Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,441

ИССЛЕДОВАНИЕ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ В ТКАНИ ПЛАЦЕНТЫ ПРИ ГЕСТОЗАХ

Ахушкова Л.А. 1 Николаев А.А. 1 Сухарев А.Е. 1
1 ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия Минздрава России»
Проведен анализ взаимосвязи уровней активности щелочной фосфатазы в водно-солевых и бутанольных экстрактах плацент, полученных при нормальных родах, и плацент, полученных при родах женщин, страдавших гестозами. Изучена концентрация специфической плацентарной щелочной фосфатазы методом ракетного иммуноэлектрофореза. Расчет удельной активности валовой термостабильной щелочной фосфатазы показывает, что в нормально развивающейся плаценте в водно-солевых экстрактах удельная активность щелочной фосфатазы составляет 1,3 ± 0,02 ед./мкг плацентарной щелочной фосфатазы, а в бутанольных экстрактах 1,43 ± 0,02 ед./мкг ПЩФ. В плацентах, полученных от женщин, страдавших гестозом, удельная активность щелочной фосфатазы в водно-солевых экстрактах составляет 1,18 ± 0,025 ед./мкг ПЩФ, а в бутанольных экстрактах 0,91 ± 0,01 ед./мкг ПЩФ. Анализ этих данных показывает, что самое значительное снижение удельной активности происходит при сравнении бутанольных экстрактов нормальной плаценты и плаценты женщин, страдавших гестозами. Здесь различие составляет более 36 %. В нормальной плаценте отмечено недостоверное различие в удельной активности щелочной фосфатазы в водно-солевых и бутанольных экстрактах, несмотря на то, что при определении активности щелочной фосфатазы в водно-солевых и бутанольных экстрактах эти различия очень значительны и составляют более 230 %.
гестоз
плацента
щелочная фосфатаза
1. Гланц С. Медико-биологическая статистика: пер. с англ. – М.: Практика 1999. – 459 с.
2. Луценко М.Т. Цитологическая характеристика белкового обмена в цитозоле синцитиотрофобласта ворсинок плаценты у беременных, перенесших в период гестации обострение герпес-вирусной инфекции // Фундаментальные исследования 2012. – № 7. – С. 106–112.
3. Однокозова О.С. Прогнозирование и превентивное лечение гестоза: автореф. дис. ... канд. мед. наук. – Волгоград, 2010. – 24 с.
4. Burlev V.A., Il’yasova N.A., Dubinskaya E.D. Proliferative activity of microvessels and angiogenesis in eutopic endometrium in patients with peritoneal endometriosis // Bull Exp Biol Med. – 2005. – Vol. 139. – № 6. – Р. 727–731.
5. Davidson J.M., Lindheimer M.D. New develops in preeclampsia // Am. Soc. Nephrol. – 2011. – Vol. 32. – P. 517–525
6. Ferianec V., Linhartová L. Extreme elevation of placental alkaline phosphatase as a marker of preterm delivery, placental insufficiency and low birth weight // Neuro Endocrinol Lett. – 2011. – Vol. 32. – № 2. – Р. 154–157.
7. Mosbah A.A., Abd-Ellatif N.A., Sorour E.I., El-Halaby A.F. Placental alkaline phosphatase activity and its relation to foetal growth and nutrition in appropriate and small for gestational age newborns at term // J Egypt Soc Parasitol. – 2011. – Vol. 41. – № 3. – Р. 745–52.
8. Tang X., Yang F., Jia L., Yao X.Y., Yang K.X. Placental proteins site trophoblastic сells in the pelvic wall: review of the literature // Indian J Pathol Microbiol. – 2013. – Vol. 56. – № 3. – Р. 300–312.
9. Zhabin SG, Gorin VS, Judin NS. Review: immunomodulatory activity of pregnancy-associated protein // J Clin Lab Immunol. – 2011. – Vol. 52. – Р. 41–50.

Гестозы занимают второе место в статистике акушерских осложнений [3]. Их патогенез окончательно не изучен, а диагностика и прогнозирование до настоящего времени представляют собой трудную задачу [5].

В последние годы была экспериментально доказана связь между ишемией плаценты и повреждением эндотелия, вначале – в зоне маточно-плацентарного кровообращения, а затем – генерализованно. Авторы указывают на возможную связь между повышенным уровнем плацентарных изоферментов ЩФ и уровнем плацентарной недостаточности [6].

Плацентарная щелочная фосфатаза (ПЩФ) продуцируется микроворсинками плаценты и эндотелием её новообразующихся сосудов, является органоспецифическим антигеном плаценты, в связи с чем логично предположить непосредственное участие этого фермента в указанных патологических процессах.

Исследованию ПЩФ как маркера эмбриональных и малигнизированных тканей, в последние десятилетия уделено большое внимание [8]. Однако в тени ПЩФ остаются другие ферменты этого органа, обладающие фосфатазной активностью.

Целью нашей работы стало комплексное исследование активности и концентрации щелочных фосфатаз в ткани плаценты здоровых женщин и при гестозах.

В работе использованы экстракты 14 плацент, полученных при нормальных родах, и 48 плацент, полученных при родах женщин, страдавших гестозами.

Для приготовления водно-солевого экстракта кусочки плаценты гомогенизировали до однородной массы, добавляя при этом 10 mM Tris-HCl, буфер pH 7,4 в соотношении 1:4. Гомогенат центрифугировали и надосадочную жидкость использовали для исследования.

Для приготовления бутанольного экстракта осадок, полученный на 1 этапе, ресуспендировали в 10 mM Tris-HCl, буфер pH 7,4, содержащем бутанол (20 %,v/v), и перемешивали в течении 6–8 часов при температуре –2–4 °С. Через сутки указанную смесь центрифугировали с эфиром в течение 40–45 минут при 10000 об/мин в рефрижераторной центрифуге 2–3 раза в соотношении I часть эфира и 5 частей гомогената. После центрифугирования отделяли водную фазу, определяли общий белок и активность щелочной фосфатазы в надосадочной жидкости.

Активность щелочной фосфатазы определяли по расщеплению n-нитрофенилфосфата и нафтол-AS-фосфата, а количество органоспецифической плацентарной фосфатазы определяли методом ракетного электрофореза. Активность термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы определяли после термической обработки водно-солевых и бутанольных экстрактов.

В водно-солевых экстрактах послеродовой плаценты содержится от 512 до 2048 МЕ общей активности щелочной фосфатазы и от 2048 до 4096 МЕ – в бутаноловых экстрактах. По нашим данным, использование субстратов n-нитрофенилфосфата и нафтол-AS-фосфата не оказывает достоверного влияния на уровень активности общей щелочной фосфатазы плаценты, и далее мы не акцентируем внимание на субстратной специфичности. Выявленная активность общей плацентарной щелочной фосфатазы соответствует 7,6 ± 1,0 МЕ/100 г ткани в водно-солевых экстрактах и 22,8 ± 3,0 МЕ/100 г – в бутаноловых экстрактах плаценты. То есть существует цитозольная (вероятно, она же – секретируемая в кровоток) плацентарная щелочная фосфатаза и мембраносвязанная плацентарная щелочная фосфатаза, обеспечивающая метаболизм фетоплацентарного комплекса.

В водно-солевых экстрактах плаценты при гестозах отмечается достоверное снижение активности термостабильной щелочной фосфатазы (табл. 1). Причем характерно значительное снижение различия между уровнем щелочной фосфатазы в водно-солевых и бутанольных экстрактах (более чем на 42 %). Наблюдается опережающее снижение уровня именно мембраносвязанного фермента, что, видимо, усугубляет функциональное состояние фетоплацентарного комплекса.

Таблица 1

Активность термостабильной щелочной фосфатазы в экстрактах плаценты здоровых женщин и страдающих гестозом

Донор плаценты

Водно-солевой экстракт МЕ

Бутанольный экстракт МЕ

Здоровые женщины (n = 14)

1316,57 ± 108,5

3120,27 ± 142,7

Женщины, страдавшие гестозом (n = 48)

998,55 ± 112,8

1677,57 ± 156,6

Получение поликлональных антител к очищенному препарату плацентарной щелочной фосфатазы позволило разработать моноспецифическую тест-систему на этот фермент.

Плацентарная щелочная фосфатаза по данным двумерного иммуноэлектрофореза состоит из 2-х иммунохимически идентичных компонентов с относительной электрофоретической подвижностью 0,65 ± 0,04 и 0,52 ± 0,02, что соответствует описанным в литературе [Mosbah A.A., 2011] F и S изоформам (рис. 1). Прогревание при 56 °С в течение 30 минут или 60 °С – 10–15 минут сохраняет активность ПЩФ, что свидетельствует о её основном отличии от других изоформ ЩФ свойстве – термостабильности .

В работе использован препарат плацентарной щелочной фосфатазы полученный в лаборатории кафедры химии Астраханской медицинской академии.

С помощью очищенного препарата ПЩФ нами были получены гипериммунные сыворотки к этому белку, которые позволили разработать методы количественного определения ПЩФ в экстрактах плаценты, используя минимальное количество биоматериала.

pic_2.tif

Рис. 1. Двумерный иммуноэлектрофорез экстракта плаценты. F-фракция с электрофоретической подвижностью 0,65, S-фракция с электрофоретической подвижностью 0,52. Агароза содержит антитела к плацентарной щелочной фосфатазе

Для количественного определения ПЩФ использовали метод ракетного иммуноэлектрофореза (РИЭФ). Метод предполагает использование калибровочного графика при каждом анализе. В качестве стандартного образца используют одну из серий очищенного препарата ПЩФ.

Для стандартизации в этом случае может быть использован очищенный лиофилизированный ПЩФ: его раствор приготовлен по точной навеске. Однако разные серии ПЩФ различаются между собой в пределах ошибки препаративных методов, а образцы кроличьей сыворотки отличаются по концентрации антител, а это может влиять на результаты определения содержания ПЩФ методом РИЭФ.

На рис. 2 представлена типичная электрофореграмма данного эксперимента. С помощью программы Excel для каждого образца строили график зависимости «ПЩФ – высота «ракеты» и находили уравнение линейной регрессии. Для оценки значимости различий линий регрессии применяли регрессионный анализ, заключающийся в сравнении коэффициентов наклона b, коэффициентов сдвига a, сравнения двух линий в целом (по F-критерию) [1].

pic_3.tif

Рис. 2. Типичная электрофореграмма при определении пщф; 1–4 – Разведения ПЩФ. Концентрации 5; 10; 15; 20 мкг/мл; 5, 6, 7, 8, 9 – образцы тканей плаценты

Таблица 2

Концентрация плацентарной термостабильной щелочной фосфатазы в экстрактах плаценты здоровых женщин и страдающих гестозом

Донор плаценты

Водно-солевой экстракт мкг/100 г ткани

Бутанольный экстракт мкг/100 г ткани

Здоровые женщины (n = 18)

1017,517 ± 14,5

2176,6 ± 42,1

Женщины, страдавшие гестозом (n = 48)

804,11 ± 12,3 *

1836,8 ± 26,0*

Примечание. * – P ≤ 0,01.

На этих условиях было проведено 17 опытов ракетного иммуноэлектрофореза, в которых испытано 136 образцов ткани плацент и образцов биологических жидкостей.

В водно-солевых экстрактах плаценты при гестозах отмечается достоверное (более 20 %) снижение концентрации ПЩФ, а бутанольных чуть менее 16 % (табл. 2). Причем наблюдается заметное отличие в динамике изменений концентрации плацентарной щелочной фосфатазы, определенной иммунохимическими методами и изменения активности термостабильной щелочной фосфатазы (табл. 3).

Таким образом, на основании исследования водно-солевых и бутаноловых экстрактов послеродовой плаценты мы пришли к выводу, что существует цитозольная (вероятно, она же – секретируемая в кровоток) плацентарная щелочная фосфатаза и мембраносвязанная плацентарная щелочная фосфатаза, обеспечивающая метаболизм фетоплацентарного комплекса. Дисбаланс динамики активности термостабильной щелочной фосфатазы и концентрации специфической плацентарной щелочной фосфатазы подтверждает не только факт значительного присутствия фосфатаз различного происхождения в водно-солевой фракции, но и следует признать, что специфическая плацентарная фосфатаза не единственная мембрансвязанная фосфатаза.

Интересно, что снижение концентрации менее выражено (табл. 3), чем снижение активности. Расчет удельной активности валовой термостабильной щелочной фосфатазы показывает, что в нормально развивающейся плаценте в водно-солевых экстрактах удельная активность щелочной фосфатазы составляет 1,3 ± 0,02 ед./мкг плацентарной щелочной фосфатазы, а в бутанольных экстрактах 1,43 ± 0,02 ед./мкг ПЩФ. В плацентах, полученных от женщин, страдавших гестозом, удельная активность щелочной фосфатазы в водно-солевых экстрактах составляет 1,18 ± 0,025 ед./мкг ПЩФ, а в бутанольных экстрактах 0,91 ± 0,01 ед./мкг ПЩФ. Анализ этих данных показывает, что самое значительное снижение удельной активности происходит при сравнении бутанольных экстрактов нормальной плаценты и плаценты женщин, страдавших гестозами. Здесь различие составляет более 36 %.

Таблица 3

Сравнительная активность плацентарной термостабильной щелочной фосфатазы в экстрактах плаценты здоровых женщин и страдающих гестозом

Донор плаценты

Водно-солевой экстракт

Бутанольный экстракт

Активность ТЩФ МЕ

Концентрация ПЩФ, мкг/100 г ткани

Удельная активность, ед./мкг

Активность ТЩФ МЕ

Концентрация ПЩФ, мкг/100 г ткани

Удельная активность, ед./мкг

Здоровые женщины (n = 21)

1316,57 ± 108,5

1017,517 ± 14,5

1,3 ± 0,02

3120,27 ± 142,7

2176,6 ± 42,1

1,43 ± 0,02

Женщины, страдавшие гестозом (n = 33)

998,55 ± 112,8

804,11 ± 12,3

1,18 ± 0,025

1677,57 ± 156,6

1836,8 ± 26,0

0,91 ± 0,01

В нормальной плаценте отмечено недостоверное различие в удельной активности щелочной фосфатазы в водно-солевых и бутанольных экстрактах, несмотря на то, что при определении активности щелочной фосфатазы в водно-солевых и бутанольных экстрактах эти различия очень значительны и составляют более 230 %. Это кажущееся противоречие можно объяснить примерно равноценной долей специфической плацентарной фосфатазы в общем фосфатазном пуле как водно-солевого, так и бутанольного экстрактов. Эту точку зрения подтверждает и наблюдение Zhabin S.G., Луценко М.Т [9,2]

Резкое снижение на 36 % удельной активности в бутанольных экстрактах плаценты женщин, страдавших гестозами, по сравнению с нормальной плацентой, свидетельствует об опережающем снижении уровня специфической плацентарной фосфатазы в мембрансвязанной фракции, а значительное увеличение различия между удельной активностью щелочной фосфатазы в водно-солевых и бутанольных экстрактах (более чем на 23 %) может свидетельствовать в пользу представления о более активном вымывании именно специфической плацентарной фосфатазы в цитозольную фракцию [4].

Следовательно, при гестозах происходит не только количественное изменение уровня плацентарной щелочной фосфатазы, но и, во-первых, дисбаланс между цитозольной и мембранной фракциями щелочной фосфатазы и, во-вторых, изменение профиля многочисленных фосфатаз, клеток плаценты, с опережающим снижением уровня специфической плацентарной щелочной фосфатазы, что усугубляет функциональное состояние фетоплацентарного комплекса.

Рецензенты:

Мажитова М.В., д.б.н., доцент, зав. кафедрой химии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия», г. Астрахань;

Молдавская А.А., д.м.н., профессор кафедры анатомии человека, ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия», г. Астрахань.

Работа поступила в редакцию 21.12.2013.


Библиографическая ссылка

Ахушкова Л.А., Николаев А.А., Сухарев А.Е. ИССЛЕДОВАНИЕ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ В ТКАНИ ПЛАЦЕНТЫ ПРИ ГЕСТОЗАХ // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 12-2. – С. 167-171;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=33297 (дата обращения: 20.10.2020).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074