов после воздействия кардиотоксическими препаратами и изменения соотношения одно- и двуядерных кардиомиоцитов под действием тритерпеноидов может способствовать развитию новых технологий стимулирования клеточных форм регенерации кардиомиоцитов при сердечной патологии.

Статья в формате PDF

300 KB

Кардиотоксические эффекты веществ с противоопухолевой активностью, в первую очередь, антрациклиновых антибиотиков, связаны с развитием необратимой кардиомиопатии и сердечной недостаточности в течение длительных сроков после окончания лечения [4, 9]. В последнее время ведутся поиск и разработка протективных и регенераторных технологий, снижающих кардиотоксическое действие и повышающих переносимость традиционной химиотерапии [3, 6, 10]. Одним из таких путей является поиск новых биологически активных агентов растительного происхождения, которые обычно обладают комплексной активностью (органопротекторной, антиоксидантной, противовоспалительной и иммуномодулирующей) и лучше переносятся организмом. К таким соединениям относятся тритерпеноиды лупанового ряда, в частности бетулоновая кислотя и ряд ее производных, обладающих широким спектром биологической активности, что позволяет использовать их в клинической практике [6].

Для оценки кардиотоксических и цитопротекторных эффектов цитостатиков и возможных корректоров/модификаторов биологических реакций большое значение имеет выяснение характера и выраженности повреждений тканей и клеток, форм их регенерации на основе комплексного морфологического анализа.

Цель исследования - сравнительное изучение характера структурной реорганизации миокарда экспериментальных животных при действии доксорубицина и тритерпеноидов (бетулоновой кислоты и ее аланиламида) с оценкой общей численности кардиомиоцитов в сердце как интегрального показателя выраженности регенераторных реакций.

Материал и методы исследования

Исследования проведены на 60 крысах-самцах Вистар, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Все эксперименты проведены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г.

Комплексный морфологический анализ миокарда крыс Вистар выполнен при моделировании доксорубициновых повреждений и при использовании производных бетулина - бетулоновой кислоты (3-оксо-20(29)-лупен-28-овая кислота) и ее β-аланиламида ([3-оксо-20(29)-лупен28-оил]-3-аминопропионовая кислота), синтезированных в лаборатории медицинской химии Новосибирского института органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН [6].

Животные были разделены на 6 экспериментальных групп. Животным 1-й группы (n = 10) вводили однократно внутрибрюшинно доксорубицин (ДОК) («ЛЭНС-Фарм», Москва) в дозе 7 мг/кг. Животным 2-й группы (n = 12) через 1 сут после однократного внутрибрюшинного введения ДОК ежедневно внутрижелудочно вводили водно-твиновый раствор бетулоновой кислоты (БК) в дозе 50 мг/кг. Крысам 3-й группы (n = 12) через 1 сут после однократного внутрибрюшинного введения ДОК ежедневно вводили водно-твиновый раствор амида БК в дозе 50 мг/кг. Животным 4-й группы (n = 10) вводили ежедневно водно-твиновый раствор БК в той же дозе, а животным 5-й группы (n = 10) - ежедневно раствор амида БК. Контрольной (6-й) группе животных (n = 6) внутрибрюшинно однократно вводили физиологический раствор в соответствующем их массе тела объеме, а затем ежедневно внутрижелудочно вводили воду. Половину животных всех групп декапитировали с использованием эфирного наркоза через 3 сут, другую половину - через 14 сут после введения препаратов.

После вскрытия грудной клетки сердце быстро отделяли от окружающих тканей и взвешивали, для получения парафиновых срезов образцы фиксировали в 10 %-м растворе нейтрального формалина и для получения полутонких срезов - в 4 %-м растворе параформальдегида. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином с постановкой реакции Перлса и по ван Гизону. Полутонкие срезы окрашивали 1 %-м раствором азура II. Исследование и морфометрический анализ (измерение диаметра КМЦ) проводили в универсальном микроскопе «Leica DM 4000B» с использованием цифровой фотокамеры «Leica DFC 320» и компьютерной программы «Leica QWin».

Для количественной оценки общей популяции КМЦ в сердце применяли метод щелочной диссоциации фиксированных тканей [1]. Кроме общей численности КМЦ в сердце определяли количественное соотношение одно-, дву- и многоядерных (3 и более ядер) КМЦ. Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

Морфологические изменения миокарда через 3 сут после однократного введения ДОК (1-я группа) проявлялись в выраженных нарушениях кровообращения и значительных литических изменениях одних КМЦ и контрактурных повреждениях других. Морфологическими эквивалентами литических повреждений КМЦ на светооптическом уровне являются нарушение компактной упаковки и разрежение миофибрилл, выраженное просветление цитоплазмы, образование очагов «опустошения», преимущественно вблизи ядер. Наблюдался некроз и некробиоз отдельных КМЦ со скоплениями в данных участках мононуклеаров. Нарушения кровообращения в виде значительного венозного полнокровия и развития выраженного межволоконного и интерстициального отека способствовали разволокнению миокарда.

Анализ абсолютного числа КМЦ в сердце выявил снижение этого параметра (на 13 %, р < 0,05), что сопровождалось изменением соотношения одно- и двуядерных КМЦ, а именно уменьшением доли одноядерных клеток (на 4,1 %) и соответствующим увеличением доли двуядерных клеток (таблица). Снижение абсолютной численности КМЦ обусловлено кардиотоксическим эффектом этого препарата и гибелью клеток преимущественно путем апоптоза [4]. По нашим данным и результатам других исследователей [3, 7], одноядерные КМЦ сохраняют способность вступать в клеточный цикл, завершающийся кариокинезом, что приводит к снижению их количества и соответственно, к увеличению пула двуядерных КМЦ. Снижение доли одноядерных КМЦ может свидетельствовать об истощении регенераторных резервов миокарда. Важно отметить, что снижение общей численности КМЦ и уменьшение их размеров (снижение диаметра КМЦ на 11 %) вызывало снижение массы сердца (на 6 %) без изменений массы тела.

Через 14 сут после воздействия ДОК литические повреждения КМЦ и интерстициальный отек сохранялись, у некоторых животных - усиливались. В результате гибели КМЦ формировались мелкие очаги кардиосклероза. Происходило дальнейшее снижение общей численности КМЦ и доли одноядерных клеток (соответственно на 40 %, р < 0,05, и 4,8 %, р < 0,01); диаметр КМЦ снижался на 25 %. Эти изменения вызывали существенное уменьшение массы сердца (на 24 %, р < 0,05) и свидетельствовали о выраженном кардиотоксическом эффекте данного антрациклинового антибиотика даже через 2 недели после его введения.

Морфометрический анализ и количественная оценка популяции кардиомиоцитов в сердце крыс Вистар после воздействия доксорубицина и производных бетулина (M ± m)

Примечание. ДОК - доксорубицин, БК - бетулоновая кислота, АБК - амид бетулоновой кислоты. * - p < 0,05, ** - p < 0,01 при сравнении с контролем.

Уменьшение диаметра КМЦ (атрофические изменения) связано с нарушением воспроизводства внутриклеточных структур, т.е. пластическим обеспечением функций мышечных клеток сердца в результате снижения или подавления синтеза белков под действием ДОК. Сердечную недостаточность, которая развивается в подобных случаях, мы расцениваем как регенераторно-пластическую недостаточность [4]. К основным типам повреждения КМЦ при регенераторно-пластической недостаточности относятся литические изменения с редукцией миофибриллярных пучков, основным видом клеточной гибели является апоптоз. Повреждения и гибель КМЦ носят диффузный характер и при хроническом течении сопровождаются развитием диффузного или мелкоочагового кардиосклероза. Ремоделирование сердца при хронической регенераторно-пластической недостаточности проходит, как правило, по дилатационному варианту, что является причиной развития застойной сердечной недостаточности в отдаленные сроки после противоопухолевого лечения [2].

После введения ДОК и последующего применения БК (2-я группа) в миокарде крыс Вистар через 3 сут присутствовали КМЦ как с литическими, так и контрактурными повреждениями миофибрилл, при этом многие КМЦ сохраняли свои тинкториальные свойства. В некоторых зонах миокарда наблюдался некробиоз КМЦ и развитие заместительного кардиосклероза. Как и в 1-й группе, регистрировались нарушения гемодинамики в виде полнокровия сосудов, интерстициального отека, значительного в некоторых зонах миокарда. Общая численность КМЦ в сердце у крыс этой группы была снижена в меньшей степени, чем в 1-й группе (на 4 %), но доля одноядерных клеток была уменьшена в той же степени (на 4,4 %). В большей степени уменьшались размеры КМЦ, о чем свидетельствовало заметное уменьшение их диаметра (на 18 %, р < 0,05) (см. таблицу). Именно это обстоятельство обусловило наиболее значительное снижение массы сердца в этот срок эксперимента (на 16 %, р < 0,05) среди всех исследованных групп.

Через 14 сут у крыс этой группы морфологические изменения литические и контрактурные повреждения КМЦ сохранялись, но становились менее выраженными. В некоторых участках в результате гибели КМЦ формировались мелкие очаги кардиосклероза. Здесь же наиболее выраженными были явления интерстициального отека. Одновременно в разных зонах миокарда регистрировались кластеры «малых» одноядерных или двуядерных КМЦ с близко расположенными ядрами, которые мы относим к новообразованным клеткам. Общее количество КМЦ в сердце резко снижалось (на 27 %), но доля одноядерных КМЦ восстанавливалась почти до уровня контроля. Следовательно, можно говорить о восстановлении пула этих клеток, то есть о восстановлении репликативного резерва миокарда. В то же время размеры КМЦ оставались уменьшенными (диаметр был снижен на 11 %), что обусловливало сохранение уменьшенной массы сердца (на 14 %, р < 0,05) в этот период эксперимента.

После введения ДОК и последующего применения амида БК (3-я группа) через 3 сут эксперимента в миокарде также регистрировались КМЦ с литическими и контрактурными повреждениями, отмечалось полнокровие сосудов, в некоторых участках - выраженный интерстициальный отек, приводящий к разволокнению ткани. В целом морфологические изменения миокарда были сходными с таковыми у животных 2-й группы. В миокарде также появлялись «малые» кардиомиоциты с митотически делящимися ядрами. Общая численность КМЦ в этой группе не изменялась по сравнению с контролем, однако доля одноядерных КМЦ снижалась (на 5 %, р < 0,05). Размеры КМЦ в этой группе снижались в меньшей степени (на 7 %), чем в других группах с введением ДОК. Масса сердца соответственно сохранилась на уровне контроля, а масса тела увеличилась (на 10 %, р < 0,05).

Через 14 сут у крыс 3-й группы выраженное полнокровие сосудов и интерстициальный отек сохранялись в основном во внутреннем слое миокарда стенки левого желудочка. Тамже регистрировались наиболее распространенные литические и контрактурные повреждения КМЦ. Так же встречались кластеры «малых» КМЦ, что свидетельствовало о сохранении клеточной формы регенерации. Общая численность КМЦ и доля одноядерных КМЦ были уменьшены незначительно (соответственно на 6 и 4,5 %, р < 0,05). Диаметр КМЦ восстанавливался до контрольного уровня, что способствовало сохранению массы сердца.

При введении только БК (4-я группа) и только АБК (5-я группа) через 3 сут отмечались сходные изменения миокарда: большинство клеток сохраняло нормальные морфологические и тинкториальные свойства, но регистрировались КМЦ с контрактурными и литическими изменениями. Нарушения гемодинамики проявлялись в виде полнокровия сосудов, сладжа эритроцитов, наблюдались очаги гемо- и плазморрагий, интерстициальный отек был умеренным. В миокарде регистрировались «малые» КМЦ с близко расположенными ядрами, что можно считать морфологическим эквивалентом прошедшего кариокинеза. При этом общая численность КМЦ в сердце несколько увеличивалась (соответственно на 2 и 8 %), а доля одноядерных КМЦ снижалась (на 4,5 и 5,4 %, р < 0,05), что могло отражать усиление кариокинеза. Диаметр КМЦ существенно не изменялся (см. таблицу). Все это в целом способствовало сохранению массы сердца на уровне контрольных значений.

Через 14 сут после применения тритерпеноидов в миокарде возрастало количество некробиотически измененных КМЦ, ядра таких клеток часто смещались в подсарколеммальную зону. Следует отметить возрастание количества как атрофированных, так и гипертрофированных КМЦ. Гемодинамические нарушения (преимущественно полнокровие) сопровождались умеренной диффузной инфильтрацией стромы миокарда мононуклеарами; у некоторых животных развивался диффузный и мелкоочаговый кардиосклероз. Общая численность КМЦ в сердце у крыс 4-й группы в этот срок была несколько снижена (на 10 %), но доля одноядерных клеток восстанавливалась до уровня контроля. У крыс 5-й группы общая численность КМЦ соответствовала контрольным значениям, а доля одноядерных КМЦ даже возрастала (на 2 %). Эти данные свидетельствуют о восстановлении репликативного пула и активации регенераторных процессов. Диаметр КМЦ в обеих группах не отличался от контрольных значений.

Возможность регулярного обновления пула КМЦ на протяжении всей жизни и после воздействия цитотоксическими агентами продемонстрирована в ряде исследований, в которых представлены морфологические эквиваленты пролиферативной активности КМЦ и разработаны подходы к количественной оценке репликативного резерва миокарда [1, 3, 5, 7, 8]. В наших исследованиях показано, что после повреждающего циклофосфанового воздействия происходят не только гибель и элиминация КМЦ, но и индукция их пролиферации [1, 5]. В миокарде после однократного введения циклофосфана (в дозе 125 мг/кг) мы наблюдали митотическое деление ядер КМЦ и появление «малых» КМЦ (длиной около 40 мкм) с близко расположенными ядрами. Такая картина соответствует завершению телофазы и не свойственна зрелым КМЦ.

Малые КМЦ, которые мы регистрировали при циклофосфановых и доксорубициновых повреждениях миокарда, а также при комбинированных воздействиях цитостатиков и тритерпеноидов, располагались часто на концах мышечных волокон и формировали своеобразные точки роста. В ряде случаев происходил интермедиантный рост мышечных волокон - за счет деления клеток, расположенных в середине волокон. Кроме митотического деления ядер КМЦ и телофаз, в миокарде встречались также картины формирования вставочных дисков между разделившимися малыми КМЦ с образованием одноядерных клеток. Выявление фаз митоза ядер КМЦ и формирование вставочных дисков (цитокинеза) с очевидностью свидетельствуют об их делении. Важной характеристикой индуцированного кардиомиогенеза является формирование кластеров новообразованных клеток.

Заключение. Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что однократное введение ДОК вызывает значительные преимущественно литические повреждения КМЦ, сопровождающиеся их атрофией и апоптотической гибелью, что приводит к заметному уменьшению численности КМЦ в сердце и инволюции органа. Одновременно происходит значительное уменьшение репликативного пула миокарда - доли одноядерных КМЦ. При введении тритерпеноидов (бетулоновой кислоты и ее β-аланиламида) в схему химиотерапии отмечаются сходные морфофункциональные изменения миокарда, но степень выраженности изменений массы сердца, общей численности КМЦ и доли одноядерных клеток различна. Введение ДОК с последующим применением БК вызывает наиболее значительное при сравнении с амидом БК снижение массы сердца и диаметра КМЦ через 3 сут эксперимента, через 14 сут - наиболее значительное уменьшение общей численности КМЦ. После введения ДОК с последующим применение амида БК масса сердца и общая численность КМЦ в сердце существенно не изменяются, но значительно снижается доля одноядерных клеток. При использовании обоих тритерпеноидов после однократного введения ДОК численность КМЦ в сердце снижалась в меньшей степени, чем только после введения одного цитостатика.

При изолированном введении интактным животным БК и ее β-аланиламид оказывают одновременно умеренное цитотоксическое и стимулирующее действие на КМЦ. Кардиотоксические эффекты тритерпеноидов проявляются в мелкоочаговой гибели КМЦ и развитии заместительного мелкоочагового кардиосклероза. В то же время оба агента не влияют существенно на изменения массы сердца и общей численности КМЦ при их применении в течение 13 сут, а в ранние сроки - стимулируют кариокинез в одноядерных КМЦ, что приводит к увеличению доли двуядерных клеток.

Полученные данные позволяют полагать, что БК и ее β-аланиламид могут быть использованы в комплексных схемах химиотерапии для стимуляции регенераторных реакций КМЦ и уменьшения осложнений противоопухолевой терапии.

Список литературы

1. Численность кардиомиоцитов в миокарде крыс при воздействии на организм агентов с противоопухолевой активностью - циклофосфана и тритерпеноидов / Е.Л. Лушникова, Т.Г. Толстикова, Л.М. Непомнящих, М.Г. Клинникова, О.П. Молодых, Е.А. Свиридов, Сорокина И.В., Жукова Н.А. // Бюл. экспер. биол. - 2007. - Т. 144, № 9. - С. 331-337.
2. Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М., Розенберг В.Д. Морфологические и молекулярно-генетические основы дилатационной кардиомиопатии. - М.: Изд-во РАМН, 2004. - 192 с.
3. Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М., Толстикова Т.Г. Патоморфология мышечных клеток сердца при действии циклофосфамида и тритерпеноидов. - М.: Изд-во РАМН, 2009. - 272 с.
4. Непомнящих Л.М., Лушникова Е.Л., Семенов Д.Е. Регенераторно-пластическая недостаточность сердца: Морфологические основы и молекулярные механизмы. - М.: Изд-во РАМН, 2003. - 255 с.
5. Регенерация миокарда: Пролиферативный потенциал кардиомиоцитов и индукция кардиомиогенеза при альтеративной и пластической недостаточности сердца / Л.М. Непомнящих, Е.Л. Лушникова, П.М. Ларионов, М.Г. Шурыгин // Вестник РАМН. - 2010. - № 5. - С. 3-11.
6. Терпеноиды ряда лупана - биологическая активность и фармакологические перспективы. II. Полусинтетические производные лупана / Т.Г. Толстикова, И.В. Сорокина, Г.А. Толстиков и др. // Биоорганическая химия. - 2006. - Т. 32, № 3. - С. 291-307.
7. Bergmann O., Bhardwaj R.D., Bernard S. et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans // Science. - 2009. - Vol. 324, № 5923. - P. 98-102.
8. Chen X., Wilson R.M., Kubo H. et al. Adolescent feline heart contains a population of small, proliferative ventricular myocytes with immature physiological properties // Circ. Res. - 2007. - Vol. 100, № 4. - P. 536-544.
9. Schimmel K.J., Richel D.J., van den Brink R.B., Guchelaar H.J. Cardiotoxicity of cytoxic drugs // Cancer Treat. Rev. - 2004. - Vol. 30, № 2. - P. 181-191.
10. Speyer J., Wasserheit C. Strategies for reduction of anthracycline cardiac toxicity // Semin. Oncol. - 1998. - Vol. 25, № 5. - P. 525-537.

Рецензенты:

Ляхович В.В., д.б.н., профессор, академик РАМН, зав. отделом молекулярной биологии и директор НИИ молекулярной биологии и биофизики Сибирского отделения РАМН, г. Новосибирск;

Поляков Л.М., д.м.н., профессор, зав. лабораторией медицинской биотехнологии и зам. директора по научной работе НИИ биохимии Сибирского отделения РАМН, г. Новосибирск.

Библиографическая ссылка