Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,441

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ТИМОПОЭЗА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ КАНЦЕРОГЕНЕЗЕ

Москвичев Е.В. 1 Меркулова Л.М. 1 Стручко Г.Ю. 1
1 ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова», Россия, Чебоксары
С помощью иммуногистохимического метода исследован тимус крыс с экспериментальной опухолью толстой кишки, индуцированной введением 1,2-диметилгидразина. Установлено, что уже на стадии предопухолевых изменений в слизистой оболочке толстой кишки в дольке тимуса достоверно изменяется экспрессия маркеров клеточной пролиферации и апоптоза по сравнению с животными из группы контроля. Сформировавшаяся опухоль толстой кишки так же достоверно меняет морфологию и молекулярный фенотип тимуса по сравнению с животными соответствующего возраста из групп контроля. В структурах железы опытных крыс отмечается повышение экспрессии Bcl-2 на фоне снижения его антагониста белка p53. При этом в тимусе крыс экспериментальной группы наряду с инволютивными изменениями отмечаются признаки повышения экспрессии маркеров клеточной пролиферации, а также увеличение числа зрелых форм тимоцитов коркового вещества
инволюция тимуса
апоптоз
тимопоэз
опухолевая иммуносупрессия
1. Барышников Ю.А. Взаимодействие опухоли и иммунной системы // Практическая онкология. - 2003. - Т.4, №3. - С. 127-130.
2. Киселева Е.П. Механизмы инволюции тимуса при опухолевом росте // Успехи современной биологии. - 2004. - Т. 124. - C. 589-601.
3. Adkins B. Early Block in Maturation Is Associated with Thymic Involution in Mammary Tumor-Bearing Mice / Adkins B., Charyulu V., Sun Qi-Ling // The Journal of Immunology. - 2000. - Vol. 164. - P. 5635-5640.
4. Clarke S.L. CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells suppress anti-tumor immune responses in patients with colorectal cancer / Clarke S.L., Betts G.J., Plant A // PLoS One. 2006. - Vol.1, №27. - P. 129.
5. Costello R.T. Mechanisms of tumor escape from immunologic response / Costello R.T., Gastaut J.A., Olive D. // Rev Med Intern. - 1999. - Vol. 7, №20. - P. 579-588.
6. Gilbert J.M. Experimental colorectal cancer as a model of human disease // Ann R Coll Surg Engl. - 1987 - Vol. 69, №2. - Р. 48-53.
7. Joyce E.O. VEGF inhibits T-cell development and may contribute to tumor-induced immune suppression // Blood, June 2003. - Vol. 101, №12. - P. 4878-4886.
8. Kavanaugh D.Y. Immunologic dysfunction in cancer / Kavanaugh D.Y., Carbone D.P. // Hematol Oncol Clin North Am. - 1996 Aug. - Vol. 10, №4. - P. 927-951.
9. Lopez D.M. Influence of breast cancer on thymic function in mice / Lopez D.M., Charyulu V., Adkins B. // J Mammary Gland Biol Neoplasia. - 2002. - Vol. 7, №2. - P. 191-199.
10. Whiteside T.L. The role of immune cells in the tumor microenvironment // Cancer Treat Res. - 2006. - Vol. 130. - P. 103-124.

Рост злокачественных новообразований зачастую сопровождается угнетением иммунного ответа, при этом опухоль перестает распознаваться как чужеродная ткань и ускользает от иммунного надзора [5, 10]. Существует несколько механизмов иммуносупрессивного действия опухоли [8]. Один из них реализован на способности опухоли к образованию иммуносупрессивных Т-reg клеток с фенотипом CD3+/CD4+/CD25+/Foxp3 в зоне локального иммунного ответа, которые угнетают местный иммунитет [4]. Известно, что иммуносупрессивные Т-reg клетки могут происходить из зрелых периферических Т-хелперов, число которых значительно возрастает при опухолевом рос- те [1]. Другой механизм основан на прямом иммуносупрессивном влиянии продуктов метаболизма опухоли и ее биологически активных веществ на иммунные органы, что снижает продукцию ими иммунокомпетентных клеток либо приводит к выработке дефектных цитотоксических лимфоци- тов [7], кроме того, опухоль способна нарушать поступление клеток предшественников в иммунокомпетентные органы без снижения их синтеза в костном мозге.

Тимус - центральный орган иммуногенеза, который подвергается инволютивным изменениям при канцерогенезе, в некоторых случаях это приводит к снижению тимопоэза [9], однако механизмы инволюции изучены недостаточно. Доступные литературные данные немногочисленны и, зачастую, противоречивы. Так, например, одни авторы указывают на недостаточное поступление в железу костномозговых предшественников тимопоэза [2], в то время как другие это нарушение отрицают [9]. В работах Becky Adkins с соавт. (2000) [3] было сделано предположение, что злокачественные опухоли могут усиливать апоптоз, а также нарушать созревание и дифференцировку тимоцитов в зрелые формы, однако это предположение не было доказано экспериментально. На основании вышеизложенного целью исследования явилось исследование характеристик клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза тимоцитов, а также компонентов их микроокружения в тимусе крыс с экспериментальной опухолью толстой кишки.

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на 50 белых нелинейных крысах-самцах массой 180-220 г. Уход и содержание животных проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Крысы были разделены на три группы. Первой группе (30 крыс) внутрибрюшинно водили 1,2-диметилгидразин из расчета 20 мг/кг массы 1 раз в неделю в течение 5 недель в соответствие с экспериментальной моделью [6]. Второй группе животных (группа контро- ля - 10 крыс) вводили изотонический раствор хлорида натрия. Изменения в опытной и контрольной группе сравнивали с интактными животными третьей группы соответствующего возраста (10 крыс). Выведение животных из эксперимента проводилось через 30, 90, и 150 суток после окончания курса введения канцерогена путем декапитации. Одновременно выводились и контрольные животные соответствующего возраста. Объектом исследования служил тимус. В работе применялись следующие методы:

1. Иммуногистохимический метод с использованием четырех коммерческих моноклональных антител (МКАТ) фирм Santa Cruze (США):

а) МКАТ к кластеру дифференцировки лимфоцитов 3 типа (CD 3);

б) МКАТ к маркеру клеточной пролиферации Ki-67;

в) МКАТ к белку-регулятору апоптоза p-53;

г) МКАТ к антиапоптотическому белку bcl-2.

Материал для исследования иммуногистохимическими методами фиксировали 10% нейтральным забуференным формалином в течение 24 ч, заливали в парафин, готовили срезы толщиной 4 мкм. Срезы наносили на высокоадгезивные стекла и высушивали при температуре 37 °С в течение 18 часов. Демаскировка и иммуногистохимическая окраска проводилась на иммуногистохимическом автостейнере Thermo Autostainer 360 (Великобритания). Контролем иммуногистохимической реакции служила неиммунизированная кроличья и мышиная сыворотка. Результат реакции оценивали с применением микроскопа Leica DM4000B (Германия) путем подсчета позитивно окрашенных клеток на 100 клеток в десяти полях зрения, выражая результаты в процентах и единицах в поле зрения.

2. Окраска гематоксилином и эозином для оценки общегистологической картины и проведения морфометрических измерений.

3. Компьютерная морфометрия с использованием лицензионных программ Leica application suite 3.6.0 (Германия) и Микроанализ (Россия).

4. Статистическая обработка с использованием лицензионного пакета программ MS Office 2003, достоверность определялась t-критерием Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

Обработка препаратов тимуса молодых интактных крыс 4 месяцев антителами к CD 3 выявляет многочисленные зрелые тимоциты, которые занимают 14,13% поля зрения коркового и 56,9% мозгового вещества. Окраска препаратов антителами к bcl-2 выявляет единичные клетки, расположенные в мозговом веществе и на границе мозгового и коркового вещества. Их число не превышает 2,72 ± 0,18 в поле зрения. Исследование экспрессии p-53 демонстрирует позитивную реакцию в единичных клетках коркового и мозгового вещества. Обработка препаратов тимуса маркером клеточной пролиферации Ki-67 выявляет многочисленные пролиферирующие клетки в корковом и мозговом веществе. Установлено, что положительную реакцию с Ki-67 дают 9,42% клеток мозгового и 34,8% клеток коркового вещества.

Через месяц после окончания введения канцерогена в слизистой оболочке толстой кишки крыс формируются очаговые пролифераты крипт без признаков клеточной атипии. При окраске тимуса антителами к CD 3 отмечается положительная реакция в многочисленных клетках коркового и мозгового вещества, число которых достоверно не отличается от интактных и контрольных животных соответствующего возраста. Обработка препаратов тимуса антителами к белкам-регуляторам апоптоза bcl-2 и p-53 выявляет немногочисленные клетки, локализованные в корковом и мозговом веществе, число которых также достоверно не отличается от значений у интактных и контрольных животных. Исследование маркера клеточной пролиферации не выявляет достоверных отличий в количестве пролиферирующих клеток по сравнению с интактными животными соответствующего возраста и крысами с введением физиологического раствора.

Через три месяца после окончания введения канцерогена в пролифератах кишечных крипт на фоне локальной иммунной реакции прослеживаются явления клеточной дисплазии. Окраска препаратов тимуса крыс экспериментальной группы антителами к CD 3 демонстрирует достоверное снижение количества клеток, экспрессирующих этот антиген, в корковом веществе по сравнению с интактными и контрольными животными, тогда как в мозговом веществе достоверные изменения отсутствовали. Обработка препаратов тимуса антителами к антиапоптотическому белку bcl-2 демонстрирует более чем трехкратное увеличение экспрессии этого антигена в клетках коркового и мозгового вещества по сравнению с интактными и контрольными животными соответствующего возраста. Определение белка p-53 не выявило достоверных отличий в его экспрессии в группах экспериментальных и контрольных животных. При исследовании маркера клеточной пролиферации Ki-67 отмечено небольшое, но достоверное увеличение экспрессии этого антигена в структурах коркового вещества до 46,4%, тогда как экспрессия Ki-67 в структурах мозгового вещества достоверно не изменялась.

Через пять месяцев после окончания введения канцерогена в толстой кишке формируется одна, реже две злокачественные опухоли, имеющие морфологию дифференцированной аденокарциномы. В тимусе крыс экспериментальной группы на этом сроке определяются признаки инволюции в виде уменьшения площади дольки и мозгового вещества, а также толщины коркового вещества. Снижение морфометрических характеристик сопровождается уменьшением относительной массы железы, а также замещением тимической паренхимы жировой тканью. Обработка препаратов тимуса антителами к CD 3 выявляет достоверное увеличение количества зрелых тимоцитов в корковом веществе по сравнению с интактными крысами и животными из группы контроля, при этом изменения в количестве этих клеток в мозговом веществе достоверно не отличаются от других групп (рис. 1, 2).

Рис. 1. Тимус интактной крысы 9 месяцев. Экспрессия CD3 в тимоцитах коркового вещества: 1 - тимоциты, дающие мембранную реакцию с CD3; 2 - незрелые тимоциты. Иммуногистохимическая реакция с CD3. Ув. 400

Рис. 2. Тимус крысы через 5 месяцев после введения канцерогена.
Увеличение числа клеток, экспрессирующих CD3 в корковом веществе: 1 - тимоциты, дающие мембранную реакцию с CD3. Иммуногистохимическая реакция с CD3. Ув. 400

Мы считаем, что увеличение количества зрелых форм тимоцитов в корковом веществе может быть обусловлено как нарушением поступления незрелых костно-мозговых предшественников вследствие токсического влияния опухоли, так и увеличением числа дифференцированных форм [2]. Окраска тимуса антителами к маркеру клеточной пролиферации Ki-67 выявляет достоверное увеличение числа пролиферирующих клеток в корковом и мозговом веществе по сравнению с интактными крысами соответствующего возраста, а также контрольными животными с введением физиологического раствора (рис. 3, 4).

Рис. 3. Тимус интактной крысы 9 месяцев. Экспрессия Ki-67 в ядрах клеток коркового вещества. Иммуногистохимическая реакция к Ki-67. Ув. 400

Рис. 4. Тимус крысы через 5 месяцев после введения канцерогена. Увеличение клеток, экспрессирующих Ki-67 в корковом веществе. Иммуногистохимическая реакция к Ki-67. Ув. 400

Исследование белка-ингибитора апоптоза bcl-2 в структурах тимуса демонстрирует более чем двукратное увеличение его экспрессии в структурах коркового и мозгового вещества у экспериментальных крыс по сравнению с интактными и контрольными животными соответствующего возраста. Обработка препаратов тимуса антителами к p-53 демонстрирует небольшое, но достоверное снижение экспрессии этого белка в структурах коркового вещества тимуса по сравнению с интактными и контрольными животными.

Нами установлено, что развивающаяся злокачественная опухоль толстой кишки у крыс оказывает существенное влияние на морфологию тимуса, при этом достоверные изменения в железе регистрируются уже на этапе предопухолевых изменений слизистой оболочки кишки через три месяца после введения канцерогена. Это проявляется в увеличении экспрессии антиапоптотического белка bcl-2, а также в повышении экспрессии Ki-67 в корковом веществе тимуса. Мы считаем, что подобное усиление клеточной пролиферации следует рассматривать как иммунную реакцию организма на канцерогенез. Предопухолевые изменения в толстой кишке также сопровождаются достоверным снижением числа зрелых кортикальных тимоцитов, что, в свою очередь, может быть обусловлено как усиленным поступлением в тимус незрелых костно-мозговых предшественников с фенотипом CD3-, так и миграцией зрелых клеток в зону локального иммунного ответа в слизистой оболочке толстой кишки.

Сформировавшаяся опухоль толстой кишки оказывает еще более существенное влияние на морфологию и молекулярный фенотип тимуса, при этом в железе, наряду с морфологическими изменениями, характерными для инволюции, отмечаются признаки усиления дифференцировки тимоцитов. Это проявляется в достоверном повышении экспрессии маркеров клеточной пролиферации, увеличении числа кортикальных тимоцитов, экспрессирующих CD3, а также в значительном увеличении экспрессии антиапоптотического белка bcl-2 в структурах мозгового вещества на фоне снижения экспрессии его антагониста - белка p-53 в корковом веществе железы. Таким образом, при экспериментальной опухоли толстой кишки в тимусе на фоне изменений, характерных для инволюции, регистрируются признаки усиления пролиферации и дифференцировки тимоцитов в зрелые формы, что, по-видимому, обусловлено формированием опухолевой иммунной толерантности [1, 5].

Работа выполнена в рамках государственного контракта №02.740.11.0708 ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг.

Рецензенты:

  • Киясов А.П., д.м.н., профессор, зав. кафедрой нормальной анатомии ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ, г. Казань;
  • Суворова Г.Н., д.б.н., профессор, зав. кафедрой анатомии человека Самарского государственного медицинского университета, г. Самара.

Работа поступила в редакцию 14.08.2012.


Библиографическая ссылка

Москвичев Е.В., Меркулова Л.М., Стручко Г.Ю. ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ТИМОПОЭЗА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ КАНЦЕРОГЕНЕЗЕ // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 8-2. – С. 367-371;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=30371 (дата обращения: 21.09.2020).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074