Основной задачей энзимологии с момента ее возникновения является построение единой теории ферментативного катализа [1, 5, 6].

Нами предлагается кинетический подход к кластерной организации ферментативного катализа. Основным положением данной гипотезы является то, что в процессе ферментативного катализа изменяется кластерно-кинетическая организация фермента в среде.

Кинетический энзимокла́стер (англ. cluster - скопление) - динамическое объединение нескольких гомо- (гетеро-) конформеров фермента в процессе катализа, которое может рассматриваться как самостоятельная единица, обладающая определёнными свойствами.

Предполагается, что для любых ферментов как минимум существуют два основных ферментативных конформера: каталитический и агрегационный (рис. 1). Каталитический конформер характеризуется тем, что при объединении субъединиц в единое целое все активные центры фермента остаются активными. В противоположность ему агрегационный конформер характеризуется такой пространственной организацией, при которой часть активных центров фермента экранируются (см. рисунок). В целом, каждый энзимокластер представлен взаимодействием различного отношения каталитических и агрегационных конформеров между собой. В результате получаются три кинетических варианта энзимокластера:

1. При равном количестве каталитических и агрегационных конформеров у фермента практически не проявляются кооперативные свойства его субъединиц (коэффициент кооперативности (Kn) = 1).
2. Когда количество каталитических конформеров больше, чем агрегационных, у фермента имеет место положительная кооперативность взаимодействия субъединиц (Kn > 1).
3. Если больше агрегационных конформеров, чем каталитических, то фермент обладает отрицательной кооперативностью (Kn < 1).

В процессе кинетики ферментативной реакции происходят постоянные динамические кластеро-кинетические переходы белка-фермента из одной формы в другую, которые можно экспериментально выявить.

Целью исследования явилось применение кластеро-кинетической гипотезы ферментативного катализа для объяснения особенностей кинетических свойств некоторых оксидоредуктаз (алкогольдегидрогеназы (АДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ)).

Исследования проводили на очищенном препарате АДГ из печени лошади («Sigma», США) и очищенном препарате ЛДГ из мышцы свиньи (фирмы Reanal). Определяли каталитическую активность алкогольдегидрогеназы в прямой (АДГ_пр) и обратной реакциях (АДГ_обр), активность лактатдегидрогеназы в прямой (ЛДГ_пр) и обратной реакции (ЛДГ_обр). Рассчитывали интегративные кинетические характеристики: Кt (показатель сродства фермента к субстрату), Vmax (максимальная скорость реакции фермента), Kn (коэффициент кооперативности) [2, 3, 4]. Статистический анализ результатов исследований выполнен с использованием программы Statistica 6.

В результате проведенных исследований кинетических свойств очищенных ферментов установлено, что сродство энзимокластера ЛДГ к субстратам реакции, максимальная скорость и каталитическая эффективность в целом выше, чем у энзимокластера АДГ (табл. 1).

Примечание: p - различия статистически значимы между показателями прямой и обратной реакций.

Из табл. 1 видно, что сродство к субстратам реакции выше для ЛДГ_пр по сравнению с ЛДГ_обр. Максимальная скорость реакции в 2 раза больше для обратной лактатдегидрогеназной реакции по сравнению с прямой. Таким образом, Kt¹ ЛДГ_пр < Kt¹ ЛДГ_обр, а Vmax¹ ЛДГ_обр > Vmax¹ ЛДГ_пр. В данном случае имеет место кластеро-кинетический механизм ферментативной реакции по типу псевдоактивации ЛДГ. Следует отметить, что у ЛДГ проявляется отрицательная кооперативность ее субъединиц, которая указывает на образование агрегационных конформеров данного фермента.

Для АДГ_пр и АДГ_обр наблюдается схожая кинетическая зависимость, только с другими значениями сродства к субстратам реакции и Vmax. Для алкогольдегидрогеназы кластеро-кинетический механизм ферментативной реакции представлен по типу псевдоактивации. При этом АДГ_пр имеет положительную кооперативность взаимодействующих субъединиц фермента, а АДГ_обр - отрицательную. Можно предположить, что прямая алкогольдегидрогеназная реакция связана с каталитическими конформерами фермента, а обратная - преимущественно с агрегационными конформерами.

Несомненно, что определяющим фактором изменения кинетических характеристик оксидоредуктаз является физико-химическое состояние среды, в которой происходит ферментативная реакция.

Для изменения физико-химических условий проведения ферментативной реакции оксидоредуктаз в среду буфера добавлялись сразу два фермента (ЛДГ, АДГ) и определялась каталитическая активность каждого в отдельности (табл. 2).

Примечание: p - различия статистически значимы между показателями прямой и обратной реакций; * - различия статистически значимы по сравнению с показателями очищенного фермента при наличии в растворе одного фермента (p ≤ 0,05).

Из табл. 2 следует, что присутствие в растворе одновременно двух ферментов в равном количестве оказывает влияние на кинетические свойства как ЛДГ, так и АДГ. Для ЛДГ_пр кинетика ферментативной реакции изменяется по типу неконкурентного ингибирования, когда Kt¹ ЛДГ_пр = Kt² ЛДГ_пр, а Vmax² ЛДГ_пр < Vmax¹ ЛДГ_пр. Кинетика лактатдегидрогеназы в обратной реакции представлена по типу двухпараметрической рассогласованной активации, Kt² ЛДГ_обр > Kt¹ЛДГ _обр, а Vmax² ЛДГ_обр > Vmax ¹ЛДГ_обр. Кинетические показатели прямой алкогольдегидрогеназной реакции практически не изменяются при наличии в растворе одновременно двух ферментов. Для АДГ_обр кинетика ферментативной реакции представлена по типу бесконкурентного ингибирования, где Kt ²АДГ_обр < Kt¹ АДГ_обр, а Vmax² АДГ_обр < Vmax¹ АДГ (см. табл. 1, 2).
При этом присутствие в среде одновременно двух ферментов существенно сказывается на их отрицательной кооперативности в процессе образования энзимо- кластеров.

В итоге можно сделать заключение, что изменение микроокружения фермента, в частности оксидоредуктаз (алкогольдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы), приводит к трансформации их конформеров (каталитических и агрегационных), что в свою очередь сказывается на образовании энзимокластера, проявляющего различные кинетические свойства. Данный кинетический подход, несомненно, важен для дальнейшего развития исследований в области современной энзимологии, особенно при изучении свойств ферментов, входящих в состав сложной гетерогенной системы клетки.

• Корягин А.С., д.б.н., профессор кафедры физиологии и биохимии человека и животных ГОУ ВПО «ННГУ им. Н.И. Лобачевского», г. Нижний Новгород;
• Веселов А.П., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биохимии и физиологии растений, декан биологического факультета ГОУ ВПО «ННГУ им. Н.И. Лобачевского», г. Нижний Новгород.

Работа поступила в редакцию 05.07.2012.