Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,441

РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИСАХАРИДОВ В ТРАВЕ КУЛЬБАБЫ ОСЕННЕЙ (LEONTODON AUTUMNALIS L.)

Бубенчиков Р.А. 1 Гончаров Н.Н. 1
1 ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет»
В ходе проведения исследования была разработана методика гравиметрического определения водорастворимых полисахаридов в траве кульбабы осенней, основанная на их осаждении спиртом этиловым 96 %. Подобраны оптимальные условия, экстрагирования и осаждения суммы полисахаридов. Установлено, что наиболее полное извлечение полисахаридом достигается при степени измельчения 1 мм, четырехкратной экстракцией водой очищенной в течение 30 минут и соотношением сырье–экстрагент 1:3. Валидацию методики количественного определения проводили по показателям: линейности, повторяемости и воспроизводимости. На основании полученных результатов установлено, что в пределах измеряемых концентраций зависимость содержания водорастворимых полисахаридов от массы навески сырья носит линейный характер. Полученные значения коэффициентов корреляции и относительного стандартного отклонения позволяют использовать разработанную методику для определения полисахаридов в указанном диапазоне концентраций. Установлено содержание водорастворимых полисахаридов в траве кульбабы осенней, собранной в различных годах и местах произрастания.
Полисахариды
кульбаба осенняя
методика количественного определения
валидация
1. Бубенчикова В.Н. Состав и отхаркивающая активность водорастворимых полисахаридных комплексов девясила иволистного / В.Н. Бубенчикова, А.В. Азарова // Научные ведомости БелГУ. Серия: Естественные науки. – 2011. – № 9 (104). – Вып. 15/2. – С. 188–190.
2. Бубенчикова В.Н. Фенольные соединения и полисахариды подмаренника цепкого (Galium Aparine L.) / В.Н. Бубенчикова, Ю.А. Старчак // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». – 2008. – № 3. – С. 117–121.
3. Государственная фармакопея СССР. XI издание. Общие методы анализа. – М.: Медицина, 1987. – Вып. 1. – 336 с.
4. Криштанова Н.А. Перспективы использования растительных полисахаридов в качестве лечебных и лечебно-профилактических средств / Н.А. Криштанова, М.Ю. Сафонова, В.Ц. Болотова и др. // Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. – 2005. – №1. – С. 212–221.
5. Лесиовская Е.Е. Фармакотерапия с основами фитотерапии. 2-е изд./ Е.Е. Лесиовская, Л.В. Пастушенков. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. – 592 с.
6. Медведева Е.Н. Получение высокочистого арабиногалактана лиственницы и исследование его иммуномодулирующих свойств / Е.Н. Медведева, В.А. Бабкин, О.А. Макаренко // Химия растительного сырья. – 2004. – № 4. – С. 17–23.
7. Моисеева Г.Ф. Иммуностимулирующие полисахариды высших растений / Г.Ф. Моисеева, В.Г. Беликов // Фармация. – 1992. – № 3. – С. 79–84.
8. Муравьева Т.И. Фармакосанирующие эффекты полисахаридов растительного происхождения: автореф. дис. канд. мед. наук. – Владивосток, 1999. – 24 с.
9. Пилат Т.Л. Биологически активные добавки к пище (теория, производство, применение) / Т.Л. Пилат, А.А. Иванов. – М.: Аввалон, 2002. – 710 с.

В последнее время значительно возросло значение полисахаридов для медицинской и фармацевтической практики. Фитопрепараты на основе полисахаридов применяют в качестве отхаркивающих и противовоспалительных средств [1, 5], известны их обволакивающие и мягчительные свойства [9], антигипоксическое, антиоксидантное, гепатопротекторное и радиопротекторное действие [8]. Некоторые полисахариды оказались эффективными антиульцерогенными агентами [4]. Многие исследователи связывают с полисахаридами иммуномодулирующие свойства растений и фитопрепаратов на их основе [6, 7]. В литературе есть данные о противоопухолевой активности полисахаридов [4], а также сведения об их способности восстанавливать работоспособность, что активно используется в спортивной медицине [4].

Широкий спектр фармакологической активности полисахаридов обуславливает необходимость разработки и совершенствования методов их анализа.

Цель настоящей работы – разработка методики количественного определения полисахаридов в траве кульбабы осенней и ее валидация.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования служила трава кульбабы осенней, заготовленная на территории Курской области в 2013–2014 г. в период массового цветения растений.

Наиболее доступным и распространенным методом для анализа растительного сырья, содержащего полисахариды, является гравиметрический метод, основанный на экстракции суммы полисахаридов из сырья с последующим осаждением их спиртом этиловым 96 % [2, 3].

Поэтому нами для анализа травы кульбабы осенней разработана методика гравиметрического определения полисахаридов. При этом изучены такие стадии, как экстрагирование суммы полисахаридов и условия осаждения полисахаридов.

Статистическую обработку полученных данных вели по общепринятой методике с использованием t-критерия Стьюдента [3], а также с помощью программы Microsoft Excel 2010.

Результаты исследования и их обсуждение

При установлении количественного содержания полисахаридов в траве кульбабы осенней нами изучены и выявлены оптимальные условия анализа: степень измельченности сырья, время экстракции, температура экстракции, типа экстрагента, соотношение сырье-экстрагент (табл. 1).

Таблица 1

Влияние условий экстракции на содержание полисахаридов в траве кульбабы осенней

Условия

экстракции

Содержание

полисахаридов в %

1

2

Время экстракции, мин

30 60 (2х30)

90 (3х30) 120 (4х30)

4,23

6,16

9,19

9,68

Степень измельчения, мл

1,0

2,0

3,0

9,68

4,68

4,05

Соотношение извлечения и спирта 96 % этилового

1:1

1:2

1:3

1:4

3,89

6,60

9,68

9,77

Было установлено, что наиболее полное извлечение полисахаридов из травы кульбабы осенней достигается при использовании четырехкратной экстракции по 30 минут со степенью измельчения сырья 1,0 мм и при соотношении извлечения и спирта этилового 96 % 3:1.

На основании проведенных исследований разработана методика количественного суммы полисахаридов в траве кульбабы осенней.

Количественное определение полисахаридов в траве кульбабы осенней. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1 мм. Около 10,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 100 мл воды очищенной, колбу присоединяют к обратному холодильнику и кипятят при перемешивании на электрической плитке в течение 30 минут. Экстракцию повторяют трижды, прибавляя по 100 мл воды очищенной в течение 30 минут каждый раз. Водные извлечения объединяют, центрифугируют с частотой вращения 5000 об/мин в течение 10 минут и декантируют в мерную колбу вместимостью 500 мл через 5 слоев марли, вложенной в стеклянную воронку диаметром 66 мм и предварительно смоченной водой. Фильтр промывают водой и доводят объем раствора водой до метки (раствор А).

25 мл раствора А помещают в центрифужную пробирку, прибавляют 75 мл 96 % спирта этилового, перемешивают, подогревают на водяной бане при температуре 60 °С в течение 5 минут. Через 30 минут содержимое центрифугируют с частотой вращения 5000 об/мин в течение 30 минут.

Надосадочную жидкость фильтруют под вакуумом при остаточном давлении 13–16 кПа через высушенный до постоянной массы при температуре 100–105 °С стеклянный фильтр ПОР 16 диаметром 40 мм. Затем осадок количественно переносят на тот же фильтр и промывают 15 мл смеси спирта этилового 96 % и воды (4:1). Фильтр с осадком высушивают сначала на воздухе, затем при температуре 100–105 °С до постоянной массы.

Содержание полисахаридов в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле

buben01.wmf,

где m1 – масса фильтра, г;

m2 – масса фильтра с осадком, г;

m – масса сырья, г;

w – потеря в массе при высушивании сырья, %.

Валидацию методики количественного определения проводили по показателям: линейности, повторяемости и воспроизводимости [11].

Для установления диапазона использования методики получали извлечения различной концентрации. Для этого согласно разработанной методике получали извлечения из навесок массой 2,0, 4,0, 6,0, 8,0, 10,0 г (точные навески). Градуировочный график представлен на рисунке.

Критерием приемлемости линейности является коэффициент корреляции. Если его величина близка к единице, то совокупность данных можно описать прямой линией.

На основании полученных результатов установлено, что в пределах измеряемых концентраций зависимость содержания полисахаридов от массы навески носит линейный характер (рисунок и табл. 2).

Коэффициент корреляции составил 0,999964, что свидетельствует о том, что данную методику можно использовать для анализа полисахаридов в указанном диапазоне концентраций.

Повторяемость методики определяли на одном образце сырья в 6 повторностях. Критерий приемлемости выражался величиной относительного стандартного отклонения, который составил 4,03 % (табл. 3), что свидетельствует о прецизионности методики в условиях повторяемости.

Воспроизводимость определяли 2 аналитика на 3 образцах в 3 повторностях. Относительное стандартное отклонение не превышало 6,95, что свидетельствует о прецизионности методики в условиях воспроизводимости (табл. 4).

bub1.wmf

Зависимость содержания суммы полисахаридов от массы навески сырья

Таблица 2

Результаты статистической обработки данных, полученных при изучении линейной зависимости вида у = bx + a

F

buben02.wmf

buben03.wmf

b

a

R

3

0,0325

6.00032

181,0267

0,116953

0,999964

Таблица 3

Содержание полисахаридов в траве кульбабы осенней

№ п/п

Содержание полисахаридов, %

Метрологические характеристики

1

9,54

Хср = 9,69

Sx2 = 0,02331

Sxcp = 0,1527

∆x = 0,39

Eотн = 4,03

Хср + ∆xср = 9,69 + 0,39

2

9,86

3

9,66

4

9,59

5

9,57

6

9,89

Таблица 4

Определение воспроизводимости разработанной методики

Повторность

Аналитик

Содержание суммы полисахаридов в траве кульбабы осенней ( %)

Образец № 1

Образец № 2

Образец № 3

1

1

9,54

9,40

9,96

2

1

9,86

9,53

10,16

3

1

9,66

9,31

9,71

4

2

9,59

9,02

10,42

5

2

9,57

8,86

10,24

6

2

9,89

9,15

10,15

Среднее значение

9,69

9,21

10,11

Погрешность измерения (∆Х)

± 0,39

± 0,64

± 0,63

Относительное стандартное отклонение, (RSD)

4,03

6,95

6,23

По разработанной методике изучали содержание полисахаридов в траве кульбабы осенней, собранной в различных годах и местах произрастания (табл. 5).

Таблица 5

Содержание суммы водорастворимых полисахаридов в траве кульбабы осенней

Место и год сбора сырья

Содержание

полисахаридов, %

Курская область,

окрестности г. Курска, 2013 г.

9,69 ± 0,39

Курская область,

окрестности г. Курска, 2014 г.

9,21 ± 0,64

Курская область,

Курский район, 2014 г.

10,11 ± 0,63

Анализируя данные таблицы, можно отметить, что в траве кульбабы осенней содержание полисахаридов колеблется от 8,57 % до 10,74 % .

Выводы

1. Нами впервые разработана методика гравиметрического определения полисахаридов в траве кульбабы осенней (Leontodon autumnalis L.). Содержание суммы полисахаридов в сырье кульбабы осенней колеблется от 8,57 % до 10,74 %.

2. Проведена валидация разработанной методики по показателям линейности, повторяемости и воспроизводимости.

Рецензенты:

Раздорская И.М., д.фарм.н., профессор, заведующая кафедрой управления и экономики фармации ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России, г. Курск;

Сипливая Л.Е., д.б.н., профессор, заведующая кафедрой фармацевтической, токсикологической и аналитической химии ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России, г. Курск.

Работа поступила в редакцию 02.02.2015.


Библиографическая ссылка

Бубенчиков Р.А., Гончаров Н.Н. РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИСАХАРИДОВ В ТРАВЕ КУЛЬБАБЫ ОСЕННЕЙ (LEONTODON AUTUMNALIS L.) // Фундаментальные исследования. – 2015. – № 2-2. – С. 319-322;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=36809 (дата обращения: 21.01.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074