Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,074

ВЛИЯНИЕ ПЕРФТОРДЕКАЛИНА НА РОСТ ESCHERICHIA COLI М-17 ПРИ ГЛУБИННОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ

Мартинсон Е.А. 1 Бирюков В.В. 1 Бакулин В.М. 1 Крючков А.В. 1 Синцов К.Н. 1
1 ФГБОУ ВПО «Вятский государственный университет»
В Российской Федерации в настоящее время правительством приняты и утверждены комплексные координирующие программы развития биотехнологии. Одной из таких программ является «Комплексная программа развития биотехнологий в Российской Федерации до 2020 года». На основе этой программы создаются и реализуются подпрограммы для регионов, ведомств и отдельных институтов. Большое внимание со стороны государства уделяется развитию образования в области биотехнологии, развитию науки в области биотехнологии, а также стимулированию потребительского спроса на отечественную биотехнологическую продукцию. Биотехнология, наряду с нанотехнологиями и информационными технологиями выделена государством как одна из ключевых технологий для инновационного развития отечественной экономики. В «Комплексной программе развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 года» одной из приоритетных задач определено создание новых технологий и повышение эффективности существующих технологий производства продуктов биотехнологического синтеза. В представленной работе обоснована возможность использования перфтордекалина с газотранспортной функцией в жидкой питательной среде в качестве стимулятора роста при глубинном культивировании бактерий Е.coli М-17, что приводит к значительной интенсификации роста биомассы культивируемого биообъекта. Результаты работы могут быть использованы при проведении дальнейших исследований в рамках повышения эффективности существующих технологий производства продуктов биотехнологического синтеза.
глубинное культивирование
перфтордекалин
бактерии
интенсификация роста
развитие биотехнологии
1. Адхья С. Современная микробиология. Прокариоты: В 2-х томах. Т.1: пер. с англ.; под ред. А.И. Нетрусова, Т.С. Ильиной / С. Адхья, К.-А. Альперт и др. / под ред. Й. Ленгелера, Г. Древса, Г. Шлегеля. – М.: Мир, 2005. – 656 с.
2. Бакулин В.М. Влияние перфтордекалина на рост и антибиотическую активность культур Strepomyces Albus и S. Rimosus в жидкой среде / В.М. Бакулин, Е.А. Мартинсон и др. // Ветеринарная медицина. – 2012. – № 3–4. – С. 15–17.
3. Глик Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Д. Пастернак. – М.: Мир, 2002. – 589 с.
4. Иваницкий Г.Р. Наноконтейнеры на основе перфторуглеродов с функцией переноса оксида азота // Биофизи ка. – 2008. – № 2. – С. 367–377.
5. Комплексная программа развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 года Утверждена председателем правительства Российской Федерации от 24 апреля 2012 г. Москва № 1853п-П8.
6. Равилов A.З., Микробиологические среды / Равилов A.З., Гильмутдинов Р.Я., Xycаинов М. Ш. // Казань. – 1999. – 398 с.

Современная биотехнология изучает общие и частные вопросы использования микроорганизмов в микробиологическом синтезе биологически активных веществ, производстве разнообразных препаратов, разрабатывает технологии применения микроорганизмов в различных областях промышленности, создаёт системы микробиологической деградации технических материалов и отходов производств. Биотехнологические товары представлены на мировом и отечественном рынке в фармацевтическом секторе, агропищевом секторе, промышленной биотехнологии, биоэнергетики и секторе так называемых веществ из возобновляемых источников сырья (renewable chemicals).

Бактерии E. coli играют важную роль в современной промышленной микробиологии, биологической инженерии и биофармацевтике. Научные публикации с результатами исследований по биохимии, физиологии, молекулярной и общей биологии бактерий рода Escherichia позволяют довольно широко их использовать как при производстве препаратов-пробиотиков, так и в качестве модельных микроорганизмов при проведении исследований в области биотехнологического синтеза [1]. Некоторые штаммы E. coli являются продуцентами ферментов, используемых в пищевой биотехнологии, и реципиентами для клонируемых генов эукариот и прокариот [3].

В «Комплексной программе развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 года» указано, что для инновационного развития современной экономики ключевыми являются три направления развития технологий: информационные технологии, нанотехнологии и биотехнологии. В качестве одной из первоочередных задач развития биотехнологии определено создание новых производственных технологий и повышение эффективности существующих технологий производства продуктов биотехнологического синтеза [5].

В последние годы авторами проводятся исследования, связанные с оценкой возможности использования перфторорганических соединений (ПФОС) с газотранспортной функцией с целью интенсификации скорости роста и повышения биосинтетической продуктивности микроорганизмов различных групп при глубинном культивировании для последующего внедрения полученных результатов в биотехнологическое производство [2]. Доказано, что перфторорганические соединения обладают уникальными свойствами и находят широкое применение в трансфузиологии, хирургии, реаниматологии и других областях медицины [4]. Однако применение ПФОС в других областях биологической науки и в биотехнологии пока не нашло достойного обсуждения и реализации. На наш взгляд, биотехнология стоит на пороге прорыва и цепной реакции в расширении направлений и областей использования ПФОС. Спрос для биотехнологии на ПФОС ввиду их уникальных газотранспортных свойств в ближайшие годы должен возрасти в десятки и сотни раз. Теоретическому и практическому рассмотрению перспективности использования ПФОС в биотехнологических процессах, связанных с глубинным выращиванием микроорганизмов, посвящена данная научная работа.

Целью работы являлась оценка возможности интенсификации темпов роста E.coli M-17 при глубинном культивировании с использованием перфторорганических соединений в качестве стимулятора роста.

Материалы и методы исследований

Для оценки возможности влияния перфторорганических соединений на интенсификацию роста микроорганизмов в экспериментах по глубинному культивированию микроорганизмов использовали перфтордекалин (ПФД) производства ОАО «Кирово-Чепецкий химкомбинат им. Б.П. Константинова». В качестве культивируемого биообъекта использовали выделенную из пробиотического препарата «Колибактерин» культуру штамма E. coli М-17. Режим культивирования отрабатывался на лабораторном ферментере BIOSTAT®plus фирмы Sartorius (Германия) с рабочим объёмом колбы для культивирования 1,5 дм3. Температурный оптимум роста культуры проводился при 37 °С. Жидкая питательная среда (ЖПС), приготовленная по рекомендованным прописям и технологиям [6] содержала мясную воду – 700 см3; водопроводную воду – 700 см3; сухой пептон – 1 % и хлорид натрия – 0,5 % (по массе). Интенсивность роста культуры E.coli M-17 оценивали методом высева серийных разведений отобранных в разные промежутки времени проб культуральной жидкости на плотную питательную среду Эндо. Режим автоклавирования питательных сред, тонкостенной лабораторной посуды для вспомогательных коммуникаций для ведения процесса и перфторорганических соединений для внесения в питательную среду отрабатывался на лабораторном автоклаве Tuttnauer (США).

Результаты исследования и их обсуждение

В ходе предварительных экспериментальных исследований авторами была оценена устойчивость ПФД к наиболее часто используемой манипуляции с компонентами микробиологических питательных сред – стерилизации. Экспериментально проанализирован основной метод стерилизации питательных сред – стерилизация паром под избыточным давлением (автоклавированием) при температурном воздействии пара в 126 °С, что соответствовало избыточному давлению в 1,5 атмосфер. При этом была выбрана экспозиция в 60 минут. После проведения стерилизации проб ПФОС в стеклянных пробирках по 7 мл оценивали внешний вид, массу стерилизуемого перфтордекалина и чувствительность к ним исследуемой культуры бактерий. Необходимо отметить, что в процессе и после стерилизации перфтордекалина автоклавированием при использованном режиме он не изменил своего исходного внешнего вида и исходной массы даже после пяти циклов стерилизации. Результаты оценки чувствительности бактерий, представленные в таблице к анализируемому ПФОС до и после стерилизации показали отсутствие ингибирующего действия перфтордекалина на жизнеспособность и развитие бактерий в жидкой среде в статических условиях при периодическом встряхивании.

Более того, при выращивании бактериальной культуры отмечалась выраженная тенденция к увеличению скорости роста культуры и выхода общего количества бактериальных клеток в 2 раза (при концентрации перфтордекалина в среде 0,5–2,5 %). Дальнейшее повышение концентрации перфтордекалина не приводило к увеличению выхода биомассы использованного штамма, это позволяет предположить, что оптимальная концентрация перфтордекалина в среде находится в диапазоне 0,5–12,5 %. Учитывая то, что выход биомассы был максимальным при концентрации в среде 5 %, следует признать эту концентрацию оптимальной для данного этапа исследований.

Результаты оценки действия различных концентраций перфтордекалина в жидкой питательной среде на клетки E.coli M-17

Содержание в среде перфтордекалина, %

Концентрация клеток (⋅107) КОЕ/мл бактерий после выращивания в течение 48 часов в жидкой питательной среде с перфтордекалином стерилизованным …

контроль

111 °С, 30 мин *

134 °С, 60 мин

134 °С, 60 мин

фильтрацией

0

16

16

16

16

16

0,1

15

17

17

15

16

0,5

27

26

28

29

28

5

47

48

45

48

48

12,5

45

46

44

46

47

В ходе основного эксперимента – оценки возможности интенсификации динамики роста E.coli M-17 при внесении в питательную среду перфтордекалина ‒ последовательно проводили два эксперимента по глубинному культивированию микроорганизмов (эксперимент № 1 и эксперимент № 2). В эксперименте № 1 использовали жидкую питательную среду без добавления ПФД, в эксперименте № 2 в жидкую питательную среду добавляли ПФД 5 об. %. Температурные параметры, показатели рН, состав питательной среды, плотность посева и прочие технологические параметры процесса в экспериментах задавали в обоих экспериментах одинаковыми. При выполнении эксперимента № 2 введение ПФД (5 об. %) производили после инокуляции посевной культуры в колбу с жидкой питательной средой.

Время начальной фазы роста E.coli M-17 в жидкой питательной среде с добавлением ПФД сократилось более чем в 1,5 раза по сравнению с временем роста культуры в среде без ПФД. При этом продолжительность фазы экспоненциального роста в эксперименте с ПФД уменьшилась в 1,6 раза.

Время выхода роста культуры E.coli M-17 на стационарную фазу при культивировании в жидкой питательной среде с ПФД составило 5,0 часа, без добавления ПФД – 5,8 часа. Определение общего количества живых клеток по результатам подсчета выросших колоний свидетельствует о том, что в эксперименте № 2 с добавлением ПФД количество микроорганизмов составило 5,0 ± 0,3 млрд. живых микробных клеток в 1 см3 полученной культуральной жидкости, в эксперименте № 1 без добавления ПФД – 3,5 ± 0,3 млрд живых микробных клеток в 1 см3 полученной культуральной жидкости (рисунок).

pic_27.tif

Динамика роста культуры E.coli M-17

Заключение

В настоящей работе на примере бактерий E.coli M-17 экспериментально обоснована возможность использования ПФД как вещества, обеспечивающего при культивировании на лабораторном ферментере BIOSTAT®plus фирмы Sartorius интенсификацию роста культуры E.coli M-17, проявляющуюся сокращением времени культивирования и увеличением биомассы культивируемого биообъекта.

Можно высказать предположение, что данные результаты (по аналогии с процессами, описанными для клеток эукариот), получаются за счет более интенсивного транспорта в бактериальную клетку наноконтейнерами на основе перфторуглеродов основных компонентов жидкой питательной среды, необходимых для построения структуры клеток и последующего деления бактерий [4].

Рецензенты:

Погорельский И.П., д.м.н., профессор, ведущий научный сотрудник НИЦ ФГКУ «33 ЦНИИИ» Минобороны России, г. Киров;

Рылов А.В., д.м.н., профессор, заместитель генерального директора по научной и испытательной работе, ФГБУ РМНПЦ РОСПЛАЗМА ФМБА России, г. Киров.

Работа поступила в редакцию 26.02.2014.


Библиографическая ссылка

Мартинсон Е.А., Бирюков В.В., Бакулин В.М., Крючков А.В., Синцов К.Н. ВЛИЯНИЕ ПЕРФТОРДЕКАЛИНА НА РОСТ ESCHERICHIA COLI М-17 ПРИ ГЛУБИННОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 5-1. – С. 71-74;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=33788 (дата обращения: 11.12.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074