Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,441

ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССА ДЕСТРУКЦИИ НЕФРАСА УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ

Леонов К.А. 1 Асташкина А.П. 1 Мостовская Т.А. 2 Ивасенко Д.А. 3 Анциферов Д.В. 3
1 ФГОУ ВПО «Национальный исследовательский Томский политехнический университет»
2 ОАО «ТомскГазпром»
3 ООО «Экойл»
Изучен процесс биодеструкции нефраса углеводородокисляющими микроорганизмами методом газовой хроматографии. Показано, что комплексный состав биопрепарата способствует полной деструкции всех классов углеводородов, входящих в состав нефтепродукта. Выявлено, что большей скоростью ферментативной биотрансформации обладают парафины и нафтены, полная деструкция изопарафинов и ароматических углеводородов наступает через 9 дней. Показано, что количество индивидуальных компонентов сложной многокомпонентной системы нефтепродукта в процессе биодеструкции уменьшается в 25 раз. Отображена динамика изменения численности микроорганизмов в процессе биодеструкции. Установлено, что исследуемый биопрепарат является эффективным деструктором нефти и нефтепродуктов с похожими физико-химическими показателями. Полученные данные можно использовать при создании новых сообществ углеводородокисляющих микроорганизмов, ориентированных на физико-химические параметры загрязнителя.
углеводороды
углеводородокисляющие микроорганизмы
биодеструкция
биотрансформация
газовая хроматография
биопрепарат
1. Башкин В.Н., Калинина И.Е., Галиулин Р.В., Галиулина Р.А. // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе. – 2009. – № 6. – С. 4–6.
2. Заборская А.Ю., Крамм Э.А., Кустова Н.А. Изучение влияния структураторов на процесс биоремедиации нефтезагрязненных почв // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе. – 2011. – № 1. – С. 10–13.
3. Киасса В., Пастнова И.Л., Абрамова И.Г. Попытка изоляции микроорганизмов рода Pseudomonas с территории НПЗ г. Алжира // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе. – 2007. – № 5. – С. 37–39.
4. Плешакова Е.В. Эколого-функциональные аспекты микробной ремедиации нефтезагрязненных почв: автореф. дис. ... д-ра биолог. наук. – Саратов, 2010. – 47 с.
5. Рудакова Л.В., Сакаева Э.Х., Петров В.Ю. Использование биореакторной технологии при восстановлении нефтезагрязненных почв // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе. – 2011. – № 7. – С. 35–38.

Загрязнение окружающей среды нефтью и нефтепродуктами – актуальная экологическая проблема для нефтедобывающих регионов. На различных производственно-технологических стадиях функционирования нефтегазового комплекса происходят аварийные ситуации, приводящие к загрязнению окружающей среды углеводородами нефти, газового конденсата и продуктами их переработки. В среднем 3 % добываемой нефти попадает в окружающую среду только на этапе ее добычи и транспортировки, что в абсолютном исчислении составляет десятки миллионов тонн [1, 2, 5].

Наиболее перспективным, экологически чистым и часто единственно возможным способом решения данных экологических проблем является применение биологических технологий, основанных на использовании микробных биопрепаратов, изготовленных из активной биомассы углеводородокисляющих микроорганизмов. Для таких микроорганизмов углеводороды являются естественным источником питания, поэтому в процессе жизнедеятельности они активно размножаются, потребляя загрязнения вплоть до их полного исчерпания [3].

Анализ изменений, происходящих в микробных сообществах нефтяных загрязнений путём определения численности микроорганизмов, выделения и идентификации микроорганизмов-деструкторов углеводородов, изучения биодинамики на основании оценки активности ферментов с параллельным химическим анализом остаточного содержания нефтяного загрязнителя, позволяет разработать параметры микробиологических процессов в нефтезагрязнённых почвах и водных акваториях [4].

Целью работы является изучение процесса деструкции нефраса углеводородокисляющими микроорганизмами биопрепарата «МД» с помощью метода газовой хроматографии.

Материалы и методы исследования

В работе использовали углеводородокисляющие микроорганизмы, входящие в состав биопрепарата марки «МД», произведенного компанией ООО «Экойл» (город Томск). Биопрепарат содержит несколько штаммов микроорганизмов-деструкторов, способных утилизировать углеводороды с различной длиной углеродной цепи. Использовалась жидкая форма биопрепарата, представляющая собой маточную культуру с плотностью микроорганизмов 108–109 КОЕ/мл.

Для роста, развития микроорганизмов и активации ферментов готовилась минеральная среда следующего состава:

Макросоли

NH4H2PO4 10 г

K2HPO4 10 г

MgSO4 0,7 г

FeSO4∙7H2O 0,0125 г

ZnSO4∙7H2O 0,0125 г

MnSO4∙5H2O 0,0125 г

CuSO4∙5H2O 0,003 г

NaCl 0,1 г

Микросоли

Трилон Б 500 мг

FeSO4∙7H2O 200 мг

ZnSO4∙7H2O 10 мг

MnCl2∙4H2O 3 мг

CoCl2∙6H2O 20 мг

H3BO3 30 мг

CuCl2∙6H2O 2 мг

Na2MoO4∙2H2O 3 мг

В колбу объемом 2 л вносили 1 л минеральной среды, 50 мл нефтепродукта и 50 мл биопрепарата «МД». Культивирование проводилось на термостатированной качалке ЛАБ-ПУ-01 с частотой вращения 105–110 об/мин при температуре 30–32 °С.

В качестве субстрата использовался Нефрас С2 – 80/120 °С; ТУ 38-401-67-108-92 (ЗАО «Рязанская нефтеперерабатывающая компания») – прозрачная маслянистая жидкость, представляющая собой легкокипящую фракцию деароматизованного бензина прямой перегонки малосернистых нефтей. Данный нефтепродукт характеризуется следующими физико-химическими свойствами:

Плотность при Т – 20 °С, кг/м3 689,2

Массовая доля серы, % 0,000036

Фракционный состав:

температура начала кипения, °С 84

98 % перегоняется при температуре, °С 92

остаток в колбе после перегонки, % 0,8

Содержание углеводородов в нефтепродукте определяли на хроматографе «Хроматэк-Кристалл 5000» с пламенно-ионизационным детектором при следующих условиях:

– длина колонки – 100 м;

– диаметр колонки – 0,25 мм;

– температура испарителя – 295 °С;

– температура термостата – 290 °С;

– газ-носитель – гелий;

– расход газа-носителя – 315 мл/мин;

– общее время анализа – 2 ч 30 мин.

Для подсчета численности и отображения динамики роста микроорганизмов производилось последовательное разведение и посев на плотную среду (мясопептонный агар) по методу Коха. Рост бактерий на агаризованной среде осуществлялся при температуре 29–31 °С в течение 2 суток.

Результаты исследования и их обсуждение

Нефрас является сложной многокомпонентной системой, содержащей 98 индивидуальных компонентов всех классов углеводородов. Процесс деструкции нефраса углеводородокисляющими микроорганизмами осуществлялся путем ежедневного отбора проб из реакционной массы на химический и микробиологический анализы. По данным анализа методом газовой хроматографии судили об остаточном содержании и степени деструкции компонентов нефтепродукта и отдельных классов углеводородов.

Как видно из рис. 1, первыми биодеструкции подвергаются молекулы алканов и циклопарафинов вследствие простого строения углеродной цепи. Так, в первые сутки происходит значительное снижение количества алканов в смеси, их концентрация через 24 часа снизилась на 49 %. Минимальное содержание парафинов в анализируемом нефтепродукте наблюдается после 96 часов воздействия микроорганизмов. Концентрация нафтеновых углеводородов спустя 72 часа биодеструкции сводится к нулю.

В процессе деструкции изопарафинов происходит биотрансформация (химическая модификация) вещества под действием ферментативного аппарата углеводородокисляющих микроорганизмов: изомеразы (катализирует структурные превращения изомеров) и дегидрогеназы (катализирует перенос протона, отщепление водорода). Изменение концентрации изоалканов в процессе биотрансформации показано на рис. 2.

Значительное снижение концентрации изопарафинов наблюдается через 24 часа, когда доля изоалканов снизилась в 3,7 раза по сравнению с первоначальным содержанием.

Изменение концентрации олефинов в системе также связано с химическими превращениями под воздействием дегидрогеназы, протекающими по следующей схеме:

дегидрогеназа

R–CH2–CH3 R–CH = CH2 + H2

pic_97.tif

Рис. 1. Динамика деструкции нафтенов и парафинов

pic_98.tif

Рис. 2. Снижение концентрации изопарафинов

Параллельно в системе проходит накопление ароматических углеводородов, связанное со снижением концентрации легких фракций тремя путями:

1) дегидроциклизация алканов;

2) дегидрирование циклоалканов;

3) дегидрирование алкилзамещенных циклоалканов.

Процесс деструкции ароматических углеводородов ускоряется в смешанной микробной популяции, где степень окисления ароматических углеводородов ассоциацией микроорганизмов выше, чем отдельных компонентов чистыми культурами. Изучаемый биопрепарат «МД» является комплексным, т.е. содержит несколько культур углеводородокисляющих микроорганизмов, что способствует высокой скорости деструкции аренов.

Из рис. 3 видно, что после накопления ароматических углеводородов в течение 24 часов происходит их дальнейшая деструкция, объясняемая процессами соокисления. Так, углеводороды, устойчивые к биодеструкции (например, полиароматические), исчезают из среды вследствие разрушения в условиях сопряженных окислительных реакций.

Также отслеживалась деструкция общего числа компонентов в системе. Изначально в нефтепродукте содержалось 98 углеводородов. На рис. 4 изображена кривая изменения количества индивидуальных компонентов в смеси. Видно, что через 216 часов биодеструкции в системе их осталось 4, т.е. общее число компонентов уменьшилось в 25 раз. Остаточными углеводородами являются тяжелые парафины – преимущественно декан и пентадекан.

Параллельно в ходе исследования деструкции нефраса углеводородокисляющими микроорганизмами следили за численностью микроорганизмов. На рис. 5 отображена динамика изменения численности микроорганизмов в процессе биодеструкции.

pic_99.tif

Рис. 3. Динамика изменения доли ароматических соединений

pic_100.tif

Рис. 4. Динамика снижения числа индивидуальных компонентов в смеси

pic_101.tif

Рис. 5. Динамика изменения численности микроорганизмов

На полученной типичной кривой роста бактерий можно выделить 4 фазы: лаг-фаза (24–264 часа), соответствующая периоду физиологического приспособления. Именно в этой фазе происходит биодеструкция парафинов, изопарафинов, ароматических углеводородов. Далее в системе образуются кислородсодержащие органические соединения: эфиры (этил-трет-бутиловый эфир, трет-амиловый эфир, диизопропиловый эфир) и спирты (пропанол, бутанол), что соответствует экспоненциальной фазе роста бактерий (264–312 часов), характеризующейся максимальной скоростью клеточного деления. После 456 часов наступает фаза отмирания, причиной которой являются накопление токсичных метаболитов и разрушение под действием собственных ферментов.

Выводы

Таким образом, исследован процесс биодеструкции нефраса углеводородокисляющими микроорганизмами биопрепарата «МД». Показано, что комплексный состав биопрепарата способствует полной деструкции всех классов углеводородов входящих в состав нефтепродукта. Доказано, что быстрее всего биодеструкции подвергаются парафины и нафтены, их концентрация через 48 часов снижается на 80 %. Через 216 часов биодеструкции концентрация изопарафинов уменьшается на 100 %, происходит полное исчезновение данного класса углеводородов. Деструкции подвергаются также и ароматические углеводороды, их полная биотрансформация наступает через 9 суток воздействия биопрепарата.

Исследуемый биопрепарат является эффективным деструктором нефти и нефтепродуктов со схожими физико-химическими характеристиками нефраса.

Данные, полученные в ходе эксперимента, могут быть использованы при создании новых сообществ углеводородокисляющих микроорганизмов, ориентированных на физико-химические параметры загрязнителя.

Работа выполнена в рамках государственного задания «Наука» по теме 3.2702.2011.

Работа выполнена при поддержке программы проведения поисковой научно-исследовательской работы в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг «Поддержка научных исследований, проводимых молодыми учеными – кандидатами наук по научному направлению «Науки о жизни («Живые системы)» № 14 В37.21.1510

Рецензенты:

Короткова Е.И., д.х.н., профессор кафедры физической и аналитической химии, заместитель директора по научной работе и инновационному развитию, ФГБОУ ВПО «Национальный исследовательский Томский политехнический университет», г. Томск;

Ивашкина Е.Н., д.х.н., доцент кафедры химической технологии топлива и химической кибернетики, ФГБОУ ВПО «Национальный исследовательский Томский политехнический университет», г. Томск.

Работа поступила в редакцию 01.07.2013.


Библиографическая ссылка

Леонов К.А., Асташкина А.П., Мостовская Т.А., Ивасенко Д.А., Анциферов Д.В. ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССА ДЕСТРУКЦИИ НЕФРАСА УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 8-3. – С. 650-654;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=31975 (дата обращения: 30.10.2020).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074