Четыреххлористый углерод (CCl4) используют в экспериментальных работах как модель острого токсического повреждения печени. Развивающаяся печеночная недостаточность, связанная с интенсификацией процессов перекисного окисления, продукцией и накоплением высокотоксичных метаболитов, приводит к некрозу гепатоцитов и фиброзу печени [1]. Одним из способов коррекции токсических повреждений является применение гепатопротекторов растительного происхождения [3]. Гепатопротекторное действие растительных экстрактов обеспечивается присутствием в их составе фенолкарбоновых кислот, кумаринов, флавоноидов, обладающих фармакологической активностью [4]. В связи с этим изучение гепатопротекторного действия экстрактов, полученных из растительного сырья, на данной модели является актуальной задачей.
Цель исследования – изучение биохимических параметров, характеризующих токсическое повреждение печени, при остром гепатотоксическом действии CCl4. Сравнивали гепатопротекторное действие карсила и сухого экстракта бересты березы повислой – Betula pubescens.
Материалы и методы исследования
Эксперименты выполнялись на самцах крыс Вистар массой 200–250 г (n = 45), полученных из вивария Новосибирского медицинского университета. Протокол исследования соответствовал правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных (Приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г. и приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г.). Экстракт бересты березы из воздушно сухого сырья получали этанолом различной концентрации исчерпывающей экстракцией при нагревании на водяной бане.
Четыреххлористый углерод вводили внутрибрюшинно в 50 % масляном растворе однократно в дозе 0,2 мл/100 г массы тела животного. Контрольной группе животных вместо CCl4 вводили 50 % масляный раствор. Сухой экстракт бересты березы в крахмальной слизи вводили внутрижелудочно в дозе 100 мг/кг в течение 3-х дней предварительно перед введением CCl4. В качестве препарата сравнения использовали карсил («Sopharma») внутрижелудочно в дозе 100 мг/кг в течение 3-х дней предварительно перед введением CCl4. Материал для исследования забирали через сутки после введения CCl4.
Исследования проводили в сыворотке крови крыс. Белковые фракции оценивали методом электрофореза на ацетат-целлюлозных пленках, содержание общего белка определяли биуретовым методом. Концентрацию общего и прямого билирубина, мочевины и активность АлТ, ЩФ определяли с использованием наборов (PLIVA-Lachema Diagnosticum, Чехия), активность ММП-2,7 – по методу Nagase et al. [5] с использованием флуоресцентного субстрата (Calbiochem, США).
Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием пакета программ «Statistica,ver. 6.0». Определяли среднее арифметическое (М), ошибку среднего (m); различия между группами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента и считали значимыми при p < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Введение CCl4 снижало содержание общего белка сыворотки крови до 45,7 ± 5,15 г/л (64,0 ± 3,97 г/л) соотношение альбуминов к глобулинам до 1,0 ± 0,09 (1,5 ± 0,15), возрастала доля a1-, b2-глобулинов и снижалась доля g-глобулинов по сравнению с интактными животными (таблица).
Процентное содержание белковых фракций в сыворотке крови крыс при введении CCl4, карсила и экстракта березы
|
Группы |
Альбумины, % |
Глобулины, % |
||||
|
a1 |
a2 |
b1 |
b2 |
g |
||
|
1. Интактные (n = 20) |
48,8 ± 0,97 |
11,3 ± 0,54 |
5,5 ± 0,31 |
5,9 ± 0,33 |
15,3 ± 0,33 |
13,2 ± 0,57 |
|
2. CCl4 (n = 20) |
47,5 ± 1,92 |
15,6 ± 0,59 Р1-2< 0,05 |
6,0 ± 1,18 |
5,97 ± 0,55 |
18,0 ± 0,50 Р1-2 < 0,05 |
6,9 ± 0,81 Р1-2 < 0,05 |
|
3. CCl4 + карсил (n = 8) |
47,8 ± 1,02 |
13,15 ± 0,47 Р2-3 < 0,05 |
5,46 ± 0,46 |
8,37 ± 0,05 |
17,0 ± 0,24 |
8,2 ± 0,77 |
|
4. CCl4 + береза 100 мг (n = 12) |
42,8 ± 2,08 Р1-4< 0,05 |
16,04 ± 0,61 |
8,35 ± 1,21 |
6,5 ± 0,45 |
16,2 ± 0,59 Р2-4< 0,05 |
10,0 ± 1,18 Р2-4< 0,05 |
Предварительное введение карсила сохраняло содержание общего белка в норме 66,9 ± 5,3 г/л, снижало только процентное содержание a1-глобулинов, а введение экстракта березы достоверно снижало процентное содержание b2-глобулинов и увеличивало содержание g-глобулинов по сравнению с группой 2.
При введении CCl4 активность АлТ в сыворотке крови повышалась в 3,3 раза по сравнению с контрольной группой (1,8 ± 0,27 и 0,55 ± 0,05 ммоль/л∙ч, Р < 0,05 сответственно) и возрастала активность ЩФ (5696,4 ± 530,90 и 800,2 ± 80,12 нмоль/с∙л, Р < 0,05 соответственно). При этом увеличивалась концентрация общего билирубина (26,2 ± 3,14 и 7,5 ± 0,69 мкмоль/л, Р < 0,05 соответственно) и прямого билирубина (8,5 ± 4,55 и 2,5 ± 0,22 мкмоль/л, Р < 0,05 соответственно). На фоне предварительного введения карсила активность АлТ и ЩФ оставалась на высоком уровне (1,6 ± 0,21 ммоль/л/ч и 7032,9 ± 653,38 нмоль/с∙л соответственно). При введении экстракта коры березы активность АЛТ и ЩФ снижалась (0,8 ± 0,05 ммоль/л/ч и 3264,7 ± 368,15 нмоль/с/л соответственно, Р < 0,05). Введение карсила и экстракта березы не изменяло показатели общего и прямого билирубина. Определение мочевины в сыворотке крови не выявило достоверных изменений в исследуемых группах животных.
Активность ММП контрольной группы составила 190,4 ± 11,35 мкмоль/л∙ч. Введение CCl4 у крыс приводило к развитию токсического гепатита, которое сопровождалось повышением активности ММП (252,0 ± 11,84 мкмоль/л∙ч). Введение CCl4 на фоне карсила снижало активность ММП до контрольного уровня (202,8 ± 19,23 мкмоль/л∙ч, Р < 0,05). Введение сухого экстракта березы также приводило к достоверному снижению активности ММП (200,3 ± 12,25 мкмоль/л·ч, Р < 0,05).
Нами показано, что в условиях токсического повреждения печени, вызванного CCl4, происходит нарушение проницаемости мембран гепатоцитов (увеличение активности цитоплазматического фермента АЛТ), белок-синтетической функции печени (снижение общего белка), секреции билирубина в желчь (увеличение прямого билирубина), структуры межклеточного матрикса (увеличение активности ММП); подавление функции иммунокомпетентных клеток (снижение g-глобулинов). Нарастание активности ММП идет параллельно с экспрессией белков острой фазы (возрастала доля a1-, b2-глобулинов).
Ранее нами было изучено гепатопротекторное действие карсила и экстракта коры березы при экспериментальном повреждении печени, вызванном парацетамолом. Было показано, что карсил и экстракт коры березы сохраняли нормальные показатели процентного содержания общего белка, за счет альбуминов; снижали активность АЛТ, концентрацию прямого билирубина (показано только для экстракта березы) и активность ММП [2].
Исследование гепатопротекторного действие карсила и экстракта коры березы при экспериментальном повреждении печени, вызванном CCl4, показало, что карсил сохранял содержание общего белка в норме и снижал долю a1-глобулинов. Наибольшим эффектом обладал экстракт березы: в отличие от карсила он снижал долю b2-и увеличивал долю g-глобулинов, снижал активность АЛТ и ЩФ. Карсил и экстракт коры березы, улучшая состояние межклеточного матрикса, снижали активность ММП.
Выводы
1. Через 24 часа после внутрибрюшинного введения CCl4 в дозе 0,2 мл/100 г массы тела животного развивалась выраженная гипопротеинемия и увеличивалось процентное содержание белков острой фазы (a1, b2-глобулинов), снижалась доля g-глобулинов в сыворотке крови крыс.
2. Карсил сохранял концентрацию общего белка и снижал долю a1-глобулинов и активность ММП в сыворотке крови крыс.
3. Экстракт березы снижал долю b2- и увеличивал долю g-глобулинов, снижал активность АЛТ, ЩФ и активность ММП.
Рецензенты:
Поляков Л.М., д.м.н., профессор, зам. директора по научной работе ФГБУ «НИИ биохимии» СО РАМН, г. Новосибирск;
Пустоветова М.Г., д.м.н., профессор, зав. Центральной научно-исследовательской лабораторией ГБОУ ВПО НГМУ, г. Новосибирск.
Работа поступила в редакцию 07.03.2013.