С того момента, как было установлено негативное действие ионизирующего излучения на биологические объекты, возникла проблема профилактики и лечения последствий радиационного поражения (Ахмедьярова Э.А., Зуева О.М., Сейтембетова А.Ж., 2005, Чуркин А.А.. Массная Н.В., Шерстобоев Е.Н. и др., 2005, Зейнульдина А.С., Назарова А.Ж., Мурзагулов К.К. и др., 2005). В последние годы интенсивно ведутся поиски новых средств защиты и терапии лучевых поражений, не вызывающих токсических или побочных эффектов у организма животных и человека. Перспективным является химическое изучение ранее не исследованных видов, поиск новых источников ценных биологически активных соединений и синтез новых биологически активных производных на основе растительных веществ. Растительные иммуномодуляторы полезны тем, что поступают в организм в естественных соединениях, метаболизм которых в организме эволюционно сложился и закрепился на протяжении всей жизни человека (Дранник Г.Н., Гриневич Ю.А, Дизик Г.М., 1994). В этом направлении представляет интерес тритерпеноиды - класс, богатый соединениями, сочетающими доступность с биологической активностью. Последние десятилетия дали возможность надеяться на введение в медицину препаратов на основе тритерпеноидов лупанового ряда. Наиболее перспективным из этого ряда является бетулин - тритерпеноид, широко распространенный в природе, выделенный из коры березы повислой (Betula pendula Roth) и в данной работе был
апробирован.
Целью исследования явилось изучение действия фитопрепарата Bе Betula Pendula Roth на иммунологическую реактивность организма после комбинированного воздействия гамма-облучения в дозе 6 Гр в отдаленном периоде и асбестовой пыли.
Материалы и методы исследования: Для реализации поставленной цели были выполнены 3 серии опытов. I группа-интактные (n=10), II группа-облученные в дозе 6 Гр параллельно затравленные асбестовой пылью (n=15) и III группа-облученные в дозе 6 Гр параллельно затравленные асбестовой пылью получавшие фитопрепарат Ве (n=15). Животных II и III групп облучали однократно за 90 суток до исследования на радиотерапевтической установке Терагам 60Сo в дозе 6 Гр. Прежде чем проводить облучения, проводили топометрическо-дозиметрическую подготовку экспериментальных животных, который способствует к правильному подведению запланированной дозы на рентгенсимуляторе «Тerasix» на специальной клетке, с последующим облучением заданной дозы непосредственно на гамма-терапевтическом аппарате «Тeragam» производства Чешской Республики. Для воспроизведения экспериментального силикатоза подопытным крысам в легкие (интратрахеально) вводилась асбестная пыль методом Е.Н. Городецкой, в модификации В.И. Парашиной [1954].
Животных забивали путем неполной декапитации, предварительно усыпив хлороформом, через два месяца после интратрахеального введения. У всех животных изучали основные показатели, характеризующие иммунную систему организма. Работу с экспериментальными животными проводили согласно приказу №755 Минздрава СССР «Правила проведения работ с использованием лабораторных животных» и в соответствии с принципами Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными.
У всех подопытных животных изучали показатели, характеризующие гуморальное, клеточное и фагоцитарное звенья иммунитета. Определение количества В- и Т-лимфоцитов и их субпопуляций методом иммунофлуоресцентного окрашивания клеток с использованием антител, конъюгированных с FITC. Моноклональные антитела CD3+, CD4+, CD8+, CD19+ FITC приобретали у фирмы CALTAG Laboratories (USA).
Митогенпродуцирующую функцию лейкоцитов определяли в реакции торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) по А.Г. Артемовой (1973) с использованием фитогемагглютинина (ФГА), концентрацию циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) - по методу M.Digeon (1977) в модификации Ю.А. Гриневич и А.Н. Алферова (1981). Неспецифическое фагоцитарное звено иммунитета оценивалось по фагоцитарной активности полинуклеаров. Содержание фагоцитирующих полинуклеаров (нейтрофилов и псевдоэозинофилов) определяли по методике Е.А. Кост и М.И. Стенко (1968), в качестве фагоцитирующего материала использовали латекс. Изучали показатели мононуклеарно-фагоцитарной системы по НСТ-тесту, уровня сывороточных иммуноглобулинов классов A, M, G, осуществлялось методом преципитации в агаре по Mancini.
В качестве фитопрепарата использовался Тритерпеноид из коры березы повислой Betula Pendula Poth (Ве), назначался по 2,5мг/100г массы per os в течение 14 дней. Показатели определялись во всех указанных группах, с проведением соответствующей статистической обработки цифровых данных по общепринятым методам вариационной статистики, с вычислением критериев Стьюдента. Разность показателей расценивалась как достоверная при р 0,05.
Результаты и обсуждение: Анализ результатов исследования показал, что при комбинированном воздействии гамма-облучения и асбестовой пыли отмечается лейкопения, снижается почти на 31,32% (р<0,001), при сравнении с показателем интактной группой. На фоне фитопрепарата отмечается нарастания лейкоцитов до исходного уровня, т.е. увеличение на 32,35% по сравнению со II группой (р<0,001). Количество лимфоцитов в опытных группах статистически не отличались, но были выше, чем в контрольной группе. Во II группе отмечается достоверное снижение абсолютного и относительного количества СД3+ лимфоцитов: в 2,8 раза (р<0,001) и 1,3 раза (р<0,05) соответственно. При введении препарата Ве происходит увеличение абсолютного количества СД3+ почти в 2,5 раза и относительного количества в 1,2 раза (р<0,001).
У животных, подвергавшихся пыле-радиационному фактору, абсолютное и относительное количество CD4+ статистически достоверно снижается: абсолютное - в 2,14 раза (р<0,001), процентное - в 1,29 раза (р<0,05), а у животных, получавших фитопрепарат абсолютное количество CD4+ увеличивается в 2,04 раза (р<0,001), относительное количество - 1,34 раза (р<0,05). Исследование показало, что у животных получивших сублетальные дозы облучения и подвергавшихся запылению (II группа), абсолютное и процентное количество CD8+, достоверно снижается от контрольного показателя (абсолютное: 229,47±19,44 в 1 мкл при норме 479,11±19,61 в 1 мкл, процентное: 9,85±1,37% при норме 11,24±0,42%). У животных получавших фитопрепарат (III группа) процентное количество CD8+ увеличивается в 2 раза, а абсолютное количество - в 1,04 раза. Данные изменения привели к увеличению иммунорегуляторного индекса (CD4+/CD8+), которое составило в среднем 1,73±0,09 (р<0,05), по сравнению со II группой - 1,42±0,12, т.е на 21,83%. Отмечается снижение лимфокинпродуцирующей способности лейкоцитов что проявляется в повышении индекса миграции лейкоцитов в РТМЛ на ФГА на 53,2% (р<0,05).
Анализ полученных результатов показал, что пыле-радиационный фактор вызывает снижение лимфокинпродуцирующей способности Т-лимфоцитов, увеличение индекса миграции в РТМЛ на ФГА с 0,79±0,04 в контрольной группе до 1,21±0,11 (р<0,05), а в третьей группе отмечено тенденция к снижению индекса миграции до 0,99±0,05 по сравнению со второй группы, это показывает, что под воздействием препарата Ве повысилась лимфокинпродуцирующая способность CD3+ клеток.
Под воздействием фитопрепарата абсолютное и относительное количество В-лимфоцитов достоверно не отличались от показателя II группы. Вместе с тем, наблюдается статистически достоверное снижение концентрации ЦИК в сыворотке крови на 89,55% (р<0,05) у животных подвергавшихся к пыле-радиационному фактору. В группе получивших фитопрепарат отмечено статистически значимое увеличение иммунных комплексов (1,16±0,08 усл.ед. против 0,67±0,04 усл.ед. (р<0,001)). У животных II группы фагоцитарная активность (ФА) клеток крови составила 33,14±1,69%, в III группе отмечено достоверное увеличение до 39,72±2,11% (р<0,05). При таком фагоцитозе регистрируется достоверное увеличение на 64,15% фагоцитарного числа и увеличение НСТ-теста на 66,73%, что указывает на повышение функциональной активности нейтрофилов.
Общий уровень IgА в сыворотке крови, у животных II группы был достоверно снижен (2,03±0,30 г/л при норме 3,09±0,28 г/л, (р<0,05). Выявлено тенденция к увеличению уровня IgA в III группе, животных принимавших фитопрепарат. При исследовании общего уровня IgМ отмечено достоверное снижение во II группе (3,24±0,26 г/л против 4,05±0,28 г/л (р<0,05). После фитотерапии происходит статистически достоверное увеличение уровня IgM в III группе (4,63±0,36 г/л против 3,24±0,26 г/л (р<0,05). Уровень IgG во II группе был статистически достоверно снижен (1,83±0,33 г/л против 5,05±0,70 г/л, (р<0,01), а в III группе достоверно увеличивается в 2,13 раза (р<0,05).
Обобщая полученные результаты можно констатировать, что у экспериментальных животных, подвергавшихся пыле-радиационному фактору, в отдаленном периоде были выявлены значительные изменения, которые характеризовались снижением количества лейкоцитов, абсолютного и процентного количества CD3+, CD4+, CD8+, уровня ЦИК и IgA, IgМ, IgG, снижением функциональной активности нейтрофилов.
При введении фитопрепарата Ве отмечается лейкоцитоз, увеличение количества CD3+, CD4+, CD8+ и повышение лимфокинпродуцирующей способности лейкоцитов, уровня ЦИК и активизация функциональной активности нейтрофилов, фагоцитарной активности нейтрофилов. Таким образом, фитопрепарат Ве оказывает положительное влияние на качественный и количественный состав Т- и гуморального звеньев иммунной системы и повышает функциональную активность нейтрофилов. Полученные данные свидетельствуют о иммуномодулирующих свойствах данного препарата. Исходя из вышеизложенного, возникает вывод о необходимости дальнейших исследований отдаленных последствий радиационного поражения в комбинации с нерадиационными факторами, которые трудно корригируются и являются малоизученными.