Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,074

ПРИНЦИПЫ И ПОДХОДЫ К ТЕСТИРОВАНИЮ ПРО/-АНТИОКСИДАНТНЫХ СВОЙСТВ ЛЕЧЕБНЫХ ГРЯЗЕЙ IN VITRO

Павлюченко И.И. 1 Каде А.Х. 1 Ременякина Е.И. 1 Охременко О.С. 1
1 ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России
В статье изложены данные относительно про- и антиоксидантных свойствах глины Новосвободненского месторождения Республики Адыгея для перспектив использования в ее качестве лечебной грязи. При исследовании антирадикальной и антиоксидантной активности образцов глины с помощью хемилюминесцентного метода (ХЛ) проводилось определение следующих показателей ХЛ: максимума быстрой вспышки ХЛ (МВХЛ) в сравнении с эталоном (hхем, %) и площади быстрой вспышки ХЛ (ПВХЛ) за 25 секунд в сравнении с эталоном (S25хем, %). Одновременно с ХЛ использовался амперометрический метод определения общей антиоксидантной активности (АОА), заключающийся в измерении электрического тока, возникающего при окислении исследуемого вещества (или смеси веществ) на поверхности рабочего электрода при определенном потенциале и сравнении полученного сигнала, регистрируемого при помощи аппарата Яуза-ААА-01, с калибровочным стандартом, например аскорбиновой кислотой, измеренного в тех же условиях. Определение модулирующего влияния на антиоксидантный потенциал биологических жидкостей тестируемых объектов производили в тест-системах ex vivo после инкубации растворов тестируемых веществ с кровью. Результаты модулирующего влияния на компоненты крови определялись амперометрически в сравнении с нативными образцами крови и выражались в нАмп/с. Для изучения влияния температурных режимов на физико-химические и биологические свойства грязевых форм глины она подвергалась кипячению. После кипячения образцов изучалась общая антиоксидантная активность амперометрическим способом и антирадикальная активность ХЛ методом, а также способность фильтратов образцов кипяченной и некипяченой грязевой формы глины влиять на процессы свободнорадикального окисления (СРО) в искусственных модельных тест-системах на основе водно-спиртово-масляной смеси (ВМС), подготовленных по авторской методике. Полученные данные свидетельствуют о том, что компоненты фильтрата грязевой формы исследуемой глины обладают как прямыми антиоксидантными и антирадикальными свойствами, так и оказывают косвенными эффектами в отношении модулирующего воздействия на окислительно-восстановительный потенциал крови, что важно учитывать при проведении дальнейших исследований, в том числе и на биообъектах и при клинических испытаниях.
антиоксидантная активность
перекисное окисление липидов
люминол-зависимая Н2О2-индуцированная хемилюминесценция
антиокислительный потенциал
глина Новосвободненского месторождения РА
1. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биомембранах. – М.: Наука, 1972. – 252 с.
2. Воейков В.Л. Регуляторные функции активных форм кислорода в крови и в водных модельных системах: автореф. дис. … д-ра биол.наук. – М., 2003. – 48 с.
3. Жданова А. В. Изучение структурных компонентов и физико-химических свойств гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей как источника антиоксидантных лекарственных средств: автореф. дис. … канд. фарм. наук. – Самара, 2011. – 24 с.
4. Критерии оценки качества лечебных грязей при их разведке, использовании и охране: Методические указа ния // МЗ СССР. – М., 1987. – 24 с.
5. Любицкий О.Б., Клебанов Г.И. Применение метода хемилюминесценции для определения антиоксидантной активности пищевых и биологически активных добавок. // Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека: материалы национальной научно-практической конференции с международным участием (19-22 сентября 2001 г.). – Смоленск, 2001. – С. 11–12.
6. Маньшина Н.В. Курортология для всех. За здоровьем на курорт. – М.: Вече, 2007. – 592 с. (83-94) http://sankurtur.ru/press/book.
7. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Ланкин В.З. и др. Окислительный стресс: Патологические состояния и заболевания. – Новосибирск: АРТА, 2008. – 284 с.
8. Павлюченко И.И., Басов А.А., Федосов С.Р. Патент на изобретение № 2182706 от 15.01.2001
9. Павлюченко И.И., Басов А.А., Федосов С.Р. Способ диагностики окислительного стресса организма человека. Патент на изобретение № 2236008. – Заявл. 28.07.2003; Опубл. 10.09.2004 – Б.25.
10. Павлюченко И.И., Басов А.А., Федосов С.Р. Система лабораторной диагностики окислительного стресса. Патент на полезную модель № 54787. – Заявл. 19.01.2006; опубл. 27.07.2006 – Б.21.; Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ 2006611562. Программа для регистрации сигналов хемилюминотестера ЛТ-1 / И.И. Павлюченко, С.Р. Федосов, А.А. Басов; заявитель и правообладатель Павлюченко И.И., Федосов С.Р., Басов А.А. – № 2006610783; заявл. 16.03.2006; зарег. 10.05.2006.
11. Фархутдинов Р.Р., Лиховских В.А. Хемилюминесцентные методы исследования в медицине // Свободные радикалы и болезни человека: материалы национальной научно-практической конференции с международным участием (19–22 сентября 1999 г.). – Смоленск, 1999. – С. 18–19.
12. Фролова О.И., Торопыгин П.Ю., Медведева И.В., Журавлева Т.Д., Киянюк Н.С., Платицын В.А. Состояние антиоксидантной защиты и липидных компонентов мембран эритроцитов больных с впервые выявленным лейко зом. // Проблемы гематологии и переливания крови. – 2001. – № 1. – С. 34–40.
13. Яшин Я.И., Яшин А.Я., Пахомов В.П. Установка для определения суммарной антиоксидантной активности биологически активных соединений. Решение о выдаче патента на изобретение № 2003123073/15 (024965). Дата подачи заявки 25.07.2003 г.
14. Halliwell B. and Gutteridge J.M.C. Free Radicals in Biology and Medicine. – Oxford: Clarendon Press, 1999.

Грязелечение является одним из наиболее древних методов лечения с использованием природных факторов. Грязелечение является эффективным методом изменения реактивности целостного организма, затрагивающим системные, регуляторные процессы и активирующим саногенетические (лат. sanitas – здоровье, греч. genesis – происхождение) механизмы. При этом считается, что при грязевых аппликациях на кожу ответная реакция организма имеет две фазы: нервно-рефлекторную и нервно-химическую. Для первой, нервно-рефлекторной, фазы свойственно непосредственное раздражение нервных рецепторов кожи, что приводит к возбуждению соответствующих центров нервной системы, а в конечном результате – к перестройке обмена веществ в организме. Для второй фазы характерно образование в коже (под влиянием проникших из грязи соединений) биохимически активных веществ, которые, поступая в системный кровоток, вызывают каскад саногенетических реакций (6).

Доказано, что грязевые аппликации усиливают периферическое кровообращение, способствуют улучшению оксигенации тканей и, как следствие, интенсификации метаболических процессов, в том числе окислительно-восстановительных реакций. Во время приема процедур учащаются пульс и дыхание, повышается артериальное давление, которое затем снижается, усиливается потоотделение, повышается функция мочевыделения. Существенную роль в развитии и течении указанных изменений играет вегетативная нервная система. Но одновременно все это способствует активации процессов образования активных форм кислорода, индукции реакций свободнорадикального окисления (СРО), которые в зависимости от обстоятельств и функциональной активности адаптационных механизмов организма могут нести как позитивные, так и негативные последствия и могут быть связаны с развитием местного или общего окислительного стресса (ОС). Развитее ОС возможно и в связи с тем, что грязелечение проводится пациентам, которые обратились за санаторно-курортным лечением по поводу каких-то проблем со здоровьем. В условиях ОС значительно активируются реакции СРО и перекисного окисления липидов, которые, с одной стороны, способствуют обновлению клеточных структур, а с другой – участвуют в дегенеративных процессах [1, 2].

В настоящее время неоспоримым фактом является то, что многие физиологические и патологические состояния и болезни человека сопровождаются снижением функциональных возможностей системы антиоксидантной защиты организма (АОЗ), дисбалансом в системе про-/антиоксиданты и, как следствие, ОС [7, 15, 11, 12, 14]. При этом такие пациенты часто являются объектами бальнеолечения, которым применяются различные процедуру, в том числе и грязелечение, без учета состояния их адаптационных систем. Исходя из этого важны сведения о возможных про-/антиоксидантных свойствах лечебных грязей и процедур грязелечения, которые могут быть обусловлены как прямыми, так и косвенными эффектами компонентов грязей и их метаболическими эффектами на организм. Так, в ряде клинических и экспериментальных работ показано, что липидные комплексы и иные биологически активные вещества в составе лечебных грязей обладают повышенной проникающей способностью даже через неповрежденную кожу и запускают клеточные реакции по типу асептического воспаления. Обладая рядом свойств, в том числе и антиоксидантными [3], компоненты грязей оказывают в совокупности обезболивающий и противовоспалительный эффекты, принимают участие в процессах регуляции микроциркуляции. Лечебные грязи – иловые сульфидные, торфяные – оказывают выраженное антимикробное действие, что объясняется высоким содержанием сульфидных групп, ионов брома, цинка и аналогов антибиотиков. Фунгицидными (противогрибковыми) свойствами обладает лечебная грязь Сестрорецкого месторождения. Эти лечебные грязи относятся к группе серно-железистых сапропелей, или гиттиевых глин.

Особое значение приобретает исследование природных источников глины в различных регионах Краснодарского края и Республики Адыгея, т.к. здесь сосредоточено большое количество мест санаторно-курортного лечения, где широко используется грязелечение, а, следовательно, и есть потребность в лечебных грязях. В частности, хорошие перспективы имеет разработка и использование глины Новосвободненского месторождения Республики Адыгея, которое имеет достаточные запасы природной глины.

Данная глина по заключению ФГУ «Пятигорский ГНИИК ФМБА России» не содержит вредных веществ и тяжелых металлов в количествах, превышающих ПДК для природных субстратов (протокол № 1517 от 28.12.2009 г.) и поэтому может использоваться в бальнеологических целях после проведения соответствующих фармакологических и клинических испытаний. Глина относится к кислым, т.к. ее рН 3,44. В глине содержится достаточно много железа суммарно в виде оксида Fе(ΙΙΙ) – 5,95 % на абсолютно сухое вещество. Содержание сульфидной серы составляет 1,52 %. Содержание естественных радионуклидов Ra, U, Th превышает обычные средние значения, так же как и повышенное содержание техногенного Cs. Однако расчет Аэфф (8) дает значение 287 Бк/кг, что соответствует критерию материала 1 класса (≤ 370 Бк/кг). В целом, согласно протоколу исследования, изучаемая глина по своему составу и свойствам, согласно критериям оценки качества лечебных грязей [4], является близким аналогом лечебной окисленной гиттиевой глины Сестрорецкого месторождения.

Целью настоящего исследования явилось изучение возможных про- и антиоксидантных свойств фильтратов образцов глины Новосвободненского месторождения Республики Адыгея в условиях in vitro.

Материалы и методы исследования

Для исследования бралось 5 г сухого образца глины, которая разводилась в 10 мл воды, тщательно размешивалась и оставлялась на сутки при комнатной температуре. Затем перед исследованием образец помещался в водяную баню при 37 °С на 1 ч с постоянным перемешиванием, после чего производилось центрифугирование образца грязи в течение 15 мин, сливалась надосадочная жидкость, фильтровалась через специальный фильтр, и полученный бесцветный раствор использовался для исследования про-/антиоксидантных свойств. Расчет активности проводился на 1 г сухого образца глины. Перед исследованием полученная жидкость разводилась в 2–4–8 раз для выявления концентрационных эффектов. Для исследования влияния температурных режимов на физико-химические и биологические свойства грязевых форм глины разведенные образцы глины подвергались кипячению в течение 15 мин.

Для тестирования про-/антиоксидантных свойств полученных образцов использовалась люминол-зависимая H2O2-индуцированная хемилюминесценция (ХЛ), которая проводилась на хемилюминотестере ЛТ-1 производства НПО «Люмин» (г. Ростов-на-Дону) по авторской методике [9]. Изучение динамики процесса ХЛ производилось с помощью аппаратно-программного комплекса с программным обеспечением, позволяющим оцифровывать аналоговый сигнал с выхода хемилюминотестера ЛТ-1 (10). Данный способ позволяет проводить определение максимальной амплитуды вспышки ХЛ (МВХЛ), площади затухания вспышки ХЛ (ПВХЛ). В качестве эталона используется реакционная смесь без биологического образца, содержащая активатор СРО – люминол. Антиоксидантные или прооксидантные свойства исследуемых веществ определяются как процент ингибирования или активации индуцированных реакций СРО с участием люминола. При этом МВХЛ отражает наличие прямых антиоксидантных веществ в исследуемом образце, а ПВХЛ указывает на общий антиоксидантный потенциал системы чем больше процент гашения индуцированной вспышки ХЛ, тем выше антирадикальный потенциал исследуемого образца.

Одновременно с ХЛ-анализом использовался амперометрический метод определения общей антиоксидантной активности, заключающийся в измерении электрического тока, возникающего при окислении исследуемого вещества (или смеси веществ) на поверхности специального рабочего электрода при определенном потенциале и сравнении полученного сигнала, регистрируемого при помощи аппарата Яуза-ААА-01, с калибровочным стандартом, например, аскорбиновой кислотой, измеренного в тех же условиях и выражаемых в нАмп/с [13].

Определение модулирующего влияния на антиоксидантный потенциал биологических жидкостей тестируемых объектов производили в тест-системах in vitro и ex vivo после инкубации растворов тестируемых веществ с кровью. После добавления и инкубации с кровью определенного объема тестируемого раствора грязи определялись вышеописанные показатели ХЛ и амперометрии плазмы в сравнении с контролем. Для этого подготовленные фильтраты глины добавлялись в образцы крови в соотношении 2 мл крови и 200 мкл неразведенного фильтрата. Образцы тщательно перемешивались и инкубировались в термостате при 37 °С 30 минут. Затем образцы крови центрифугировались и надосадочную жидкость использовали для исследования ее антиоксидантной и антирадикальной активность (как описано выше для фильтратов грязевых образцов глины). После кипячения образцов изучалась общая антиоксидантная активность амперометрическим способом и антирадикальная активность хемилюминесцентным методом, а также способность фильтратов образцов кипяченной и некипяченой грязевой формы глины влиять на процессы свободнорадикального окисления (СРО) в искусственных модельных тест-системах растворов ВМС, подготовленных по авторской методике [8].

Результаты исследования и их обсуждение

После проведения подготовительных этапов и определения про-/антиоксидантной активности как самих фильтратов исследуемой грязи, так и образцов крови после инкубации с фильтратами грязи выявлены прямые и модулирующие антиоксидантные и антирадикальные эффекты. В табл. 1 представлены средние данные по изучению общей антиоксидантной активности амперометрическим методом и антирадикальной активности ХЛ способом различных разведений фильтратов грязевой формы глины.

Таблица 1

Показатели общей антиоксидантной активности и уровня гашения индуцированной вспышки хемилюминесценции в присутствии фильтрата исследуемой глины

Разведение

АОА в мг витамина С на 1 г сухого в-ва

МВХЛ – % гашения люминола

ПВХЛ (ПВХЛ люминола 388,4)

0

19

24

349

2

15

54

333

4

13

60

324

8

8

68

311

Как видно из представленных данных, фильтраты исследуемых образцов глины обладают как антиоксидантными, так и антирадикальными свойствами. При изучении дозозависимых эффектов установлено, что с разведением общая антиоксидантная активность понижается практически пропорционально разведению, а антирадикальная активность, наоборот, возрастает практически в такой же зависимости. Это может свидетельствовать как о присутствии веществ с антиоксидантными свойствами (в основном органические вещества и, прежде всего серосодержащие), так и компонентов с прооксидантными свойствами (металлы переменной валентности, роданиды и пр.).

При изучении температурного влияния на про-/антиоксидантные свойства грязи выявлены результаты, отражающие значительное влияние кипячения на общую антиоксидантную активность и антирадикальные свойства компонентов глины, что отражено в табл. 2.

Таблица 2

Общая антиоксидантная активность (амперометрический метод) и антирадикальная активность и емкость исследуемых образцов глины (ХЛ-анализ) после кипячения

Фильтрат глины некипяченой

Фильтрат глины кипяченой

Контроль (р-р люминола)

Показатель ХЛ

Процент ингиб.

Показатель ХЛ

% ингиб.

Показатель ХЛ

МВХЛ

8,61

18,5

2,84

73,1

10,56

ПВХЛ

457,2

10,6

436,9

14,6

511,5

АОА

нАмп/с

АОА

нАмп/с

Контроль (вит. С – 5 % р-р)

2216,7 нАмп/с

980,6 нАмп/с

845,4 нАмп/с

После кипячения антирадикальная активность грязевых образцов глины повышается значительно, при этом непосредственный антирадикальный потенциал (МВХЛ) возрастает существенно, практически в 4 раза, а антирадикальная емкость (ПВХЛ) изменяется незначительно (в 1,4 раза). При этом общая антиоксидантная активность снижается практически в два раза ‒ на 55,8 %. Это, возможно, объясняется осаждением и/или разрушением после кипячения различных компонентов глины, обладающих прооксидантной активностью (ионы металлов переменной валентности, органические радикалы, производные органических веществ липид ной природы).

Изучение ингибирующего или активирующего процессы СРО влияния фильтратов глины в модельных тест-системах с ВМС до и после кипячения образцов грязевых форм глины отражено в табл. 3.

Таблица 3

Ингибирующая процессы СРО активность исследуемых образцов глины, индуцированных Fe2 + и перекисью водорода, в мицелярных тест-системах с ВМС

Фильтрат глины некипяченой

Фильтрат глины кипяченой

Контроль (р-р ВМС)

Оптическая плотность

% ингиб.

Оптическая плотность

% ингиб.

Оптическая плотность

450 нм

0,8983

10,3

0,726

2,8

1,0147

532 нм

0,6252

0,925

0,684

Ингибирующая активность исследуемых образцов фильтратов грязевой формы глины достаточно низкая, при кипячении она практически исчезает, что соответствует данным, полученным при исследовании общей антиоксидантной активности образцов амперометричес ким способом.

Результаты исследования моделирующего влияния фильтратов грязевой формы глины на про-/антиоксидантный потенциал биологических жидкостей после инкубации тестируемых растворов с кровью представлены в табл. 4.

В результате исследований получены данные, которые свидетельствуют, что антиокислительной потенциал крови в присутствии фильтрата глины в большинстве случаев значительно снижается, скорее всего, из-за присутствия в фильтрате ионов металлов переменной валентности, которые могут инициировать процессы СРО в крови, особенно в присутствии перекисных продуктов, и одновременно ослаблять ее антиокислительный потенциал. На антирадикальный показатели крови добавление фильтрата в тех объемах, которые описаны в методиках, не оказывает существенного влияния.

Таблица 4

Показатели модулирующего влияния фильтрата глины на антиоксидантную и антирадикальную активность крови in vitro

Проба

 

 

 

№ п/п

АОА в нАмп/с

МВХЛ – % гашения люминола

ПВХЛ (площадь люминола 388,4)

Кровь + фильтрат

Кровь

Кровь + фильтрат

Кровь

Кровь + фильтрат

Кровь

1

280

1220

3,5

4,2

403

442

2

250

855

3,5

4,3

437

453

3

260

1005

3,9

4,0

401

353

4

219

950

2,8

3,9

283

429

5

176

1010

3,11

3,57

290

424

М

237

1008

3,36

4

363

420

На основании полученных данных можно констатировать:

1) компоненты фильтрата исследуемых образцов грязи, полученных при разведении глины Новосвободненского месторождения Республики Адыгея, обладают прямыми антиоксидантными и антирадикальными свойствами и одновременно обладают косвенными эффектами в отношении модулирующего воздействия на окислительно-восстановительный потенциал крови, что важно учитывать при проведении дальнейших исследований, в том числе и клинических испытаний. При проникновении в ткани и кровеносную систему компонентов грязи они могут изменять как местный, так и общий про-/антиоксидантный потенциал помимо косвенных метаболических эффектов;

2) высокие температуры могут влиять на антирадикальные и антиоксидантные свойства лечебных грязей. Это особенно актуально при повторных и/или неоднократных нагреваниях лечебной грязи перед ее использованием;

3) ингибирующая активность исследуемых образцов фильтратов грязевой формы глины в отношении индуцированных процессов СРО в модельных тест-системах достаточно низкая, при кипячении она практически исчезает, что соответствует данным, полученным при исследовании общей антиоксидантной активности образцов амперометрическим способом;

4) модулирующие эффекты фильтратов грязевой формы исследуемой глины в отношении про-/антиоксидантного потенциала крови в условиях ex vivo отражают наличие в образцах компонентов с прооксидантными свойствами;

5) используемые методы позволяют проводить доклинические исследования различных средств лекарственных и профилактических средств, в т.ч. и используемых в бальнеолечении.

Рецензенты:

Литвинова Т.Н., д.п.н., профессор кафедры фундаментальной и клинической биохимии, ГБОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет Минздрава России», г. Краснодар;

Сампиев А.М., д.ф.н., профессор, заведующий кафедрой фармации, ГБОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет Минздрава России», г. Краснодар.

Работа поступила в редакцию 18.02.2014.


Библиографическая ссылка

Павлюченко И.И., Каде А.Х., Ременякина Е.И., Охременко О.С. ПРИНЦИПЫ И ПОДХОДЫ К ТЕСТИРОВАНИЮ ПРО/-АНТИОКСИДАНТНЫХ СВОЙСТВ ЛЕЧЕБНЫХ ГРЯЗЕЙ IN VITRO // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 4-1. – С. 133-138;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=33682 (дата обращения: 18.01.2020).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074