Многочисленные исследования суточных (циркадианных) ритмов большинства физиологических процессов позволили разработать хронобиологические подходы к диагностике и лечению многих заболеваний [1, 3, 11]. Однако, помимо суточных колебаний, любому организму присущи ультрадианные (период меньше 20 ч), инфрадианные (околонедельный период), сезонные и многолетние биоритмы [1, 3, 7, 8].

Ранее нами был выявлен устойчивый 4-суточный инфрадианный ритм уровня тестостерона в сыворотке крови крыс-самцов Вистар, содержащихся в изоляции от самок [2]. Сходный (около 4-суточный) период колебаний уровня кортикостерона в сыворотке крови крыс был установлен в работе R. Jozsa и соавт. [8]. Тестостерон и кортикостерон - стероидные гормоны, обладающие разносторонним регулирующим действием на организм. В том числе, выявлено влияние этих гормонов на клеточный и гуморальный ответ иммунной системы [6]. Известно, что даже непродолжительное стрессорное воздействие, при котором возрастает уровень стероидных гормонов, вызывает увеличение числа лейкоцитов в периферической крови экспериментальных животных [9]. Это объясняется тем, что лейкоциты, являющиеся одним из компонентов клеточного иммунитета, выполняют защитные функции, обеспечивая фагоцитоз микробов, инородных веществ и т.д. Работ, посвященных взаимосвязи инфрадианных ритмов стероидных гормонов и колебаний числа нейтрофилов - самых многочисленных представителей лейкоцитов в периферической крови, практически нет. В то же время, такие сведения важны при разработке хронобиологических подходов к диагностике и лечению ряда заболеваний.

Целью данной работы было исследование у крыс-самцов Вистар инфрадианных колебаний уровня кортикостерона, тестостерона, процентного содержания нейтрофилов в периферической крови и выявление взаимосвязи инфрадианных ритмов этих показателей.

Работа выполнена на 236 половозрелых самцах (масса 190-230 г) крыс Вистар (питомник Столбовая). При работе с экспериментальными животными руководствовались приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н. На проведение эксперимента получено разрешение биоэтической комиссии ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН (протокол № 8). Животных содержали группами по 6-10 особей в максимально стандартных условиях, в изоляции от самок. Клетки с животными были расположены так, чтобы исключить возможное влияние зрительного, акустического и ольфакторного каналов передачи информации на синхронизацию активности между животными разных групп. В помещении поддерживался фотопериод, имитирующий естественный для Москвы световой день, и постоянная температура +24°С.

В сериях эксперимента, проводимых 17-29 марта (по 8 голов в сутки, n = 104) и 11-27 сентября (по 6 голов в сутки, n = 102) 2011 г., пробы крови из хвостовой вены разных крыс забирали ежедневно в 8.00-8.30 ч утра по местному солнечному времени (Москва), под эфирным наркозом. Забор крови у разных животных обеспечивал наименьший стресс от хендлинга (от англ. handling - обработка, в данном случае приучение к условиям эксперимента). В следующих сериях, проводимых ежедневно 5-21 мая (n = 7), 3-16 июля (n = 6), и 8-20 октября (n = 10) 2011 г., забор крови из хвостовой вены производили также в 8.00-8.30 ч утра, ежедневно, но у одних тех же животных при кратковременной иммобилизации. В последней серии 3-15 января 2012 г. (n = 7) забор крови производили ежедневно в 10.15-10.45 ч утра, у одних и тех же крыс под эфирным наркозом. Забор крови с 8 до 11 ч утра по местному солнечному времени (Москва) соответствует утреннему максимуму содержания стероидных гормонов в сыворотке крови [3, 8].

Образцы сывороток хранили не более 6 мес. при температуре -70°С. Уровень кортикостерона в сыворотке крови определяли с помощью иммуноферментных (ИФА) наборов «IBL» (Германия), тестостерона - «DBC» (Канада), используя микропланшетный ИФА анализатор «ANTHOS 2010» (Австрия).

В сериях эксперимента 17-29 марта 2011 г. (n = 8) и с 8 по 20 октября 2011 г. (n = 10) производили определение процентного содержания нейтрофилов в мазках периферической крови, окрашенных по Романовскому-Гимзе.

Исследования проводили с учетом состояния геомагнитной обстановки (данные Института земного магнетизма, ионосферы и распространения радиоволн им. Н.В. Пушкова РАН).

Статистическую обработку полученных результатов проводили, используя программу «Statistica 6.0». В соответствии с характером распределения был выбран непараметрический метод. Достоверность различий между показателями определяли по U-критерию Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

В серии эксперимента 17-29 марта 2011 г. (разные животные, эфирный наркоз) наиболее стабильный инфрадианный ритм наблюдался в колебаниях уровня тестостерона (табл. 1). В дни с повышенной степенью возмущенности геомагнитного поля (22 и 23 марта) 4-суточный ритм изменений уровня кортикостерона был нарушен, тогда как биоритм тестостерона был сохранен. Известно, что геомагнитные бури могут вызывать десинхроноз у млекопитающих и человека, нарушая биологические ритмы продукции стероидных гормонов и мелатонина - наиболее важного синхронизатора биоритмов в организме [5, 7, 10]. В наших экспериментах максимальные (18 и 26 марта) и минимальные (20 и 28 марта) значения содержания нейтрофилов в периферической крови наблюдались в то же время, что и у кортикостерона, установлен 4-суточный ритм изменения этого показателя (табл. 1). В период нарушения ритма кортикостерона (20-24 марта) колебания процентного содержания гранулоцитов в периферической крови не имели периодичности, что указывает на взаимосвязь этих показателей. Коэффициент корреляции между уровнем кортикостерона и процентного содержания нейтрофилов в крови был равен 0,45.

В серии эксперимента с 8 по 20 октября 2011 г. (одни и те же животные, хендлинг, иммобилизация) динамика уровней кортикостерона и тестостерона имела 4-суточную периодичность, максимальные значения (акрофаза) наблюдались 10, 14, 18, а минимальные (батифаза) - 8, 12, 16, 20 октября (рисунок). Динамика процентного содержания нейтрофилов в периферической крови также имела 4-суточную периодичность, совпадала по фазе и коррелировала положительно (коэффициент корреляции r = 0,73) с уровнем стероидных гормонов (см. рисунок). Значения всех показателей в акрофазе и батифазе достоверно различались между собой на протяжении всего времени наблюдения. В работе Т.П. Рябых и соавт. также установлен 4-суточный ритм изменения числа лейкоцитов в периферической крови у лабораторных мышей, однако авторы не проводили егосопоставление с уровнем стероидных гормонов [4].

В серии эксперимента 3-15 января 2012 г. (одни и те же крысы, хендлинг, эфирный наркоз) достоверные различия между акрофазой и батифазой уровня исследуемых стероидных гормонов наблюдались в первые 8 суток (табл. 2). В дальнейшем амплитуда колебаний уровня тестостерона и кортикостерона уменьшалась и различия стали недостоверными.

Показатели инфрадианных ритмов кортикостерона (К), тестостерона (Т) и процентного содержания нейтрофилов в периферической крови (Н) у крыс-самцов Вистар (в абсолютных величинах)

Примечания:

здесь и в табл. 2 указана медиана, в скобках - нижняя и верхняя квартили.

*p < 0,05 при сопоставлении соответствующих показателей на максимуме и минимуме инфрадианных ритмов.

Во всех остальных сериях эксперимента динамика уровня кортикостерона и тестостерона также имела достоверный 4-суточный период инфрадианного ритма (табл. 1, 2). Акрофаза и батифаза концентрации кортикостерона, тестостерона и процентного содержания нейтрофилов в периферической крови наблюдались в одни и те же календарные даты (табл. 1, 2). При исследовании 4-суточного ритма уровня стероидных гормонов в разных сериях эксперимента, проведенных на протяжении одиннадцати месяцев, было установлено, что каждые 69-73 сутки происходит скачкообразный переход акрофазы ритма на сутки вперед. Таким образом, более точный период колебаний уровня стероидных гормонов в сыворотке крови составляет 4,06 суток, который укладывается целое число раз в периоде обращения Земли вокруг Солнца.

Заключение

В настоящей работе во всех сериях эксперимента, произведенного в разных условиях, в разные сезоны и в разные годы, выявлен 4-суточный период инфрадианных ритмов колебания уровня стероидных гормонов (тестостерона и кортикостерона) и процентного содержания нейтрофилов в периферической крови здоровых половозрелых самцов крыс Вистар. Продемонстрировано совпадение по фазе периодов биологических ритмов исследованных показателей. Отмечена положительная корреляция между уровнем стероидных гормонов и процентным содержанием нейтрофилов в периферической крови. Установлено, что каждые 69-73 сутки происходит скачко-образный переход акрофазы ритмов на сутки вперед.

Инфрадианные 4-суточные ритмы исследуемых гормонов и процентного содержания нейтрофилов в периферической крови были выявлены при всех использованных методах забора крови, включающих различные стрессоры (эфир, иммобилизазию, хендлинг).

Полученные данные необходимо учитывать при проведении экспериментальных исследований с оценкой изменений функционального состояния эндокринной и иммунной системы, особенно для выявления индивидуальных различий при оценке эффектов воздействия физических факторов низкой интенсивности, малых доз химических соединений, биологически активных молекул.

• Орехов А.Н., д.б.н., профессор, директор Научно-исследовательского института атеросклероза Инновационного центра Сколково, Московская обл., Одинцовский район, деревня Сколково;
• Макарова О.В., д.м.н., профессор, заместитель директора по науке ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека», г. Москва.

Работа поступила в редакцию 09.07.2012.