Высокотехнологичные методические подходы молекулярной медицины с использованием современных постгеномных технологий позволяют выяснить ранее неизвестные механизмы развития осложненной беременности. К числу таких технологий относится протеомный анализ, дающий представление о совокупности белков исследуемой ткани и создающий качественно новые возможности для системных поисков молекулярных маркеров патологического процесса [3, 12].

Поскольку развитие беременности связано с молекулярно-клеточными изменениями не только в организмах матери и плода, но и в плаценте, обеспечивающей их взаимосвязь, изучение плацентарного протеомного профиля может дать важную информацию о механизмах развития акушерской патологии. Лидирующими осложнениями беременности, приводящими к пренатальной заболеваемости и смертности, являются преэклампсия и ЗРП. Однако данные о протеомном спектре плаценты при этих состояниях малочисленны и неоднозначны [6].

Целью настоящей работы явилось изучение протеомного профиля плаценты при преэклампсии и ЗРП.

Материалы и методы исследования

Исследованы плаценты 52 женщин в возрасте от 23 до 33 лет (в среднем 25,9 ± 0,4 года), составившие 3 группы. В 1-ю группу вошли 15 женщин с неосложненным течением беременности и родов, во 2-ю – 18 женщин, у которых беременность осложнилась преэклампсией средней степени тяжести в соответствии с международной классификацией болезней (МКБ-10, код-014.0), в 3-ю группу – 19 женщин, с ассиметричной формой ЗРП (МКБ-10, код – Р.05.0). По возрасту, соматическому и акушерско-гинекологическому анамнезу пациентки обследуемых групп были сопоставимы.

Материалом исследования служили плаценты, взятые сразу после родов. Протеомные карты плацентарной ткани получали с помощью высокоразрешающего двумерного электрофореза в полиакриламидном геле (приборы Protein IEF Cell и Protean II xi Multi-Cell, «Bio-Rad», США), который включал в первом направлении изоэлектрическое фокусирование (IPC – стрипы рH 3,0–10,0 , прибор IEF Cell, «Bio-Rad», США), во втором – вертикальный электрофорез (8–16,5 % гель, прибор Protein II xi Multi-Cell, «Bio-Rad», США). Для получения аналитических гелей использовали загрузку белка – 180 мкг/гель. Окрашивание белковых пятен осуществили азотнокислым серебром, затем фореграммы сканировали и анализировали с использованием пакета программ PDQuest («Bio-Rad», США). Идентификацию белков после вырезания пятен из геля и процедуры трипсинолиза проводили методом времяпролетной масс-спектрометрии [4] на масс-спектрометре Autoflex II («Bruker», Германия) с помощью программы Mascot MS Search (Matrix Science, Великобритания) и баз данных NCBI и Swiss-Prot.

Статистическую обработку данных осуществляли с использованием лицензионного пакета программ Statistica (версия 6.0. фирмы StatSoft. Jnc.). Достоверность различий между сравниваемыми группами: для каждого белка отличия определяли с помощью c2-критерия и четырехпольных таблиц сопряженности качественных признаков. Результаты оценивали как статистически значимые при p < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Проведенный протеомный анализ позволил идентифицировать белки с различными функциями и свойствами, обеспечивающими возможность многосторонней регуляции метаболизма плаценты, значительная часть которых обнаруживается во всех обследованных группах женщин. В то же время белковый состав плацентарной ткани при физиологической и осложненной беременности имеет определенные отличия (таблица).

Белки плаценты, идентифицированные при физиологической беременности, ЗРП и преэклампсии

Примечание. «+» – появление белка, «–» – отсутствие белка, Mm-молекулярная масса, pI – изоэлектрическая точка, * – появление или отсутствие белков при осложненной беременности относительно физиологической статистически значимо,** – появление или отсутствие белков при ЗРП относительно преэклампсии статистически значимо.

Так, при ЗРП обнаружено снижение экспрессии белков, имеющих важное значение в регуляторных процессах. Эндоплазматический ретикулярный белок ERp29 является шапероном и ключевым фактором в фолдинге эндогенных секреторных белков. Подавление продукции этого белка может приводить к дисфункции протеасом и изменению интенсивности клеточной пролиферации [11]. Уменьшение экспрессии аннексинов А2 и А4, учитывая их роль в трансмембранном транспорте и ремоделировании цитоскелета [9, 10], очевидно, сопровождается нарушением этих процессов в плаценте. К выраженным отрицательным последствиям приводит снижение уровня прохибитина – многофункционального белка, расположенного на внутренней мембране митохондрий. Являясь шапероном этих субклеточных фракций, он регулирует в них клеточный цикл на уровне фаз G1 и S. Кроме того, прохибитин действует как транскрипционный модулятор α-рецептора эстрогена, что особенно важно для плацентарной ткани [1]. Снижение экспрессии еще двух белков, связанных с митохондриями, – цитратсинтазы и диеноил-КоА-изомеразы, в свою очередь, ухудшает работу данных клеточных структур и может сопровождаться уменьшением генерации энергии в плацентарной ткани.

Что касается актин-подобных белков 2 и 3, а также β – и γ – актинов, выполняющих различные функции в клеточных структурах, то нарушение их продукции будет сопровождаться угнетением этих функций, в частности, регуляции транспортных процессов. Снижение экспрессии кислого рибосомального белка 60S, участвующего в регулировании реакций трансляции, усугубляет метаболический дисбаланс в плаценте при ЗРП [5].

Изменение продукции белков при ЗРП проявляется не только в снижении, но и увеличении уровня некоторых из них. К числу таких белков относится α-актинин-4, связывание которого с транскрипционным фактором NF-kB, модифицирует внутриклеточные функции последнего, в том числе, усиливает экспрессию генов, запускающих апоптоз [2]. Повышенная продукция виментина и β-тропомиозина, отвечающих за сохранность структуры цитоскелета, может иметь компенсаторное значение, направленное на поддержание клеточной целостности в условиях осложненной гестации. Увеличение экспрессии молекулярного шаперона – эндоплазмина, играющего важную роль в эндоплазматическом ретикулуме при ядерной сигнализации, фолдинге и секреции ряда белков [13], по-видимому, будет отражаться на процессах, находящихся в сфере влияния данного полипептида – белковом гомеостазе и клеточной дифференцировке.

Протеомный анализ плаценты при беременности, осложнившейся преэклампсией, выявил отсутствие 6 белков. В их числе следует отметить субъединицу 2 комплекса Arp 2/3 (actin-related protein – актин-подобный белок), необходимого для поддержания сосудистого компонента плацентарной ткани, 60S кислый рибосомальный белок, 20S протеасому (α-субъединица 6-типа), ответственную за интенсивность катаболической фазы плацентарного метаболизма. Кроме того, обнаружено снижение экспрессии аннексина А4, α-тропомиозина и β-актина. Поскольку немышечные изоформы актина находятся в цитоплазматических структурах в виде микрофиламентов, участвующих в транспорте внешнего сигнала с поверхности клетки в ядро, то модификация их продукции приводит к нарушению внутриклеточного транспорта. В то же время, α-тропомиозин, комплексируясь с актиновыми филаментами, обеспечивает миграцию клеток и цитокенез [8].

Развитие преэклампсии сопровождается также появлением дополнительных белков-отличия. Выявленное повышение экспрессии митохондриальной аконитатгидратазы и пероксиредоксина-4 может играть значительную роль в изменении свободнорадикальных процессов и редокс-статуса плаценты, что является важной составляющей развития окислительного стресса, сопровождающего прогрессирование преэклампсии.

Усиленная продукция таких молекулярных шаперонов, как белок теплового шока 60 (Hsp60) и эндоплазмин, контролирующих процессы ремоделирования нативного состояния белков [5,13], возможно, имеет компенсаторный характер в поддержании корректного фолдинга ряда регуляторных белков. Появление белка 14-3-3 эпсилон, связанного с модулированием эффекторных влияний трансформирующего фактора роста-β и фактора некроза опухоли-α, может приводить к усилению апоптоза [14]. В свою очередь, повышение экспрессии проапоптозных генов может способствовать увеличению продукции ά-актинина-4, образующего мультимолекулярный комплекс с ядерным фактором NF-kB [7].

Сравнительный анализ результатов исследования плаценты при ЗРП и преэклампсии позволил обнаружить как общие изменения протеомного профиля по сравнению с таковым при физиологической беременности, так и определенные отличия.

Заключение

Таким образом, материалы настоящей работы свидетельствуют о том, что развитие осложненной беременности происходит на фоне изменения продукции белков, участвующих в регуляции апоптоза, редокс-статуса, клеточной дифференцировки и пролиферации, обладающих функциями шаперонов, трансдукторов клеточной сигнализации. Данные изменения, очевидно, имеют патогенетическое значение в формировании осложненной беременности. Различие в протеомных спектрах плаценты может определять специфику развития акушерской патологии.

Рецензенты:

Друккер Н.А., д.б.н., главный научный сотрудник отдела медико-биологических проблем в акушерстве, гинекологии и педиатрии, ФГБУ «РНИИАП» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону;

Микашинович З.И., д.б.н., профессор, заведующая кафедрой общей и клинической биохимии № 1 с курсом органической и неорганической химии, ГБОУ ВПО «РостГМУ» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону.