Расшифровка механизмов изменений гомеостаза и роли эндогенных факторов в патогенезе заболеваний человека является актуальной проблемой современной фундаментальной медицинской науки [2, 4, 5]. При хронической почечной недостаточности (ХПН) вследствие нарушения гомеостатических и эндокринных функций почек возникает азотемия, изменяются кислотно-основной, водно-электролитный баланс, развиваются артериальная гипертензия, анемия, нарушения гемостаза, аффективного статуса и др. [3, 6, 9]. Заболевания инфекционно-воспалительной природы занимают весомое место в структуре осложнений у больных с терминальной стадией ХПН, находящихся на лечении программным гемодиализом, ухудшают качество жизни, затрудняют проведение процедуры гемодиализа и могут приводить к неблагоприятным исходам. Патогенез инфекционной патологии у данной категории больных связан с изменением количественного состава и функциональной активности иммунокомпетентных клеток, является многофакторным и до конца не изучен. Ранее нами убедительно продемонстрировано участие эритропоэтина в регуляции функциональной активности клеток крови и сопряженных с ними плазменных протеолитических систем при ХПН [7, 8, 10, 11]. Вторичный гиперпаратиреоз и связанные с ним изменения гомеостаза кальция и фосфора могут оказывать влияние на состояние иммуноцитов, регуляцию иммунного ответа и вносить определенный вклад в патогенез инфекционной патологии при ХПН. Цель работы – исследовать связь между изменениями адаптивного иммунитета и показателями гомеостаза кальция и фосфора у больных ХПН, находящихся на гемодиализе.
Материалы и методы исследования
Использована кровь больных людей с ХПН – пациентов отделения диализа ГБУЗ «Челябинская областная клиническая больница». Первоначально обследовано 150 больных с терминальной стадией ХПН в возрасте от 21 до 60 лет, получающих гемодиализную терапию на аппаратах «Искусственная почка» 4008S/BIBAG фирмы Fresenius (Германия) 3 раза в неделю в течение 4 часов. Критерии исключения:
- больные после трансплантации почки;
- наличие на момент исследования гнойно-септических осложнений;
- наличие у больных увеличенных лимфатических узлов любой локализации;
- больные, принимающие глюкокортикостероидную и/или цитостатическую терапию;
- злокачественные и доброкачественные опухоли любой локализации;
- ВИЧ-инфекция, гепатит С, гепатит В;
- аутоиммунные и/или аллергические заболевания.
После рандомизации в исследование включено 45 больных, из них 25 женщин и 20 мужчин. От всех больных получено письменное информированное согласие. Группа 1 – контроль (n = 24) представлена клинически здоровыми людьми – добровольцами, не имеющими соматической патологии и сопоставимыми по возрасту и полу с основными группами. Группа 2 – больные ХПН до процедуры гемодиализа (n = 45). Группа 3 – больные ХПН после процедуры гемодиализа (n = 45). Кровь для исследований у больных забиралась из артериального колена артериовенозной фистулы. Определение популяционного и субпопуляционного спектра лимфоцитов проводили с помощью иммунофенотипирования методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител серии ICO производства НИИ «Препарат» (Н. Новгород). Проводили типирование зрелых Т-лимфоцитов (СD3+) и их субпопуляций: СD4+ – маркер клеток хелперно/индукторного ряда, СD8+ – маркер цитотоксических лимфоцитов, В-лимфоцитов (СD20 +), NK-клеток (СD16+), маркера адгезии лимфоцитов (CD11b+), маркера ранней активации лимфоцитов (CD25+). Результат выражали в % от общего количества лимфоцитов и в абсолютных величинах (×109/л). Определение уровня иммуноглобулинов Ig А, Ig M, Ig G в сыворотке проводили методом иммуноферментного анализа с тест-системами производства «Вектор-Бест» (Новосибирск) на фотометре «Multiscan plus» («Labsystems», Финляндия) при длине волны 450 нм и выражали в г/л. Концентрацию паратиреоидного гормона (ПТГ) в сыворотке определяли методом иммуноферментного анализа с помощью тест-системы фирмы «Biomerica» (США), результат выражали в пг/мл. Концентрацию неорганического фосфора в плазме определяли методом без депротеинизации с молибденовокислым аммонием с использованием тест-системы фирмы «Вектор-бест» (Россия), концентрацию общего кальция в плазме – методом с о-крезолфталеинкомплексоном с использованием тест-систем фирмы «Cormay» (Польша). Статистический анализ проведен с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows 8.0. Для оценки различий между группами применяли критерии Манна –Уитни и Краскела –Уоллиса, Вальда –Вольфовитца, для установления связей между показателями – коэффициент корреляции Спирмена, различия считали значимыми при р < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
У больных ХПН при исследовании до процедуры гемодиализа в периферической крови в относительных величинах снижается количество различных популяций лимфоцитов – эффекторов клеточного (CD3+, CD4+, CD8 +) и гуморального (CD20+) адаптивного иммунитета, натуральных киллеров (CD16+). Пересчет показателей на абсолютное количество клеток в единице объема крови обнаружил более значимое снижение всех исследуемых популяций лимфоцитов (табл. 1, 2). Содержание CD3+лимфоцитов уменьшилось на 69,6 % по сравнению с контрольной группой, CD4+ – на 69,7 %, CD8+ – на 72,9 %, CD16+ – на 75,6 %, CD20+ – на 74,4 %. Кроме того, уменьшилось количество лимфоцитов, несущих адгезивные молекулы – CD11b+ (на 66,7 %) и признаки ранней активации – CD25+ (на 67,9 %). Процедура гемодиализа не приводила к достоверному изменению количества лимфоцитов в крови в относительных величинах, однако пересчет показателей на абсолютное количество обнаружил статистически значимое увеличение количества CD8+, количество остальных популяций лимфоцитов возрастало на правах тенденции. Данный факт является отражением ложного лимфоцитоза в связи с гемоконцентрацией в ходе процедуры гемодиализа.
При оценке уровня иммуноглобулинов в плазме у больных ХПН обнаружено увеличение количества иммуноглобулинов классов M и G соответственно на 38,4 и 30,9 %, содержание иммуноглобулина А достоверно не изменялось (табл. 3). Следует отметить, что количество IgM и IgG не выходило за пределы допустимых референтных величин концентраций для взрослых людей: соответственно 0,5–3,2 и 8–17 г/л [1]. Процедура гемодиализа не оказывала значимого влияния на концентрацию иммуноглобулинов в сыворотке. Таким образом, несмотря на дефицит эффекторов гуморального иммунитета при ХПН концентрация иммуноглобулинов в сыворотке остается в пределах допустимых значений.
Таблица 1
Популяционный спектр лимфоцитов (относительные величины) в крови у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе (М ± m)
|
Показатели |
Группа 1 Контроль (n = 24) |
Группа 2 ХПН до диализа (n = 45) |
Группа 3 ХПН после диализа (n = 45) |
|
CD3+, % |
61,58 ± 2,91 |
52,89 ± 2,82 * |
52,91 ± 2,92 * |
|
CD4+, % |
43,83 ± 1,83 |
37,56 ± 2,19 * |
34,02 ± 2,25 * |
|
CD8+, % |
36,17 ± 1,73 |
28,33 ± 1,31 * |
28,62 ± 1,60 * |
|
CD4/CD8 |
1,29 ± 0,10 |
1,37 ± 0,08 |
1,22 ± 0,06 |
|
CD11b+, % |
18,75 ± 1,68 |
18,09 ± 1,36 |
16,80 ± 1,24 |
|
CD16+, % |
21,42 ± 2,43 |
16,33 ± 1,08 * |
15,29 ± 0,96 * |
|
CD20+, % |
21,50 ± 1,50 |
16,29 ± 1,36 * |
15,11 ± 0,99 * |
|
CD25+, % |
13,83 ± 0,94 |
14,78 ± 0,95 |
13,96 ± 0,97 |
Примечание. Здесь и далее * – значимые (р < 0,05) различия с группой 1, ** – группой 2.
Таблица 2
Популяционный спектр лимфоцитов (абсолютные величины) в крови у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе (М ± m)
|
Показатели |
Группа 1 Контроль (n = 24) |
Группа 2 ХПН до диализа (n = 45) |
Группа 3 ХПН после диализа (n = 45) |
|
CD3+, ∙109/л |
1,25 ± 0,07 |
0,38 ± 0,03 * |
0,54 ± 0,06 * |
|
CD4+, ∙109/л |
0,89 ± 0,04 |
0,27 ± 0,02 * |
0,36 ± 0,05 * |
|
CD8+, ∙09/л |
0,74 ± 0,05 |
0,20 ± 0,02 * |
0,29 ± 0,03 * ** |
|
CD11b+, ∙109/л |
0,39 ± 0,04 |
0,13 ± 0,01 * |
0,17 ± 0,02 * |
|
CD16+, ∙109/л |
0,45 ± 0,05 |
0,11 ± 0,01 * |
0,15 ± 0,02 * |
|
CD20+, ∙109/л |
0,43 ± 0,03 |
0,11 ± 0,01 * |
0,15 ± 0,02 * |
|
CD25+, ∙109/л |
0,28 ± 0,02 |
0,09 ± 0,01 * |
0,14 ± 0,01 * |
Таблица 3
Содержание иммуноглобулинов в плазме у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе (М ± m)
|
Показатели |
Группа 1 Контроль (n = 24) |
Группа 2 ХПН до диализа (n = 45) |
Группа 3 ХПН после диализа (n = 45) |
|
Ig A, г/л |
3,07 ± 0,32 |
3,72 ± 0,22 |
3,48 ± 0,22 |
|
Ig M, г/л |
1,72 ± 0,18 |
2,38 ± 0,17 * |
2,46 ± 0,18 * |
|
Ig G, г/л |
11,75 ± 0,35 |
15,38 ± 0,63 * |
15,96 ± 0,73 * |
Полагают, что ведущим фактором лимфоцитопении при ХПН выступает ранняя активация Т-лимфоцитов, которая коррелирует с высоким уровнем апоптоза, что приводит к прогрессированию иммунодефицитного состояния, усугубляемого процедурой гемодиализа [14]. Апоптоз Т-лимфоцитов и Т-лимфоцитопения при терминальной ХПН могут быть обусловлены влиянием уремических токсинов, избытка свободного железа, окислительного стресса, гиперфосфатемии в условиях вторичного гиперпаратиреоза, окисленных липопротеинов низкой плотности (OxLDL), индоламина-2,3-диоксигеназы и аргиназы I типа. При ХПН наблюдается дизрегуляция В-клеточного звена иммунитета: уровень ростковых факторов для них повышается и отражает компенсаторные механизмы в условиях В-клеточного иммунодефицита, но ответ на эти стимулы отсутствует или снижен. Кроме того, В-лимфопения связана с апоптозом клеток в связи с пониженной экспрессией Bcl-2 [15]. Нарушения количественного состава и функциональной активности Т- и В-лимфоцитов приводят к дискоординации иммунного ответа на первичное и повторное внедрение антигена, прогрессированию синдрома системного воспалительного ответа, целлюлярных антиканцерогенных механизмов, что сопровождается увеличением частоты и тяжести инфекционных, сердечно-сосудистых и др. осложнений при ХПН.
При исследовании фосфорно-кальциевого гомеостаза у больных ХПН установлено, что содержание общего кальция в сыворотке не отличается от значений в контрольной группе и общепринятых референтных значений (2,15–2,50 ммоль/л), увеличивается содержание неорганического фосфора и ПТГ, соответственно на 73 % и в 27 раз (табл. 4). Повышение уровня ПТГ у больных ХПН обусловлено гипокальциемией и гиперфосфатемией вследствие задержки фосфатов, снижения всасывания кальция в кишечнике, резистентности костной ткани к ПТГ, дефицита кальцитриола. Следует учитывать, что при ХПН отрицательная обратная связь между концентрацией кальция в плазме и секрецией ПТГ находится на более высокой точке, т.е. более высокий уровень кальция необходим для угнетения продукции ПТГ. Поэтому в данном случае нормальный уровень кальция в плазме может рассматриваться как пониженный [12].
Таблица 4
Содержание кальция, неорганического фосфора и ПТГ в плазме у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе (М ± m)
|
Показатели |
Группа 1 Контроль (n = 24) |
Группа 2 ХПН до диализа (n = 45) |
|
Кальций общий, ммоль/л |
2,28 ± 0,10 |
2,27 ± 0,07 |
|
Фосфор, ммоль/л |
0,96 ± 0,05 |
1,66 ± 0,10 * |
|
ПТГ, нг/мл |
19,94 ± 1,69 |
546,66 ± 91,25 * |
Нами проведен корреляционный анализ для проверки наличия и характера связи между показателями иммунного статуса и фосфорно-кальциевого гомеостаза. Результаты представлены в табл. 5. Установлено, что количество CD3+, CD4+, CD8+, CD11b+, CD16+, CD20+, CD25+ лимфоцитов имеет отрицательную средней силы связь с концентрацией ПТГ в сыворотке. Возможно, что повышение содержания внутриклеточного кальция в условиях гиперпаратиреоза при ХПН является потенцирующим фактором усиленной гибели лимфоцитов путем апоптоза. Известно, что при ХПН применение блокаторов кальция или снижение уровня ПТГ в сыворотке благоприятно сказываются на функциональной активности клеток [13].
Таблица 5
Корреляция между показателями фосфорно-кальциевого гомеостаза и показателями адаптивного иммунитета у больных ХПН, находящихся на гемодиализе
|
Показатели |
ПТГ, нг/мл |
Фосфор, ммоль/л |
Кальций общий, ммоль/л |
|
CD3+, ∙109/л |
R = -0,53 |
R = -0,07 |
R = 0,10 |
|
CD4+, ∙109/л |
R = -0,39 |
R = -0,09 |
R = -0,19 |
|
CD8+, ∙109/л |
R = -0,44 |
R = -0,03 |
R = 0,03 |
|
CD11b+, ∙109/л |
R = -0,47 |
R = -0,01 |
R = -0,18 |
|
CD16+, ∙109/л |
R = -0,49 |
R = -0,08 |
R = -0,16 |
|
CD20+, ∙109/л |
R = -0,41 |
R = -0,11 |
R = -0,16 |
|
CD25+, ∙109/л |
R = -0,57 |
R = -0,26 |
R = 0,01 |
|
Ig A, г/л |
R = -0,02 |
R = 0,22 |
R = -0,13 |
|
Ig M, г/л |
R = 0,14 |
R = 0,28 |
R = 0,03 |
|
Ig G, г/л |
R = 0,05 |
R = 0,25 |
R = -0,04 |
Примечание. R-коэффициент корреляции Спирмена. Полужирным шрифтом выделены статистически значимые (p < 0,05) связи.
Таким образом, у больных ХПН, находящихся на программном гемодиализе, в периферической крови снижается количество CD3+, CD4+, CD8+, CD11b+, CD16+, CD20+, CD25+ лимфоцитов, концентрация в сыворотке иммуноглобулинов Ig A, Ig M, Ig G не отличается от допустимых референтных величин. Процедура гемодиализа не оказывает значимого влияния на количество популяций лимфоцитов в крови и концентрацию иммуноглобулинов в сыворотке. Изменения фосфорно-кальциевого гомеостаза включают повышение концентрации неорганического фосфора и ПТГ в сыворотке при нормальной концентрации кальция. Методами корреляционного анализа установлено, что снижение количества CD3+, CD4+, CD8+, CD11b+, CD16+, CD20+, CD25+ лимфоцитов в крови прогрессирует по мере повышения концентрации ПТГ в сыворотке.
Рецензенты:
Куренков Е.Л., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой анатомии человека, ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Челябинск;
Гизингер О.А., д.б.н., профессор кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии, клинической лабораторной диагностики, ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Челябинск.
Работа поступила в редакцию 18.04.2014.