Настоящая работа является продолжением наших исследований, посвященных тестированию ингибиторов окисления различного химического строения кинетическими методами [4, 5]. По результатам антиоксидантной активности ряда лекарственных препаратов, независимо от спектра их фармакологического действия, было выявлено наиболее эффективное соединение – осалмид (2-гидрокси-N-(4-гидроксифенил)бензамид). В Новосибирском институте органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН на базе структуры осалмида направленным синтезом была получена группа замещенных амидов салициловой кислоты, имеющих в орто-положении экранирующие трет-бутильные заместители [3]. Ранее сравнительного анализа ингибирующих свойств соединений с целью выявления среди них активных антиоксидантов (АО) не проводилось. Представлялось актуальным изучить антиоксидантные свойства новых амидов салициловой кислоты в зависимости от структуры, указать перспективы дальнейшей химической модификации соединений с рациональной комбинацией нескольких активных центров.

Цель исследования – тестирование антирадикальной активности, брутто-ингибирующего действия новых амидов салициловой кислоты в сравнении со стандартными антиоксидантами: дибунолом и α-токоферолом, установление взаимосвязи между их строением и антиоксидантной активностью.

Материалы и методы исследования

Антиоксидантную активность (АОА) изучали волюмометрическим методом поглощения кислорода в модифицированной установке типа Варбурга при окислении метилолеата (МО) в среде инертного растворителя хлорбензола. Процесс инициировали за счет термического разложения 3∙10−3 М 2,2′-азобисизобутиронитрила (АИБН) в пробе при t = (60 ± 0,2) °С, Wi = 4,2∙10−8 М∙с−1. В качестве критериев оценки антиоксидантных свойств соединений использовали – периоды индукции (t), начальные и максимальные скорости окисления (Wнач, Wmax). Антиоксидантную активность количественно определяли по формуле АОА = ti – tS/tS, где tS и ti – периоды индукции окисления субстрата в отсутствие и в присутствии исследуемого АО соответственно. Антирадикальную активность (АРА) соединений тестировали в системе инициированного окисления этилбензола хемилюминесцентным методом (ХЛ) по известной методике [8]. Окисление инициировалось АИБН при t = (60 ± 0,2) °С, Wi = 2,3∙10-8 М∙с–1 [6]. Кинетику накопления гидропероксидов изучали при аутоокислении линолевой кислоты (ЛК) методом обратного йодометрического титрования в среде хлорбензола, t = (60 ± 0,2) °С.

Результаты исследования и их обсуждение

На рис. 1 показаны формулы исследуемых соединений (I–IV), представляющие собой амидные производные салициловой кислоты. Большинство из указанных соединений содержат орто-трет-бутильные заместители и являются пространственно затрудненными фенолами. В качестве стандартных АО использовались α-токоферол (V) и дибунол (VI).

Методом хемилюминесценции в группе исследуемых соединений была оценена величина константы скорости реакции k7 АО с пероксильными радикалами [8].

где InH – ингибитор окисления; In· – радикал ингибитора;  – пероксильный радикал. Определен фактор ингибирования f, показывающий количество свободных радикалов, реагирующих с молекулой ингибитора (табл. 1). При исследовании кинетики изменения интенсивности ХЛ в присутствии исследуемых соединений было установлено, что все АО оказывают ингибирующее действие на процесс окисления модельного субстрата. Наибольшую активность в реакциях с пероксильными радикалами из производных салициловой кислоты проявлял осалмид (табл. 1).

Рис. 1. Химические формулы изучаемых соединений

Таблица 1

Кинетические характеристики АО различного химического строения

Высокая константа скорости реакции k7 осалмида связана с наличием p-r-сопряжения между амидной группой и фенолом. Анализ значений констант скорости реакций k7 структур, отличающихся степенью экранированности ОН-группы, показывает, что введение экранирующих заместителей приводит к существенному снижению антирадикальной активности АО (табл. 1). Сопоставление антирадикальной активности исследуемых нами аминофенолов, у которых амидная группа находится на разном удалении от бензольного кольца, показывает, что по мере удаления этих групп снижается возможность p-r-сопряжения и значение константы уменьшается вдвое (табл. 1).

Таким образом, существует тесная взаимосвязь между значением константы скорости реакции k7 и природой заместителя в пара-положении. Полученные нами данные о характере влияния заместителей разной природы согласуются со сведениями, приводимыми в известных монографиях и обзорах [1, 2, 7, 9].

Сравнение констант скорости реакции k7 исследуемых фенолов и a-токоферола показывает, что основной природный АО более активен в реакциях с пероксильными радикалами (практически в 360 раз). Стехиометрический фактор ингибирования f для большинства изучаемых соединений был близок или равен 3 (табл. 1).

При помощи компьютерной программы Current Gaussian 09 Revision D.01 были рассчитаны длины связей между атомами в молекуле осалмида, возможность образования внутримолекулярной водородной связи (ВВС), дипольные моменты (µ) и энергии активации молекул (Еа). Показано, что длина связи O–H в ароматическом кольце А соединения (0,98787∙10–10 м) больше, чем длина связи O–H в кольце Б (0,96282∙10–10 м) (рис. 2). Наиболее активными O–H группами в реакциях с пероксильными радикалами являются гидроксильные группы из кольца А. Длина ВВС между группами O-H...O = C составляла 1,67786∙10–10 м. Длина связи C–N в молекуле осалмида составляла 1,36458∙10–10 м. Дипольный момент и энергия активации молекулы осалмида составляет 2,6778 D и –782,6772869 кДж/моль соответственно. Показано, что осалмид не образует ВВС между группами N–H...O–H, по расчетам длина связи будет составлять 2,12221∙10–10 м, а дипольный момент µ = 3,3548 D, поэтому существование такой молекулы не является оптимальным. Введение трет-бутильного заместителя в бензольное кольцо А увеличивает длину связи O–H в соединениях. Длина ВВС между группами O–H...O = C уменьшается с введением в орто-положение трет-бутильных заместителей (табл. 2). В молекулах амидов салициловой кислоты с увеличением заместителей в орто- и пара-положении длина связи C–N изменяется от 1,36458∙10–10 м (осалмид) до 1,35994∙10–10 м (Амид IV).

Ингибирующее действие всех указанных соединений тестировалось в широком диапазоне концентраций (5∙10–5–3∙10–3 М) и сравнивалось с действием известных АО – дибунолом, a-токоферолом. Было показано, что исследуемые АО увеличивают периоды индукции окисления модельного субстрата МО. На рис. 3 приведены кинетические кривые окисления МО в присутствии равных концентраций различных АО. Для всех синтетических антиоксидантов наблюдалась линейная зависимость между периодом индукции и концентрацией (рис. 4). Периоды индукции с добавками α-токоферола нарастали до концентрации 2,5∙10–3 М, свыше которой происходило постепенное снижение эффективности торможения процесса. Брутто-ингибирующая активность пространственно затрудненных фенолов была выше практически в 2 раза пространственно незатрудненных АО (табл. 3). Осалмид, имеющий высокое значение константы скорости реакции k7 взаимодействия с -радикалами, проявлял наименьшую антиоксидантную активность, что обусловлено отсутствием в его структуре экранирующих трет-бутильных заместителей. Осалмид образует достаточно активные феноксильные радикалы (In·), которые участвуют в реакциях продолжения цепей с молекулами субстрата (RH):

In· + RH → R· + InH.

Рис. 2. Длины связей между атомами в молекуле осалмида

Таблица 2

Расчетные параметры длины связей между атомами, дипольного момента и энергии активации молекул антиоксидантов при помощи компьютерной программы Current Gaussian 09 Revision D.01, номер антиоксиданта соответствует рис. 1

Сопоставление между собой ряда структур амидов салициловой кислоты (II, III, IV) (табл. 3) показывает, что разделение между собой тремя метиленовыми группами амидного и фенольного фрагментов молекулы приводит к повышению брутто-ингибирующего действия АО. Очевидно, этот эффект связан с отсутствием p-r-сопряжения между амидной группой и бензольным ядром. В литературе были получены аналогичные закономерности для других групп соединений [2, 7, 9]. Было установлено, что структуры (III, IV) близки по своему антиоксидантному действию (табл. 3). Ингибиторы «гибридной» структуры либо близки (I, II), либо превосходят (III, IV) по своему действию природный АО – a-токоферол, а структура (IV) соизмеримы с эффективностью дибунола (табл. 3, рис. 4).

Показано, что ОН-группа, расположенная в орто-положении к карбоксильной СООН-группе, независимо от степени ее экранирования, не вносит существенного вклада в эффективность ингибирования (табл. 3). На основании полученных данных можно рекомендовать осуществление синтеза потенциальных АО, у которых экранированная фенольная ОН-группа должна находиться в пара-положении к амидной группе, что исключит возможность образования внутримолекулярной водородной связи. Направленный синтез указанных соединений позволит создать новую группу высокоэффективных ингибиторов окисления.

В работе была проанализирована закономерность изменения начальной (Wo2нач) и максимальной (Wo2max) скорости окисления в присутствии различных концентраций АО. Изучение показало, что указанные кинетические параметры практически не изменяются с ростом концентрации дибунола и α-токоферола, но существенно уменьшаются при введении ингибиторов, содержащих амидную группу (табл. 3). По всей вероятности, выявленная закономерность связана с участием амидных производных салициловой кислоты в реакции нерадикального разрушения гидропероксидов. Для подтверждения гипотезы о возможном разрушении гидропероксидов под действием «гибридных» АО были проведены эксперименты по прямому тестированию кинетики накопления гидропероксидов (ROOH) после введения в частично окисленную линолевую кислоту каждого из исследуемых АО (рис. 5). Влияние всех АО было однотипным: после внесения ингибитора в течение первого часа наблюдалось снижение концентрации гидропероксидов практически до исходного уровня, который в дальнейшем не возрастал в течение всего периода наблюдений (8 часов). В контроле гидропероксиды продолжали накапливаться. По масштабу разрушения гидропероксидов исследуемые АО были сравнимы между собой, однако у осалмида указанные свойства были наиболее выражены. Установлено, что все исследуемые соединения способствовали разрушению гидропероксидов на 70–75 % (табл. 4).

Рис. 3. Кинетические кривые поглощения кислорода МО в среде хлорбензола в присутствии АО: 1 – контроль; 2 – a-токоферол; 3 – дибунол; 4 – Амид (II); 5 – Амид (III); 6 – Амид (IV); 7 – Амид (I); С(АО) = 2∙10–4 М, Wi = 4,2∙10–8 М∙c–1, t = 60 °С. Номер антиоксиданта соответствует рис. 1

Рис. 4. Зависимость периодов индукции от концентрации АО: 1 – дибунол; 2 – Амид (IV); 3 – Амид (III); 4 – Амид (II); 5 – a-токоферол; 6 – Амид (I); Wi = 4,2∙10–8 М∙c–1, t = 60 °С. Номер антиоксиданта соответствует рис. 1

Таблица 3

Кинетические параметры инициированного окисления метилолеата в присутствии различных концентраций исследуемых антиоксидантов, номер антиоксиданта соответствует рис. 1, Wi = 4,2∙10–8 М∙c–1, t = 60 °С

Рис. 5. Кинетика накопления гидропероксидов при аутоокислении линолевой кислоты в присутствии равных концентраций АО: 1 – контроль; 2 – Амид (II); 3 – Амид (III); 4 – Амид (IV); 5 – Амид (I). Стрелкой показан ввод АО. С(АО) = соnst = 2∙10–4 M, t = 60 °C. Номер антиоксиданта соответствует рис. 1

Таблица 4

Кинетика разрушения гидропероксидов при аутоокислении линолевой кислоты в присутствии равных концентраций АО, С(АО) = соnst = 2∙10–4M, номер антиоксиданта соответствует рис. 1, t = 60 °C

Следовательно, изучаемые соединения в процессе окисления способны как эффективно уничтожать пероксильные радикалы, так и разрушать гидропероксиды молекулярным путем. Вероятно, что антирадикальная активность ингибиторов обусловлена присутствием в их химической структуре фенольного гидроксила, а способность разрушения гидропероксидов связана с наличием амидной группы. Полученные результаты могут служить методологической основой для оценки комплексного действия антиоксидантов, перспективных для стабилизации окисления пищевых и биологически активных липидов, лекарственных препаратов, косметических средств. Исследуемые АО малотоксичные и могут использоваться в медицине, косметологии, пищевой технологии. Антиоксидантные свойства новых перспективных амидов салициловой кислоты защищены патентами на изобретение.

Выводы

1. Изучена кинетика окисления модельного субстрата в присутствии новых перспективных производных салициловой кислоты. Показано, что все амиды салициловой кислоты (I–IV) эффективно тормозят процесс окисления метилолеата.

2. Хемилюминесцентным методом определены значения констант скорости реакции k7 антиоксидантов (I–IV) с пероксильными радикалами (0,52–6,86)∙104 М–1∙с–1.

3. Установлено, что введение экранирующих орто-трет-бутильных заместителей и разделение ароматических фрагментов тремя метиленовыми группами приводит к увеличению антиоксидантной активности соединений.

4. Показано, что введение экранирующих орто-трет-бутильных заместителей и разделение ароматических фрагментов тремя метиленовыми группами приводит к уменьшению значений констант скорости реакции k7 с антиоксидантами.

5. Установлена способность амидов салициловой кислоты (I–IV) при аутоокислении линолевой кислоты разрушать гидропероксиды до 70–75 % без образования свободных радикалов.

6. На основе полученных данных можно рекомендовать осуществление синтеза потенциальных антиоксидантов, у которых экранированная фенольная ОН-группа должна находиться в пара-положении к амидной группе, что исключит возможность образования внутримолекулярной водородной связи.

7. Антиоксидантные свойства новых перспективных амидов салициловой кислоты защищены патентами на изобретение. Изобретения относятся к получению состава, стабилизирующего процесс окисления липидов, липидосодержащих пищевых добавок, лечебно-косметических средств, лекарственных препаратов. Технический результат изобретения – расширение ассортимента эффективных синтетических антиоксидантов, достижение высоких эффектов ингибирования при меньших концентрациях соединений.

Ерёмин Д.И., д.б.н., профессор кафедры почвоведения и агрохимии, ФГБОУ ВПО «Государственный аграрный университет Северного Зауралья», г. Тюмень;

Грехова И.В., д.б.н., профессор кафедры общей химии, ФГБОУ ВПО «Государственный аграрный университет Северного Зауралья», г. Тюмень.

Работа поступила в редакцию 26.02.2015.