Каталитические свойства микробных ферментов позволяют эффективно трансформировать труднодоступные для химической модификации области молекулы природных стеролов. Микробиологическая трансформация данных соединений в андрост-4-ен-3,17-дион и андроста-1,4-диен-3,17-дион – ключевые интермедиаты в синтезе лекарственных гормональных препаратов является традиционной технологией, применяемой в промышленном производстве стероидов [6]. В исследованиях по микробиологической трансформации стеролов особое внимание уделяется представителям, выделяемым из отходов деревообрабатывающей промышленности (β-ситостеролу, в частности). Преимущество использования β-ситостерола и его аналогов заключается в тотальном распространении их в природе, доступности и относительно низкой стоимости исходного сырья [6]. Область исследования каталитических возможностей микроорганизмов в отношении данных соединений постоянно пополняется новыми данными, исследуется трансформирующая способность ранее мало используемых бактериальных штаммов и их мутантных клонов, проводится оптимизация биотрансформационного процесса в условиях добавления высоких концентраций стеролов и т. п. Ранее нами [1, 2, 4] с использованием нативных штаммов родококков, поддерживаемых в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (официальный акроним коллекции ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекций культур 768) [7], исследован процесс биотрансформации β-ситостерола в концентрациях 0,5–2,0 г/л. Определены основные метаболические пути его модификации, при этом в качестве продуктов обнаружены биологически активные соединения стигмаст-4-ен-3-он, андрост-4-ен-3,17-дион, андроста-1,4-диен-3,17-дион и ацетат β-ситостерола.

Цель настоящей работы – исследование трансформирующей активности нативных и мутантных штаммов родококков в отношении β-ситостерола в зависимости от его исходной (0,5-10 г/л) концентрации.

Материалы и методы исследования

В работе использовали чистые культуры родококков из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов (официальный акроним коллекции ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекций культур 768) [7], принадлежащие к видам Rhodococcus erythropolis (21 штамм) и R. ruber (8 штаммов). В отдельных экспериментах использовали мутантные клоны R. ruber ИЭГМ 231, полученные методом неспецифического in vivo Tn5-мутагенеза [3]. Для получения УФ мутантов клетки R. ruber ИЭГМ 381 выращивали в питательной среде (г/л): (NH4)2SO₄ – 2,0; K₂HPO₄ – 2,0; MgSO₄ – 0,1; CaCl₂×2H₂O – 0,01; FeSO₄×7H₂O – 0,01; глицерин – 10,0; дрожжевой экстракт – 4,0. Через 48 ч клетки стерильно отделяли от среды центрифугированием (15 мин, 3000 об/мин), трижды промывали фосфатно-щелочным буфером (KH₂PO₄/NaOH) pH 7,0. Полученную суспензию (OП600 2,5) облучали с помощью УФ лампы ДРТ-240 (Россия) в течение 5 мин. Химический мутагенез клеток R. ruber ИЭГМ 233, предварительно выращенных в мясопептонном бульоне и промытых ацетатным буфером pH 4,5, проводили в течение 10 мин при 28 ºС в 0,05 М растворе азотистой кислоты (HNO₂), затем для остановки реакции добавляли среду 1ХА [5]. Колонии УФ и HNO2 мутантов получали после высева клеточных суспензий на чашки Петри с мясопептонным агаром и инкубации в течение 24 ч при 28 °С.

Родококки выращивали в условиях периодического культивирования на орбитальной качалке Certomat IS «Sartorius» (Германия) (150 об/мин) при 28 °С. Базовый состав минеральной среды включал следующие компоненты (г/л): KNO₃ – 1,0; KH₂PO₄ – 1,0; K₂HPO₄×3H₂O – 1,0; NaCl – 1,0; MgSO₄×7H₂O – 0,2; СaCl₂×2H₂O – 0,02. В среду добавляли 1 г/л дрожжевого экстракта, 0,1 об. % раствора микроэлементов по Постгейту и 0,7 г/л н-гексадекана. В исследованиях по подбору оптимальных условий биотрансформации β-ситостерола в высоких концентрациях в среду вносили 1,2 г/л н-гексадекана и 0,015 г/л пальмитиновой кислоты. β-Ситостерол добавляли в инкубационную среду одновременно с инокулятом или через 48 ч роста родококков в концентрации 0,5; 2,0; 6,0 или 10,0 г/л в виде 10 % раствора в изопропаноле или смеси с β-циклодекстрином (1:1) в 1,2 % водном растворе Твина-80. Исследования по биотрансформации β-ситостерола нерастущими клетками проводили в фосфатно-щелочном буфере (KH₂PO₄/NaOH) pH 6, 7 или 8.

В качестве посевного материала использовали родококки (5,0×10⁵ клеток/мл), выращенные на мясопептонном агаре и отобранные в экспоненциальной фазе роста. Эксперименты по биотрансформации β-ситостерола нерастущими клетками родококков проводили с использованием бактериальных культур, выращенных на агаризованной среде состава (г/л): K₂HPO₄ – 1,0; (NH₄)2HPO₄ – 1,5; MgSO₄ × 7H₂О – 0,1; FeSO₄ × 7H₂О – 0,01; ZnSO₄ × 7H₂О – 0,002; глюкоза – 5,0, дрожжевой экстракт – 10,0 с добавлением 0,2 г/л β-ситостерола в виде 10 % раствора в изопропаноле.

В работе применяли реактивы российских производителей марки «х.ч.» или «ч.д.а.» и фирмы «Sigma-Aldrich» (США). В экспериментах использовали β-ситостерол 70,0 % чистоты «Sigma-Aldrich» (США). Образец стигмаст-4-ен-3-она получен из Новосибирского института органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН, ацетат β-ситостерола синтезировали как описано ранее [1]. Продукты микробного окисления β-ситостерола экстрагировали этилацетатом (3×50 мл). Объединенные экстракты высушивали над Na2SO4, растворитель удаляли на роторном испарителе. Качественный и количественный состав полученных смесей анализировали методом тонкослойной хроматографии с использованием пластин «Sorbfil» марки ПТСХ-АФ-А-УФ фирмы ЗАО «Сорбполимер» (Россия) [4], УФ-спектроскопии на спектрофотометре Lambda EZ201 «Perkin-Elmer» (США) и хроматомасс-спектрометрической системы Agilent 6890/5973N (кварцевая колонка HP-5MS SN US 15189741-1) «Agilent technology» (США). Эксперименты проводили в 3-кратной повторности. Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием программы Excel 2003, рассчитывая среднее арифметическое и стандартную ошибку.

Результаты исследования и их обсуждение

По нашим данным, представители R. ruber эффективно (55–98 %) трансформируют β-ситостерол (0,5 г/л) с образованием стигмаст-4-ен-3-она при условии добавления исходного стерола через 2 суток роста бактериальных клеток в среде с н-гексадеканом (рис. 1, А). Генетическая модификация штаммов, обладающих в присутствии н-гексадекана низкой стеролтрансформирующей активностью, методом неспецифического in vivo Tn5-мутагенеза позволяет значительно повысить их способность к биотрансформации β-ситостерола. Получены мутантные клоны Tn5-11, Tn5-25, Tn5-29, Tn5-37, катализирующие 60 % конверсию β-ситостерола в стигмаст-4-ен-3-он, что в 4 раза выше таковой исходной культуры R. ruber ИЭГМ 231 (рис. 1, Б).

В отдельных экспериментах установлено, что внесение в среду с н-гексадеканом 0,15 г/л пальмитиновой кислоты в качестве индуктора ферментативной активности представителей вида R. erythropolis обеспечивает эффективное получение стигмаст-4-ен-3-она при добавлении β-ситостерола одновременно с инокулятом. В результате исследования способности родококков трансформировать β-ситостерол в концентрации 2,0 г/л выявлено, что степень образования стигмаст-4-ен-3-она при использовании Твина-80 в качестве растворителя исходного стерола в среднем составляет 19 %. Лишь отдельные штаммы R. erythropolis (ИЭГМ 10 и ИЭГМ 487, в частности) катализируют 44,9–49,5 % конверсию β-ситостерола в целевой продукт. Более высокая степень биотрансформации β-ситостерола достигается в условиях его добавления в виде смеси с β-циклодекстрином (β-ЦД) и Твином-80, при этом каталитическая активность штаммов R. erythropolis, как правило, в 1,1–6,0 раз превышает таковую R. ruber. Максимальная (77,3–79,1) степень биотрансформации β-ситостерола в стигмаст-4-ен-3-он регистрируется при использовании R. erythropolis ИЭГМ 179 и ИЭГМ 487 (рис. 2).