Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,441

ПОДХОДЫ К МОДИФИКАЦИИ ИСКУССТВЕННЫХ МАТРИКСОВ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫМИ МОЛЕКУЛАМИ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ КРОВЕНОСНЫХ СОСУДОВ

Севостьянова В.В. 1 Антонова Л.В. 1 Барбараш Л.С. 1
1 ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний»
Недостаток аутологичных кровеносных сосудов малого диаметра для проведения шунтирующих операций привел к многочисленным попыткам создания тканеинженерных кровеносных сосудов. Достаточно перспективным и вызывающим большой интерес исследователей является использование ростовых факторов и хемокинов, участвующих в ангиогенезе, для стимуляции формирования кровеносных сосудов на тканеинженерных графтах. Интересным является то, что результаты большинства исследований свидетельствуют о важности использования в качестве способа доставки биомолекул в место регенерации тканей биосовместимых материалов, которые могут обеспечить контроль над выходом ростовых факторов и сохранением их биологической активности. В настоящем обзоре описаны основные биологически активные молекулы, которые могут быть использованы в сосудистой тканевой инженерии. Кроме того, в работе представлены основные существующие способы локальной доставки биомолекул с использованием различных природных и синтетических материалов и эффективность их применения.
тканевая инженерия
сосудистый графт
биоматериалы
ростовые факторы
1. Бокерия Л.А. Повторные операции у больных ишемической болезнью сердца – современное состояние проблемы // Бюллетень НЦССХ им. Бакулева РАМН. – 2009. – Т. 10, № 3. – С. 5–27.
2. Севостьянова В.В. Свойства тканеинженерных матриц из поликапролактона, импрегнированных ростовыми факторами VEGF и bFGF // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. – 2012. – Т. 7, № 4. – С. 62–67.
3. Севостьянова В.В. Стимуляция ангиогенеза матрицами из поликапролактона, содержащими VEGF // Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. – 2013. – № 4. – С. 28–34.
4. Andrae J., Gallini R., Betsholtz C. Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine // Genes Dev. – 2008. – № 22. – P. 1276–1312.
5. Bajpai V.K., Andreadis S.T. Stem cell sources for vascular tissue engineering and regeneration // Tissue Eng. Part B, Rev. – 2012. – Vol. 18, № 5. – P. 405–425.
6. Berglund J.D., Galis Z. S. Designer blood vessels and therapeutic revascularization // Br. J. Pharmacol. – 2003. – Vol. 140, № 4. – P. 627–636.
7. Bilodeau K., Mantovani D. Bioreactors for tissue engineering: focus on mechanical constraints: a comparative review // Tissue Eng. – 2006 –Vol. 12, № 8. – P. 2367–2383.
8. Boontheekul T., Kong H.J., Mooney D.J. Controlling alginate gel degradation utilizing partial oxidation and bimodal molecular weight distribution // Biomaterials. – 2005. – № 26. – P. 2455–2465.
9. Briggs T., Arinzeh T.L. Growth factor delivery from electrospun materials // J. Biomater. Tissue Eng. – 2011. – Vol. 1, № 2. – P. 129–138.
10. Brindle N.P.J., Saharinen P., Alitalo K. Signaling and functions of angiopoietin-1 in vascular protection // Circ Res. – 2006. – № 98. – P. 1014–1023.
11. Crombez M. Improving arterial prosthesis neo-endothelialization: application of a proactive VEGF construct onto PTFE surfaces // Biomaterials. – 2005. – Vol. 26, № 35. – P. 7402–7409.
12. Cross M.J., Claesson-Welsh L. FGF and VEGF function in angiogenesis: signalling pathways, biological responses and therapeutic inhibition // TRENDS in Pharmacological Sciences. – 2001. – Vol. 22, № .4. – P. 201–207.
13. de Visscher G. Improved endothelialization and reduced thrombosis by coating a synthetic vascular graft with fibronectin and stem cell homing factor SDF-1α // Acta Biomater. – 2012. – Vol. 8, № 3. – P. 1330–1338.
14. Doi K., Matsuda T. Enhanced vascularization in a microporous polyurethane graft impregnated with basic fibroblast growth factor and heparin // Journal of Biomedical Materials Research. – 1997. – Vol. 34. – P. 361–370.
15. Elcin A. E., Elcin Y. M. Localized angiogenesis induced by human vascular endothelial growth factor-activated PLGA sponge // Tissue eng. – 2006. –Vol. 12, № 4. – P. 959–968.
16. Ennett A.B., Kaigler D., Mooney D.J. Temporally regulated delivery of VEGF in vitro and in vivo // J. Biomed. Mater. Res A. –2006. – Vol. 79, № 1. – P. 176–184.
17. Felcht M. Angiopoietin-2 differentially regulates angiogenesis through TIE2 and integrin signaling // The journal of clinical investigation. – 2012. – Vol. 122, № 6. – P. 1991–2005.
18. Heidenhain A. Fibroblast and vascular endothelial growth factor coating of decellularized vascular grafts stimulates undesired giant cells and graft encapsulation in a rat model // Artif. Organs. – 2011. – Vol. 35, № 1. – P. E1–E10.
19. Hellström M. Role of PDGF-B and PDGFR-b in recruitment of vascular smooth muscle cells and pericytes during embryonic blood vessel formation in the mouse // Development. – 1999. – № 126. – P. 3047–3055.
20. Ho T.K. Stromal-cell-derived factor-1 (SDF-1)/CXCL12 as potential target of therapeutic angiogenesis in critical leg ischaemia // Cardiology Research and Practice. – 2012. – Vol. 2012. – Р. 143209.
21. Ji W. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications // Pharm Res. – 2011. – № 28. – P. 1259–1272.
22. Kane N. M. Pluripotent stem cell differentiation into vascular cells: a novel technology with promises for vascular re(generation) // Pharmacol. Ther. – 2011. – № . 129. – P. 29–49.
23. Kano M.R. VEGF-A and FGF-2 synergistically promote neoangiogenesis through enhancement of endogenous PDGF-B–PDGFR signaling // Journal of Cell Science. – 2005. – № 118. – P. 3759–3768.
24. Koyama N., Hart C.E., Clowes A.W. Different functions of the platelet-derived growth factor-alpha and -beta receptors for the migration and proliferation of cultured baboon smooth muscle cells // Circ. Res. – 1994. – Vol. 75, № 4. – P. 682–691.
25. Lee K., Silva E.A., Mooney D.J. Growth factor delivery-based tissue engineering: general approaches and a review of recent developments // J. R. Soc. Interface. – 2011. – № 8. – P. 153–170.
26. Liao I.C., Chew S.Y., Leong K.W. Aligned core-shell nanofibers delivering bioactive proteins // Nanomed. – 2006. – Vol. 1, № 4. – P. 465–471.
27. Maes C. Impaired angiogenesis and endochondral bone formation in mice lacking the vascular endothelial growth factor isoforms VEGF164 and VEGF188 // Mech. Dev. – 2002. – Vol. 111, № 1-2. – P. 61–73.
28. Nerem R. M., Seliktar D. Vascular tissue engineering // Annu. Rev. Biomed. Eng. – 2001. – № 3. – P. 225–243.
29. Pektok E. Degradation and healing characteristics of small-diameter poly(ɛ-caprolactone) vascular grafts in the rat systemic arterial circulation // Circulation. – 2008. – Vol. 118, № 24. – P. 2563–2570.
30. Poh M. Blood vessels engineered from human cells // Lancet. – 2005. – Vol. 365, № 9477. – P. 2122–2124.
31. Rabkin E., Schoen F. J. Cardiovascular tissue engineering // Cardiovasc. Pathol. – 2002. – Vol. 11, № 6. – P. 305–317.
32. Randone B. Dual role of VEGF in pretreated experimental ePTFE arterial grafts // J. Surg. Res. – 2005. – Vol. 127, № 2. – P. 70–79.
33. Rocha F.G. The effect of sustained delivery of vascular endothelial growth factor on angiogenesis in tissue-engineered intestine // Biomaterials. – 2008. – Vol. 29, № 19. – P. 2884–2890.
34. Sahoo S. Growth factor delivery through electrospun nanofibers in scaffolds for tissue engineering applications // J Biomed Mater Res A. – 2010. – Vol. 93, № 4. – Р. 1539–1550.
35. Shin Y.M. Mussel-inspired immobilization of vascular endothelial growth factor (VEGF) for enhanced endothelialization of vascular grafts // Biomacromolecules. – 2012. – Vol. 13, № 7. – P. 2020–2028.
36. Shin’oka T., Imai Y., Ikada Y.N. Transplantation of a tissue-engineered pulmonary artery // Engl. J. Med. – 2001. – Vol. 344, № 7. – P. 532–533.
37. Stegemann, J.P., Kaszuba S.N., Rowe S. L. Review: advances in vascular tissue engineering using protein-based biomaterials // Tissue Eng. – 2007. – Vol. 13, № 11. – P. 2601–2613.
38. Sundaram S., Niklason L.E. Smooth muscle and other cell sources for human blood vessel engineering // Cells Tissues Organs. – 2012. – Vol. 195, № 1–2. – P. 15–25.
39. Taggart D.P. Current status of arterial grafts for coronary artery bypass grafting // Ann. Cardiothorac. Surg. – 2013. – Vol. 2, № 4. – P. 427–430.
40. Takahashi H. A novel snake venom vascular endothelial growth factor (VEGF) predominantly induces vascular permeability through preferential signaling via VEGF receptor-1 // J. Biol. Chem. – 2004. – Vol. 279, № 44. – P. 46304–46314.
41. Tessmar J.K., Gopferich A.M. Matrices and scaffolds for protein delivery in tissue engineering // Advanced Drug Delivery Reviews. – 2007. – № 59. – P. 274–291.
42. Wang Z. Functionalization of electrospun poly(e-caprolactone) scaffold with heparin and vascular endothelial growth factors for potential application as vascular grafts // J. Bioactiv. Compatibl. Polymers. – 2012. – Vol. 28, № 2. – P. 154–166.
43. Wissink M.J.B. Improved endothelialization of vascular grafts by local release of growth factor from heparinized collagen matrices // Journal of Controlled Release. – 2004. – № 64. – P. 103–114.
44. Wu W. Fast-degrading elastomer enables rapid remodeling of a cell-free synthetic graft into a neoartery // Nat. Med. – 2012. – Vol. 18, № 7. – P. 1148–1153.
45. Yoo S.-A. Role of placenta growth factor and its receptor flt-1 in rheumatoid inflammation: A link between angiogenesis and inflammation // Arthritis & Rheumatism. – 2009. – Vol. 60, № 2. – P. 345–354.
46. Yun Y.-R. Fibroblast growth factors: biology, function, and application for tissue regeneration // J. Tissue Eng. – 2010. – Vol. 2010. – 218142.
47. Zeng W. The promotion of endothelial progenitor cells recruitment by nerve growth factors in tissue-engineered blood vessels // Biomaterials. – 2010. – № 31. – 1636–1645.
48. Zhang W.J. Tissue engineering of blood vessel // Cell. Mol. Med. – 2007. – Vol. 11, № 5. – P. 945–957.
49. Zhang Y.Z. Biomimetic and bioactive nanofibrous scaffolds from electrospun composite nanofibers // Int. J. Nanomedicine. – 2007. – Vol. 2, № 4. – P. 623–638.
50. Zhou M. Development and validation of small-diameter vascular tissue from a decellularized scaffold coated with heparin and vascular endothelial growth factor // Artif Organs. – 2009. – Vol. 33, № 3. – P. 230–239.

Основной подход к лечению заболеваний, связанных со значительным поражением коронарных и периферических артерий, заключается в проведении хирургического вмешательства с имплантацией биологических или синтетических протезов. Золотым стандартом для протезирования сосудов малого диаметра на сегодняшний день является использование аутотрансплантатов [39]. Однако в большинстве случаев в течение 10 лет после имплантации аутологичные вены и артерии подвергаются деструктивным изменениям, а также окклюзиям, что приводит к необходимости проведения реопераций. Кроме того, около 30 % пациентов не обладают подходящими для трансплантации венами или артериями в результате уже перенесенных операций либо других заболеваний [1]. Высокая потребность сосудистой хирургии в альтернативных протезах малого диаметра для проведения шунтирующих операций привела к активным разработкам сосудистых графтов с использованием подходов тканевой инженерии.

Главной целью сосудистой тканевой инженерии является создание жизнеспособного графта со свойствами, аналогичными нативному кровеносному сосуду [36]. Основная стратегия разработки сосудистых графтов заключается в использовании в качестве основы искусственных матриксов.

Использование матриксов, или так называемых подложек, из природных или синтетических полимеров уже привело к существенным успехам в тканевой инженерии кровеносных сосудов. Матрикс представляет собой трехмерный трубчатый каркас, который обеспечивает структурную поддержку при развитии ткани и влияет на клеточные функции, такие как адгезия, дифференцировка, миграция и пролиферация, а также секрецию компонентов внеклеточного вещества [48]. Важной характеристикой тканеинженерных подложек является пористость материала, которая способствует миграции клеток, передаче сигналов, доставке питательных веществ и удалению продуктов метаболизма [6]. Кроме того, матриксы, используемые для создания кровеносных сосудов, обеспечивают механическую поддержку клеткам, формирующим ткань.

Для заселения трубчатого каркаса клеточными элементами преимущественно применяют эндотелиальные и гладкомышечные клетки, а также фибробласты пациента или донора [31]. Наибольшее предпочтение отдается аутологичным клеткам, так как аллогенные могут быть причиной возникновения иммунологических реакций со стороны организма и последующего отторжения трансплантата [28]. До недавнего времени в большей части работ использовали дифференцированные аутологичные клетки, выделенные из зрелых тканей, например из сегмента вены. Дифференцированные клетки уже обладают специальными функциями, но существует ряд сложностей, связанных с их выделением и низкой пролиферативной активностью, что приводит к увеличению времени клеточной экспансии [37]. Также ограничением в использовании аутологичных клеток является их низкая жизнеспособность у пожилых пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями [30]. Поиск альтернативных клеток для тканевой инженерии привел к использованию стволовых клеток, а именно гемопоэтических клеток, мезенхимальных стволовых клеток и предшественников эндотелиальных клеток. Данные клетки более доступны для выделения, так как их источниками является аспират костного мозга, кровь, жировая ткань, полученная при липосакции, и пуповина [5, 22, 38].

Равномерное заселение матриксов клетками, а также формирование функционирующей ткани достигается созданием динамической среды культивирования при использовании биореакторов, которые имитируют действие гемодинамических сил на формирующийся кровеносный сосуд [7]. Кроме того, динамическая среда для роста кровеносного сосуда может быть обеспечена имплантацией бесклеточного сосудистого графта в кровеносное русло. В этом случае заселение его клетками и формирование сосуда происходит in situ [29, 44].

Еще одним компонентом сосудистой тканевой инженерии является использование биологически активных молекул для стимуляции формирования новых тканей. Особо важным представляется создание биологически активной среды для регенерации кровеносных сосудов на тканеинженерных графтах in situ без предварительного заселения клетками. С этой целью широко используют ростовые факторы, так как они способны регулировать миграцию клеток, их пролиферацию, дифференцировку, апоптоз и дедифференцировку [9]. Однако ростовые факторы нестабильны и имеют короткий период полураспада в результате протеолитической деградации. Это делает неэффективным их системное введение и приводит к необходимости осуществления доставки в место регенерации тканей. В настоящем обзоре рассмотрены возможность и варианты использования активных биологических молекул, влияющих на ангиогенез, в создании тканеинженерных сосудистых имплантатов. Особое внимание уделено подходам к эффективным способам иммобилизации биологически активных молекул на искусственных матриксах для осуществления их локальной доставки.

Ростовые факторы

Ростовые факторы представляют собой растворимые сигнальные полипептиды, секретируемые клетками и регулирующие клеточную активность, а именно выживание, миграцию, пролиферацию и дифференцировку. Передача сигнала происходит путем связывания ростового фактора с его специфическим рецептором, расположенным на поверхности клетки. В тканевой инженерии кровеносных сосудов нашли свое применение ростовые факторы, оказывающие влияние на функции эндотелиальных и гладкомышечных клеток, а также фибробластов, что обусловлено строением сосудов. Так, полноценный тканеинженерный кровеносный сосуд должен состоять из трех слоев: функционального эндотелия; медии, образованной гладкомышечными клетками; а также адвентиции, сформированной фибробластами.

Наиболее активно для стимуляции эндотелизации графтов применяют сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), так как он является важнейшим регулятором развития сосудов в эмбриогенезе (васкулогенез), а также их формирования во взрослом организме (ангиогенез). Как было показано Maes с соавторами, наиболее значимую роль в ангиогенезе имеет VEGF-A 165, так как он преобладает количественно, а также связывается с VEGFR-2 на эндотелиальных клетках, который опосредует наиболее функционально значимые сигналы [27]. Стимуляция VEGFR-2 индуцирует миграцию, пролиферацию и выживание эндотелиальных клеток, выработку оксида азота (NO), сосудистую проницаемость и модулирует экспрессию генов [40].

Основной фактор роста фибробластов (basic fibroblast growth factor, bFGF) был первой молекулой с описанным проангиогенным эффектом [12]. bFGF оказывает влияние на широкий спектр клеток и тканей. Он является митогеном для фибробластов, в результате чего играет значимую роль в процессах ремоделирования тканей и регенерации. Ангиогенная функция bFGF заключается в способности стимулировать покоящиеся эндотелиальные клетки, вызывая их пролиферацию и организацию в трубчатые структуры [46]. Кроме того, данный ростовой фактор стимулирует пролиферацию гладкомышечных клеток стенки кровеносного сосуда, а также способствует их выживанию [23].

Кроме ростовых факторов, влияющих на функции эндотелиальных клеток, важное значение для ангиогенеза имеют биологически активные молекулы, участвующие в стабилизации кровеносных сосудов, например тромбоцитарный ростовой фактор (platelet-derived growth factor, PDGF), который является мощным хемоаттрактантом и митогеном для клеток мезенхимального происхождения [24]. PDGF-BB синтезируется эндотелиальными клетками и стимулирует привлечение периваскулярных клеток посредством взаимодействия с рецептором PDGFR-β, экспрессированным на поверхности сосудистых гладкомышечных клеток и перицитов [4]. В свою очередь перициты обеспечивают формирование и поддержание диаметра кровеносных сосудов, таких как артериолы, капилляры и венулы, а также разделяют базальную мембрану и эндотелий в данных сосудах. Сосудистые гладкомышечные клетки образуют концентрические слои в стенках более крупных сосудов: артерий и вен [19].

В формировании зрелых кровеносных сосудов существенную роль играют ангиопоэтин-1 (angiopoietin-1, Ang1) и -2 (Ang2), которые являются олигомерными гликопротеинами и лигандами к тирозинкиназному рецептору, экспрессируемому клетками эндотелия TIE2. Ang1 и Ang2 вызывают противоположные эффекты и передача сигналов через рецептор Tie2, вероятно, зависит от баланса между ними [10]. При этом Ang1 обеспечивает основной сигнал, способствующий сохранению целостности эндотелия в зрелых сосудах, снижению проницаемости сосудистой стенки и подавлению экспрессии генов воспаления, в то время как Ang2 индуцируется гипоксией и подавляет эффекты Ang1, что приводит к дестабилизации кровеносного сосуда [17].

Большой интерес в качестве регулятора формирования кровеносных сосудов представляет хемокин-стромальный фактор-1 (stromal-cellderived factor, SDF-1). SDF-1 не является ростовым фактором, однако он обладает выраженной ангиогенной активностью. Известно пять вариантов сплайсинга этого хемокина, из которых главными являются SDF-1α и SDF-1β. SDF-1α – преобладающая изоформа, которая обнаруживается во всех органах, но подвергается быстрому протеолизу в крови. SDF-1β более устойчив к деградации, стимулирует ангиогенез и присутствует в насыщенных сосудами органах, таких как печень, селезенка и почки. Обе молекулы опосредуют передачу сигнала путем связывания с рецептором CXCR4, который экспрессируется различными клеточными линиями, включая мышечные, эндотелиальные и прогениторные клетки. Связываясь со своим рецептором, SDF-1 может индуцировать пролиферацию клеток, хемотаксис, миграцию, секрецию ангиогенных факторов и всех важных компонентов ангиогенеза. Обе изоформы SDF-1α и SDF-1β препятствуют апоптозу эндотелиальных клеток, стимулируют их пролиферацию и формирование капиллярной трубки. Однако SDF-1β проявляет более мощный эффект по сравнению с SDF-1α [20].

Кроме локальной доставки биологически активных молекул, стимулирующих формирование новых тканей, для усиления терапевтического эффекта предпочтительно использование комбинаций ростовых факторов.

Сложные процессы миграции клеток, их дифференцировки и пролиферации зависят не только от наличия конкретных факторов роста, но также от их временного и пространственного распределения. В связи с этим перспективными являются разработки систем доставок, обеспечивающих различную кинетику высвобождения биомолекул для управления биологическими процессами. Выбор эффективных комбинаций ростовых факторов для применения в тканевой инженерии кровеносных сосудов должен основываться на их влиянии на функции друг друга, а также на механизмах ангиогенеза [25]. Например, на первом этапе формирования кровеносного сосуда необходимы VEGF, FGF и Ang-2, чтобы нарушить структуру уже существующих кровеносных сосудов и стимулировать пролиферацию и миграцию новых клеток с образованием незрелых сосудов, после чего стабилизация новообразованных сосудов происходит под действием Ang-1 и PDGF-BB. При этом, VEGF-A помимо оказания митогенного эффекта на эндотелий индуцирует секрецию PDGF-BB эндотелиальными клетками. bFGF усиливает экспрессию PDGFRβ на гладкомышечных клетках, одновременно вызывая как их пролиферацию, так и пролиферацию эндотелиальных клеток. Таким образом, комбинированная стимуляция ангиогенными молекулами синергично повышает межклеточные взамодействия через PDGF-B-PDGFRβ сигнальный путь, что приводит к активации и привлечению гладкомышечных клеток с формированием зрелого кровеносного сосуда [23].

Кроме перечисленных биологически активных молекул ангиогенными свойствами обладают такие ростовые факторы, как PlGF, TGF-β, NGF, представленные в таблице.

Биологически активные молекулы, оказывающие влияние на ангиогенез

Аббревиатура

Название ростового фактора

Роль в ангиогенезе

 

VEGF

Vascular endothelial growth factor / сосудистый эндотелиальный фактор роста

Миграция, пролиферация и выживание эндотелиальных клеток

[40]

bFGF

Basic fibroblast growth factor / основной фактор роста фибробластов

Миграция, пролиферация и выживание эндотелиальных клеток и других видов клеток

[46]

Ang-1

Angiopoietin-1 / ангиопоэтин-1

Созревание и стабилизация кровеносных сосудов через усиление взаимодействия между эндотелиальными и гладкомышечными клетками

[10]

Ang-2

Angiopoietin-2 / ангиопоэтин-2

Дестабилизация кровеносных сосудов, ослабляет взаимодействие между эндотелиальными и гладкомышечными клетками.

[17]

PDGF-AB PDGF-BB

Platelet derived growth factor-AB or -BB / тромбоцитарный фактор-AB или -BB

Миграция, пролиферация и рост эндотелиальных клеток. Созревание кровеносных сосудов через активацию гладкомышечных клеток

[19, 24]

PlGF

Placental growth factor / плацентарный ростовой фактор

Миграция и рост эндотелиальных клеток

[45]

TGF-β

Transforming growth factor-β / трансформирующий фактор роста-β

Стабилизация новых кровеносных сосудов и ремоделирование путем накопления внеклеточного матрикса

[41]

NGF

Nerve growth factor / фактор роста нервов

Миграция и пролиферация эндотелиальных клеток, усиление экспрессии адгезивных молекул, стимулирующих ангиогенез

[47]

SDF-1α

Stromal cell-derived factor-1α / стромальный фактор-1α

Миграция, пролиферация и выживание эндотелиальных клеток, образование трубчатой структуры

[20]

Способы иммобилизации ростовых факторов на тканеинженерных матриксах

Тканеинженерные сосудистые графты, модифицированные ростовыми факторами или другими биомолекулами, могут обеспечивать не только опорную функцию при имплантации в организм для восстановления тканей или органов, но также и биологическую активность по отношению к клеткам. В работах, посвященных попыткам создания тканеинженерного кровеносного сосуда, описаны различные подходы к модификации сосудистых графтов биологически активными молекулами. Все существующие на сегодняшний день способы иммобилизации ростовых факторов на природных или синтетических материалах можно разделить на две группы: иммобилизация биомолекул на поверхности и инкорпорирование биомолекул в материал, который в свою очередь играет роль системы доставки.

Иммобилизация ростовых факторов на поверхности биоматериала

Самым простым и распространенным способом адсорбции ростовых факторов является погружение готового матрикса в водный раствор биомолекул. При этом ростовые факторы могут находиться в виде чистого раствора или суспензии и прикрепляются к поверхности материала под действием электростатических сил. Несмотря на то, что данный подход не оказывает влияния на активность биомолекул, он практически не применяется, так как в результате нековалентного взаимодействия непосредственно между материалом и ростовыми факторами невозможно добиться их контролируемого высвобождения. Так Elcin с соавторами исследовал in vitro кинетику выхода VEGF, пассивно адсорбированного на губках из сополимера молочной и гликолиевой кислот (poly(DL-lactide-co-glycolide), PLGA), и оценивал их ангиогенную эффективность in vivo на крысах [15]. По сравнению с PLGA-губками, не содержащими ростовой фактор, а также с болюсной инъекцией, на исследуемом материале имелись значительные васкуляризированные участки. Однако основной выход VEGF происходил в первые 3 дня, за которые выделилось 72,5 % ростового фактора. Следовательно, пассивная адсорбция биомолекул на материале приводит к их быстрому высвобождению в окружающие ткани и не позволяет осуществлять пролонгированную доставку ростовых факторов. В данном случае невозможно контролировать выход ростового фактора, что может приводить к попаданию слишком больших доз в окружающие ткани с их последующим негативным влиянием на организм.

Более стабильное высвобождение биомолекул может быть обеспечено путем их иммобилизации на поверхности матриксов с использованием вспомогательных белков и других биологических молекул, таких как фибронектин, фибрин, желатин, которые создают сайты связывания для ростовых факторов.

В своем исследовании Doi и Matsuda изготавливали микропористые сосудистые графты диаметром 1,5 мм из полиуретана (polyurethane, PU), которые с помощью эксимерлазерной абляции покрывали фотоактивным желатином с иммобилизованными bFGF и гепарином с последующей сшивкой ультрафиолетом. Полученные графты имплантировали в инфраренальный отдел аорты крыс на 4 недели. Иммобилизация bFGF и гепарина способствовала большей степени эндотелизации PU графта по сравнению с протезами без биоактивных молекул, а также приводила к большему количеству активированных гладкомышечных клеток и фибробластов в зоне анастомоза и регенерации субэндотелиальных тканей в средней части графта. Однако короткий срок исследования не позволил авторам учесть возможную чрезмерную пролиферацию клеток сосуда под действием высвобождаемого ростового фактора, а также гиперплазию неоинтимы, которые в дальнейшем могут привести к стенозу графта [14].

Улучшению эндотелизации и ремоделирования сосудистых графтов также способствовала иммобилизация VEGF на сосудистых протезах из политетрафторэтилена (polytetrafluoroethylene, PTFE) с использованием в качестве вспомогательных молекул человеческого сывороточного альбумина [11]. Поверхность PTFE графтов обрабатывали плазмой и глутаровым ангидридом, после чего активировали с помощью N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide (EDC) и иммобилизировали человеческий сывороточный альбумин. Поверхностные аминогруппы сывороточного альбумина подвергали взаимодействию с цис-аконитовым ангидридом для получения отрицательных зарядов, которые способствовали электростатическому взаимодействию белка с VEGF. При тестировании сосудистых протезов c конъюгированным на полимерном материале ростовым фактором было показано усиление миграции эндотелиальных клеток к поверхности графта, их адгезии и пролиферации.

SDF-1α, иммобилизированный путем пассивной адсорбции на синтетических тканных графтах Gelsoft и Polymaille C из полиэстера диаметром 6 мм, предварительно покрытых фибронектином, также демонстрировал свою биологическую активность. Графты с SDF-1α имплантировали в сонную артерию овец, протезы контрольной группы без покрытия имплантировали в сонную артерию на противоположной стороне. Импрегнация сосудистых графтов хемокином SDF-1α стимулировала раннее привлечение эндотелиальных прогениторных клеток и гемопоэтических стволовых клеток, что способствовало улучшению эндотелизации при одновременном уменьшении гиперплазии неоинтимы [13].

Еще одним способом прикрепления ростовых факторов является использование гепарина, физически или химически иммобилизированного на поверхности материала, в качестве вспомогательных молекул.

Так, в работе Wissink с соавторами плоские пленки, изготовленные из коллагена, подвергали химической сшивке с помощью EDC в комбинации с N-hydroxysuccinimide (NHS). Иммобилизацию молекул гепарина на поверхности коллагена также осуществляли с использованием EDC и NHS. На молекулы гепарина адсорбировали bFGF и наблюдали, что в течение 10 дней из пленок высвобождается 43–82 % ростового фактора в зависимости от видов материала, различающихся количеством гепарина на поверхности. Локальное высвобождение bFGF из коллагеновых пленок с bFGF поддерживало адгезию и пролиферацию эндотелиальных клеток в условиях in vitro [43].

Ковалентная иммобилизация гепарина на децеллюляризированной сонной артерии собаки с использованием EDC и NHS обеспечивала адсорбцию VEGF после погружения данных графтов в раствор с ростовым фактором. Полное высвобождение VEGF происходило в течение 20 дней. В эксперименте in vitro на децеллюляризированной артерии, покрытой гепарином и VEGF отмечали увеличение пролиферации эндотелиальных клеток. В этом же эксперименте проводили имплантацию исследуемых графтов в сонную артерию собак. Результаты показывали лучшую проходимость протезов, содержащих ростовой фактор, по сравнению с немодифицированными в течение 6 месяцев исследования [50]

Такой же способ иммобилизации гепарина с последующей адсорбцией молекул VEGF использовали Wang с коллегами для модификации сосудистых графтов диаметром 2–3 мм, изготовленных из поликапролактона методом электроспиннинга. Кинетика выхода ростового фактора с поверхности протеза составила в среднем около 50 % за 15 дней. Графты, имплантированные в качестве артериовенозного шунта крысам сроком на 2 часа, демонстрировали улучшение свойств гемосовместимости после обработки ростовым фактором. Кроме того, их подкожная имплантация показала стимуляцию образования новых сосудов с минимальной иммунологической реакцией по сравнению с немодифицированным графтом [42].

При использовании вспомогательных веществ для иммобилизации ростовых факторов отмечается более стойкое высвобождение биологически активных молекул в окружающие ткани по сравнению с их пассивной адсорбцией на матриксах. В свою очередь, ковалентное связывание ростовых факторов с биоматериалом обеспечивает их более пролонгированный выход. При этом факторы конъюгируют к полимерам через функциональные группы, которые могут быть введены в материал с помощью сополимеризации или образованы при его физической или химической обработке.

Так, в исследовании Zeng с соавторами NGF связывали с поверхностью децеллюляризированного матрикса с помощью бифункционального связывающего агента N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate (SPDP) [47]. Предварительно каротидную аорту крыс децеллюляризировали и инкубировали с коллагеном, химически сшитым EDC. Изготовленные графты имплантировали в левую каротидную артерию крысам. Авторы исследования отмечали, что NGF значительно усиливает мобилизацию эндотелиальных клеток, их хоуминг в поврежденные сосуды, а также обеспечивает эндотелизацию сосудистого графта in vivo и снижение тромбообразования.

Присоединение ростовых факторов к поверхности биоматерила также возможно при использовании полидофамина. Дофамин обладает ключевыми функциональными группами: катехол (из 3,4-дигидрокси-L-фенилаланина) и амины (из лизина). Осажденный слой полидофамина стабилен и обеспечивает сопряжение молекул, содержащих первичную аминогруппу или тиольные группы, через образование имина или реакцию присоединения Михаэля. Например, трипсин иммобилизуют на субстратах целлюлозы, покрытых полидофамином, с поддержанием активности фермента. Так, на сосудистом биосовместимом протезе из сополимера молочной кислоты и поликапролактона (poly(L-lactide-co-ε-caprolactone), PLCL) с иммобилизированным с помощью полидофамина VEGF отмечали увеличение адгезии клеток in vitro, активный рост клеточной культуры с формированием слоя эндотелиальных клеток, которые образовывали прочные межклеточные взаимодействия и экспрессировали на своей поверхности маркер CD31 [35].

Однако существуют некоторые недостатки данного подхода, такие как трудность создания выборочных сайтов связывания для белка, а также возможная потеря биологической активности ростового фактора в процессе иммобилизации в результате экранирования или повреждения функциональных групп белка. Кроме того, химическая модификация может привести к нарушению однородности структуры матрикса. Таким образом, иммобилизация ростовых факторов на поверхности биоматериала позволяет обеспечить достаточно выраженное локальное взаимодействие между ростовыми факторами и клетками тканей, в которые материал имплантируется. Основной проблемой данного подхода является определение баланса между дозой ростового фактора и физическими, а также химическими свойствами матрикса для регуляции клеточных функций.

Инкорпорирование биологически активных молекул в биодеградируемый материал

Инкорпорирование ростовых факторов в структуру биоматериала позволяет обеспечивать контролируемый выход биомолекул в окружающие ткани. При этом сам материал представляет собой средство доставки и может вводиться в организм как инъекционно, так и при имплантации в виде биодеградируемого пористого матрикса, обеспечивающего механическую поддержку формирующимся тканям.

В большинстве случаев ростовые факторы вводят в биодеградируемый полимер, которым покрывают уже готовые сосудистые графты, либо используют в качестве материала для изготовления самого графта. Для инкорпорирования ростовых факторов используют большое количество синтетических полимеров, включая большинство алифатических полиэстеров, сополимер молочной и гликолиевой кислот, а также производные карбонатов.

Например, при имплантации в кровеносное русло на срок до 12 недель сосудистых графтов, изготовленных из децеллюляризированной брюшной аорты крысы и покрытых поли-D,L-молочной кислотой ((poly-(D,L) lactide acid (PDLLA)), содержащей VEGF или bFGF, Heidenhain с соавторами обнаружили увеличение на материале протеза количества гигантских многоядерных клеток инородных тел [18]. Такую тканевую реакцию исследователи связали с передозировкой используемого ростового фактора. Также был обнаружен негативный эффект от покрытия графтов bFGF, который заключался в значительной пролиферации клеток, формирующих неоинтиму в просвете графта. Следует отметить, что авторы не изучали в своей работе скорость выхода ростовых факторов при деградации полимера.

Различные способы изготовления тканеинженерных матриксов также позволяют инкорпорировать биологически активные молекулы в их структуру. К таким методам относится отливка из растворов и расплавов, пенообразование, лиофильная сушка и др. При этом основной проблемой является то, что в процессе изготовления матрикса ростовые факторы подвергаются жестким условиям, таким, например, как действие растворителей [25]. Одним из методов, с помощью которого можно создавать трехмерные пористые матриксы из полимеров с инкорпорированными в их структуру лекарственными веществами или биологически активными молекулами, является электроспиннинг [9].

В основе электроспиннинга лежит процесс возникновения постоянных электростатических зарядов на молекулах полимера в растворе, помещенного в электрическое поле. Высокая плотность одноименных зарядов приводит к их отталкиванию друг от друга и вытягиванию тонкого полимерного волокна нано- и микроразмера. Предварительное введение в раствор биодеградируемого полимера ростовых факторов позволяет инкапсулировать их в полимерные волокна и изолировать от окружающей среды [49]. Для этого раствор полимера в органическом растворителе смешивают с водным раствором биомолекул до получения суспензии. Находясь в полярном растворителе – воде или фосфатном буфере, молекулы ростового фактора не контактируют с неполярным растворителем и, следовательно, не подвергаются денатурации, в связи с чем данный вид электроспиннинга получил название «двухфазного».

Выход ростовых факторов из такого вида матриксов происходит в процессе пассивной диффузии из пор, пронизывающих волокно, а также в результате биодеградации полимера. Скорость деградации полимерного материала в большей степени обуславливает кинетику выхода биомолекул в окружающие ткани. Так, в своих собственных исследованиях мы показали возможность инкорпорирования VEGF и bFGF в тканеинженерный матрикс из поликапролактона методом двухфазного электроспиннинга [2]. Кроме того, нами был продемонстрирован пролонгированный выход ростовых факторов с сохранением их биологической активности, а также значительное усиление ангиогенеза на матриксах из поликапролактона, содержащих VEGF, в течение 4 месяцев после внутрибрюшной имплантации крысам [3].

Устойчивое пролонгированное высвобождение ростовых факторов, возможность использования сочетания биомолекул, а также различных полимеров и их комбинаций делают метод двухфазного электроспиннинга перспективным для создания тканеинженерных сосудистых графтов.

Кроме того, инкорпорирование ростовых факторов в полимерные волокна, формирующие матрикс, возможно методом коаксильного электроспиннинга. При этом также используют растворы полимера и биомолекул. Однако в этом случае раствор ростовых факторов подается в процессе электроспиннига по капилляру, расположенному внутри иглы, по которой поступает полимер. В результате получается материал, состоящий из полимерных волокон с внутренним каналом, в котором находятся биомолекулы [21]. Например, использование данного метода для инкорпорирования PDGF-bb в PCL с использованием в качестве порогена PEG позволило добиться равномерного пролонгированного выхода белка из нановолокон с сохранением биологической активности [26].

Sahoo с коллегами в своем исследовании сравнили между собой два способа инкорпорирования ростовых факторов с помощью электроспиннинга [34]. Они изготовили два вида матрикса из PLGA с инкопорированным bFGF: методом двухфазного электроспиннинга и методом коаксильного электроспиннинга и далее провели их морфологическую, физико-химическую и биологическую оценку. Ростовой фактор в матриксах, изготовленных первым способом, был рассредоточен внутри полимерного волокна, в то же время в матриксах второй группы он располагался в центральной части волокон. Кинетика высвобождения bFGF из обоих материалов была одинакова и происходила в течение двух недель. И хотя прикрепление стволовых клеток костного мозга на матриксах и их пролиферация были одинаковы в обеих группах, клетки, культивированные на образцах, изготовленных методом двухфазного электроспиннинга, продуцировали большее количество коллагена и способствовали усилению экспрессии белков внеклеточного матрикса.

Таким образом, техника электроспиннинга позволяет обеспечить устойчивое пролонгированное высвобождение биомолекул из полимерного материала, что в комбинации с пористой микроструктурой матрикса создает благоприятную среду для прикрепления, миграции и пролиферации клеток и последующего формирования тканей.

Еще одним эффективным способом доставки ростовых факторов является их инкорпорирование в наносферы (1–100 нм) и микросферы (1–100 мкм) из полимеров. В тканевой инженерии сосудов микросферы с ангиогенными факторами нашли свое применение в качестве дополнительных включений в матрикс. Так, Ennett с коллегами предположили, что временного регулируемого высвобождения VEGF в условиях in vivo можно добиться путем введения ростового фактора в полимер, который будет выполнять функцию носителя [16]. Они сравнивали эффект от VEGF, непосредственно прикрепленного к PLGA материалу, с VEGF, преинкапсулированного в PLGA микросферы, которые впоследствии использовали для изготовления матрикса. Было показано, что применение микросфер приводило к замедлению выхода VEGF в окружающие ткани, но при этом сохранялась способность биомолекул стимулировать рост сосудов, а также наблюдались незначительные системные эффекты. Усиление ангиогенеза под действие нано- и микросфер из PLGA, изготовленных методом испарения эмульсионного растворителя и содержащих инкорпорированный VEGF, также было показано Rocha и соавторами [33].

Достаточно привлекательными для изготовления систем доставки ростовых факторов являются природные полимеры, поскольку они в большинстве случаев обладают хорошей биосовместимостью и не вызывают хронического воспаления. Среди них встречаются водорастворимые материалы, что делает возможным инкорпорирование ростовых факторов без негативного влияния органических растворителей на структуру и активность биомолекул. Однако главным недостатком природных полимеров являются низкие показатели физико-механических свойств. Учитывая эти особенности, для создания тканеинженерных графтов ростовые факторы могут быть инкорпорированы в микросферы, например из желатина, или в биодеградируемые гидрогели. Выход ростовых факторов из гидрогелей обеспечивается как диффузией инкорпорированных молекул, так и деградацией геля. Быстрая деградация в свою очередь приводит к значительно высокой скорости высвобождения биомолекул, в то время как медленная способствует задержке их выхода. Химическая модификация полимера позволяет изменять скорость деградации гелей и тем самым контролировать высвобождение биомолекул. Например, альгинатные гидрогели обладают низкой и неконтролируемой деградацией in vivo. Частичное окисление их полимерной цепи периодатом натрия способствует гидролитической деградации и модификации молекулярно-массового распределения полимера [8].

Так, быстрая эндотелизация синтетических графтов из PTFE, покрытых Матригелем (61 % ламинина, 30 % коллагена IV типа, 7 % эластина) с VEGF, происходила при имплантации данных протезов в брюшную аорту крыс через 30 дней [32]. Ростовой фактор способствовал образованию непрерывного эндотелиального слоя, но вместе с тем отмечали значительную гиперплазию неоинтимы, сопровождающуюся ростом числа гладкомышечных клеток. Авторы предполагают, что такой эффект может быть связан с повышением синтеза bFGF и TGF-β эндотелиальными клетками, индуцированными VEGF. В свою очередь bFGF и TGF-β оказывают митогенное влияние на гладкомышечные клетки сосуда.

Таким образом, инкорпорирование ростовых факторов в тканеинженерный матрикс позволяет добиться пролонгированного выхода биомолекул в окружающие ткани, а использование полимеров с различной скоростью биодеградации делает возможным регулирование кинетики их высвобождения. Описанные способы доставки ростовых факторов достаточно эффективны и демонстрируют многообещающие результаты в экспериментах на животных. Однако их дальнейшее усовершенствование необходимо для полного контроля высвобождения и регуляции концентрации активных биомолекул в окружающих тканях для получения необходимого клеточного ответа.

Заключение

Доставка ростовых факторов является важным терапевтическим подходом в тканевой инженерии. Данный обзор иллюстрирует преимущества использования материалов в качестве способа доставки ангиогенных ростовых факторов в место формирования и регенерации кровеносного сосуда, а также особенности высвобождения биомолекул в зависимости от способа их иммобилизации. Искусственные матриксы с иммобилизированными или инкорпорированными ростовыми факторами способны не только обеспечивать механическую поддержку клеткам, но также могут выполнять функцию системы доставки для создания биологически активного окружения в месте повреждения для стимуляции регенерации тканей. Представленные подходы универсальны, и выбор конкретного метода зависит главным образом от целей, которые ставят исследователи при разработке тканеинженерных сосудистых графтов.

Работа финансирована грантом Российского научного фонда (проект № 14-25-00050) и проведена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний».

Рецензенты:

Кудрявцева Ю.А., д.б.н., заведующая лабораторией новых биоматериалов, ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», г. Кемерово;

Шабалдин А.В., д.м.н., ведущий научный сотрудник, ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», г. Кемерово.

Работа поступила в редакцию 18.11.2014


Библиографическая ссылка

Севостьянова В.В., Антонова Л.В., Барбараш Л.С. ПОДХОДЫ К МОДИФИКАЦИИ ИСКУССТВЕННЫХ МАТРИКСОВ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫМИ МОЛЕКУЛАМИ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ КРОВЕНОСНЫХ СОСУДОВ // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 11-9. – С. 1960-1970;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=35877 (дата обращения: 24.09.2020).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074