В мировой медицинской литературе представлено огромное количество данных, описывающих побочные эффекты терапии нестероидными противовоспалительными препаратами (НПВП). Хотя токсический потенциал НПВП может быть реализован практически в любом органе и системе, основные побочные эффекты данной группы лекарственных средств закономерно связаны с влиянием на желудочно-кишечный тракт [3]. В тонкой кишке происходит всасывание большей части НПВП при пероральном приеме, что создает условия для локального повреждающего воздействия препаратов и развития НПВП-индуцированной энтеропатии [4].

В настоящее время не вызывает сомнений, что большинство патологических изменений в функционировании клеток, тканей или органов сопровождается отклонением в экспрессии белков – участников конечной стадии передачи информации в клетке [1]. На современном этапе развития молекулярной биологии и медицины наиболее полную информацию о белковом составе исследуемых объектов (протеоме) может дать протеомный анализ. Данный подход подразумевает комплексное изучение протеома методами и технологиями, направленными на одновременное разделение, а также последующую идентификацию и анализ тысячи белков, синтезирующихся в клетке [2]. Использование протеомного анализа в гастроэнтерологии позволяет выяснить ранее неизвестные молекулярные механизмы формирования и развития НПВП-индуцированной энтеропатии, что будет способствовать созданию принципиально новых методов ее прогнозирования и диагностики.

В связи с вышеизложенным целью работы явилось изучение протеомного профиля слизистой оболочки тонкой кишки при НПВП-индуцированной энтеропатии.

Материалы и методы исследования

В течение 2 лет в исследование было включено 20 пациентов с остеоартрозом, принимавших диклофенак в дозе 100 мг/сут в сутки, и верифицированной НПВП-энтеропатией, в возрасте от 25 до 38 лет – 12 (60 %) женщин и 8 (40 %) мужчин. Продолжительность заболевания варьировала от 1 года до 8 лет. Критериями включения в исследование являлись типичные симптомы (боль, чувство «жжения» и тяжести в эпигастральной области), железодефицитная анемия и гипоальбуминемия. Критериями исключения из исследования являлись онкологические заболевания желудочно-кишечного тракта, язвенно-эрозивные повреждения двенадцатиперстной кишки, хирургические операции по поводу заболеваний тонкой кишки в анамнезе, прием антисекреторных и прокинетических лекарственных средств в течение месяца и 15 дней перед включением в исследование. Контрольная группа – 20 практически здоровых лиц. Возраст обследованных колебался в пределах от 37 до 70 лет. Средний возраст пациентов в основной группе – 52,97 ± 2,64 года, в контрольной группе – 36,2 ± 10,2 года. НПВП-энтеропатия верифицирована эндоскопически и морфологически. Материал для общеморфологического и протеомного анализа получали при эндоскопическом исследовании из дистальных отделов двенадцатиперстной кишки.

Для предварительного фракционирования образцов слизистой тонкой кишки использовали стандартные наборы для профилирования, содержащие магнитные микрочастицы с различными поверхностями MB-HIC C8, MB-IMAC Cu, MB-WСХ, согласно методике производителя (Bruker Daltonics, Германия). Подготовка к проведению масс-спектрометрического анализа состояла в следующем: элюаты наносили на стальную мишень AnchorChipTM, после высушивания на воздухе образец покрывали раствором матрицы. В качестве матрицы использовали смесь 2,5-дигидроксибензойной и α-цианогидроксикоричной кислот в смеси метанол/ацетонитрил/вода (5:4:1). Масс-спектры получали с пользованием тандемного MALDI-TOF/TOF (matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometry)-масс-спектрометра Ultraflex II (Bruker Daltonics, Германия). Спектры калибровали с помощью внешних стандартов, представляющих смесь белков и пептидов с известными массами (Bruker Daltonics, Германия). Каждый масс-спектр был проанализирован с помощью программ FlexAnalysis 3.0 и ClinProTools 2.1 (Bruker Daltonics, Германия). Идентификацию белков и пептидов проводили путем поиска соответствующих кандидатов в базах данных NCBI и SwissProt/UniProt с использованием программы Mascot Search (v 2.1, Matrix Science, Великобритания). Результаты идентификации белков принимались как достоверные при уровне значимости не менее 95 % и показателе сиквенс-покрытия не менее 60 %.

Достоверность различий между протеомными спектрами слизистой оболочки тонкой кишки пациентов контрольной и основной групп определяли с помощью непараметрического χ²-критерия (программа Statistica версия 6.0.). Достоверными считались различия при p < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Сопоставление протеомного профиля слизистой тонкой кишки пациентов контрольной и основной групп позволило выявить ряд белков отличия, присутствие или отсутствие которых имеет место только при НПВП-индуцированной энтеропатии (таблица). Так, в слизистой оболочке тонкой кишки пациентов основной группы установлено появление 16 белков: субъединицы р-65 фактора NF-kB, кальгранулина, фактора некроза опухоли-α (ФНО-α), трансформирующего фактора роста-β (ТФР-β), интерлейкина (ИЛ)-1β, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12А, Smad3, PPAR-γ, CFTR, нейропилина 1, β-дефензина-1, HspA8, Hsp27, не обнаруженных у пациентов контрольной группы.

Среди них следует особо выделить транскрипционный фактор NF-kB (субъединица р-65), который контролирует экспрессию ряда генов, участвующих в иммунных и воспалительных реакциях, клеточной адгезии, апоптозе, дифференцировке и пролиферации. Известно, что активация транскрипционного ядерного фактора NF-kB является ключевым моментом в индукции синтеза провоспалительных медиаторов, таких как ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12А и ФНО-α [7]. Сопряженное с возрастанием уровня NF-kB увеличение экспрессии вышеуказанных цитокинов, установленное нами при НПВП-индуцированной энтеропатии, способствует развитию воспалительных процессов в слизистой тонкой кишки. Активации и перемещению в ядро клетки фактора NF-κB способствует кальгранулин А [8], продукция которого также повышена в интерстициальной слизистой у пациентов основной группы.

Увеличение продукции иммунорегуляторного цитокина ТФР-β приводит к усилению экспрессии его цитолазматического медиатора SMAD3 и нейропилина 1 – трансмембранного ко-рецептора, что способствует формированию подслизистого фиброза в стенке тонкой кишки при НПВП-индуцированной энтеропатии за счет индукции синтеза коллагена [6].

Еще один белок с повышенным уровнем CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) – цАМФ-активируемый Cl– канал, локализующийся на мембране энтероцитов [9]. Увеличение продукции белка CFTR при изучаемой патологии приводит к усилению секреции воды в просвет тонкой кишки вследствие повышения секреции Cl– и развитию диарейного синдрома, являющегося одним из побочных эффектов НПВП.

Белки отличия, идентифицированные в слизистой оболочке тонкой кишки пациентов контрольной и основной групп

Примечание. Mm – молекулярная масса, р – достоверность отличий между группами, «↑» – повышение экспрессии белка, «↓» – снижение экспрессии белка.

Компенсаторное значение при данной патологии, очевидно, имеет усиление экспрессии шаперонов HspA8 и Hsp27, которые играют важную роль в защите целостности слизистой оболочки кишечника, уменьшая индукцию апоптоза, вызванную НПВП. Таким же компенсаторным механизмом, очевидно, является увеличение синтеза в слизистой тонкой кишки при НПВП-индуцированной энтеропатии антимикробного пептида β-дефензина-1.

С помощью масс-спектрометрического анализа были идентифицированы 18 белков, экспрессия которых резко снижена или полностью отсутствует в слизистой тонкой кишки при НПВП-индуцированной энтеропатии. К этим белкам относятся интестинальный белок, связывающий жирные кислоты, хлорид-анионный транспортер, белок-переносчик сульфат-ионов, трансмембранный гликопротеин A33, рецептор 1 к вазоактивному интерстициальному пептиду, хромогранин A, пептид YY, соматостатин, глутатионпероксидаза 2, тиосульфат-сульфотрансфераза, простагландин дегидрогеназа 1, 11-β-гидроксистероид дегидрогеназа 1, коллаген IV типа, фибронектин, ламинина (гамма 1 субъединица), карбоангидразы I, II и IV.

Принимая во внимание многочисленные функции соматостатина, пептида YY и хромогранина в ЖКТ (регуляция перистальтики, воспалительных реакций, секреции гормонов и ионов), можно полагать, что снижение продукции этих белков, очевидно, связанное с редукцией числа энтероэндокринных клеток в слизистой кишечника, приводит к расстройствам пищеварения у пациентов, принимающих НПВП.

Уменьшение синтеза карбоангидразы (I, II и IV) создает условия для повреждения слизистого барьера из-за недостаточной продукции этим ферментом бикарбонатов – основных анионов, обеспечивающих защиту эпителия, и может быть причиной эрозивно-язвенных поражений тонкой кишки на фоне длительного приема НПВП.

Установленное снижение экспрессии хлорид-анионного транспортера (SLC26A3) в слизистой тонкой кишки при НПВП-энтеропатии приводит к нарушению поступления ионов хлора в энтероциты и, таким образом, увеличению объема жидкости в просвете кишечника, обусловливая развитие диареи [5].

Что касается глутатионпероксидазы 2, которая защищает клетки от действия активных форм кислорода и апоптоза, то сокращение продукции этого фермента способствует развитию дезорганизационных изменений в эпителии слизистой и снижению его барьерной функции.

Подавление экспрессии при НПВП-индуцированной энтеропатии трансмембранного гликопротеина А33 и белков внеклеточного матрикса – ламинина, коллагена IV типа и фибронектина, играющих важную роль в адгезии энтероцитов, приводит к нарушению межклеточных взаимодействий и, как следствие, увеличению проницаемости кишечного барьера, создавая условия для транслокации бактериальной флоры в кишечную стенку с развитием хронического воспаления.

Заключение

Резюмируя полученные данные, можно заключить, что модификация экспрессии белков, участвующих в регуляции воспаления, апоптоза, адгезии, транспорта ионов и других важных биологических процессов, является патогенетическим фактором развития НПВП-индуцированной энтеропатии. Полученные нами с помощью протеомного анализа данные позволяют расширить наши представления о молекулярных механизмах развития маркеров данной патологии. Выявленные белки слизистой оболочки кишечника могут быть использованы в качестве информативных маркеров НПВП-индуцированной энтеропатии.

Рецензенты:

Погорелова Т.Н., д.б.н., профессор, заведующая отделом медико-биологических проблем, ФГБУ РНИИАП Минздрава России, г. Ростов-на-Дону;

Яковлев А.А., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой гастроэнтерологии и эндоскопии с курсом клинической фармакологии ФПК и ППС, ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Ростов-на-Дону.