Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,074

ТОПОХИМИЯ МЕМБРАННОЙ ФОРМЫ АЛЬДЕГИДДЕГИДРОГЕНАЗЫ ЭРИТРОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

Зимин Ю.В. 1 Соловьева А.Г. 1
1 ФГБУ «ННИИТО» Минздравсоцразвития России, Нижний Новгород
Исследовались активность и кинетические характеристики альдегиддегидрогеназы во фракциях эритроцитов крови человека. Выявлена топохимия надмолекулярных форм фермента. Показано, что наибольшая активность альдегиддегидрогеназы преобладает в «тенях» эритроцитов, которые представляют мембрану данных клеток. Установлено, что сродство к субстратам реакции и коэффициент каталитической эффективности мембраносвязанной альдегиддегидрогеназы выше, чем у фермента в матриксе и гемолизате эритроцитов. Результаты солюбилизации показали, что мембранная форма альдегиддегидрогеназы неоднородна и представлена лабильно- и прочносвязанной формами. По мере удаления части фермента с мембраны эритроцитов сродство альдегиддегидрогеназы к субстратам реакции в «тенях» эритроцитов возрастает. Полученные данные играют определяющее значение для регуляции данного фермента биотрансформации в клетке.
эритроцит
мембрана
альдегиддегидрогеназа
топохимия
1. Зимин Ю. В. Системный кинетический анализ мультиэнзимных комплексов клетки // Рук. деп. в ВИНИТИ. – 1993. – № 1541, В93. – 6 с.
2. Кершенгольц Б.М., Ильина Л.П. Биологические аспекты алкогольных патологий и наркоманий. – Якутск: Изд-во ЯГУ, 1998. – 150 с.
3. Макаренко Е.В. АТФазная активность эритроцитов при хронических заболеваниях печени и желудка // Лабораторное дело. – 1987. – №2. – С. 14–17.
4. Фридрих П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные комплексы. – М.: Мир, 1986. – 374 с.
5. Comparative proteomics of erythrocyte aging in vivo and in vitro / G.J. Bosman, E. Lasonder, Y.A. Groenen-Dцpp, F.L. Willekens, J.M. Werre,V.M. Novotnэ // J. Proteomics. – 2010. – Vol. 73, № 3. – P. 396–402.
6. Erythrocyte aldehyde dehydrogenase activity: lack of association with alcohol use and dependence or alcohol reactions in Australian twins / N.K. Hansell, D. Pang, A.C. Heath, N.G. Martin, J.B. Whitfield // Alcohol Alcohol. – 2005. –
Vol. 40, № 5. – P. 343–348.
7. Henehan G.T., Tipton K.F. Steady-state kinetic analysis of aldehyde dehydrogenase from human erythrocytes // Biochem J. – 1992. – Vol. 1, № 287. – P. 145–150.
8. Biological markers of alcoholism with respect to genotypes of low-Km aldehyde dehydrogenase (ALDH2) in Japanese subjects / F. Nomura, S. Itoga, M. Tamura, S. Harada, Y. Iizuka, T. Nakai // Alcohol Clin Exp Res. – 2000. – Vol. 24, №4. – P. 303–333.

Хорошо известно, что практически все ферменты, в частности внутриклеточные, никогда не функционируют в условиях, отвечающих классической кинетике Михаэлиса-Ментен, так как они находятся в сложной гетерогенной системе клетки. Сегодня доказано, что ферменты большинства метаболических путей связаны с теми или иными мембранными структурами клетки. При этом ферменты, действующие в гетерогенном окружении, приобретают новые свойства, которые отсутствуют у тех же ферментов, когда они находятся в разбавленном растворе [4].

Одной из наиболее изученных клеточных моделей, в состав которой входят различные мультиэнзимные комплексы, является эритроцит. Данная клетка чрезвычайно интересна тем, что в ее ферментативном ансамбле присутствуют ферменты биотрансформации ксенобиотиков. Одним из таковых является альдегиддегидрогеназа (КФ 1.2.1.3., АлДГ). Особенности регуляции АлДГ эритроцита до сих пор в научной литературе представлены крайне фрагментарно, особенно это касается различных молекулярных форм фермента [5, 6, 7, 8]. Остается невыясненной физиологическая роль взаимодействия АлДГ с мембраной эритроцитов.

Целью данной работы явилось выявление топохимии надмолекулярных форм альдегиддегидрогеназы эритроцитов крови человека.

Материал и методы исследования

Кровь для исследования брали у практически здоровых людей из локтевой вены с 4%-м раствором цитрата натрия (соотношение 9:1) с соблюдением всех необходимых правил в условиях медицинского стационара. Эритроциты осаждали (800g; 10 мин), промывали 5-кратным объемом 0,15М NaCl с 10мМ трис-НСl (рН 7,4), гемолизировали, через 30 мин центрифугировали (16000g; 10 мин) [3]. Активность АлДГ определяли в «тенях» эритроцитов и супернатанте [2]. Солюбилизацию эритроцитарной АлДГ проводили путем однократного суспендирования «теней» эритроцитов в 0,15 М и 0,3 М растворах КСl. Определяли следующие кинетические характеристики альдегиддегидрогеназы: Kt, Vmax, Vmax/Kt (Кa) [1], где Kt - время достижения Vmax ферментативной реакции (мин); Vmax - максимальная скорость накопления продукта реакции при полном расходовании субстрата (мкмоль/мин); Vmax/Kta) - коэффициент каталитической эффективности ферментативной реакции (мкмоль/мин2) [1]. Статистический анализ результатов исследований выполнен с использованием программы Statistica 6.

Результаты исследования и их обсуждение

Проведенные исследования показали, что активность фермента в «тенях» эритроцитов, которые представляют мембрану данных клеток, составила 51,3% от общей активности АлДГ в гемолизате клеток, а в матриксе эритроцитов - 45,2% (табл. 1).

Таблица 1

Распределение активности альдегиддегидрогеназы во фракциях эритроцитов крови человека (нмольНАДН/мин×мг белка)

Фракции эритроцита

Активность фермента

Гемолизат эритроцитов

195,93 ± 4,26

Матрикс эритроцитов

88,48 ± 2,64

p = 0,002

«Тени» эритроцитов

100,45 ± 1,54

p = 0,003

Учитывая, что активность альдегиддегидрогеназы во фракции «теней» эритроцитов выше, чем в матриксе, можно полагать, что АлДГ - преимущественно мембранносвязанный фермент. Поэтому дальнейшие эксперименты с мембранной формой альдегиддегидрогеназы были посвящены определению прочности связи фермента с мембраной эритроцита.

Однократное воздействие на фрагменты мембран эритроцитов 0,15М раствором КСl приводит к статистически значимому снижению активности альдегиддегидрогеназы в «тенях» данных клеток на 39,5%, а также увеличению активности фермента на 53,3% в супернатанте, полученном после центрифугирования (табл. 2).

Однократная солюбилизация мембраносвязанной альдегиддегидрогеназы эритроцитов 0,3М раствором КСl вызывает статистически значимое увеличение активности АлДГ в супернатанте на 65,5% и уменьшение в «тенях» эритроцитов на 49,1% (см. табл. 2).

Полученные результаты исследования позволяют предположить, что альдегиддегидрогеназа находится в эритроцитах, как минимум в трех основных надмолекулярных формах (матриксная форма, лабильно связанная с мембраной форма АлДГ и прочносвязанная с мембраной эритроцитов форма фермента).

В табл. 3 представлена кинетическая характеристика альдегиддегидрогеназы различных фракций эритроцита.

Таблица 2

Активность альдегиддегидрогеназы после солюбилизации с мембраны эритроцитов под влиянием 0,15М и 0,3М KCl (нмольНАДН/мин∙мг белка)

Условия эксперимента

Супернатант

«Тени» эритроцитов

До солюбилизации

-

100,45 ± 1,54

После солюбилизации 0,15М раствором КСl

189,53 ± 7,84

p = 0,009

60,73 ± 2,58

p = 0,019

После солюбилизации 0,3М раствором КСl

256,23 ± 6,91

p = 0,004

51,09 ± 1,77

p = 0,012

 

Таблица 3

Кинетическая характеристика альдегиддегидрогеназы различных фракций эритроцитов крови человека (Kt, Vmax, Ka)

Фракции эритроцита

Kt

Vmax

Ka

Гемолизат эритроцитов

1,20 ± 0,17

0,38 ± 0,06

0,32 ± 0,02

«Тени» эритроцитов

0,54 ± 0,08

p = 0,031

0,85 ± 0,08

p = 0,016

1,57 ± 0,06

p = 0,007

Матрикс эритроцитов

0,87 ± 0,04

p = 0,043

0,48 ± 0,02

0,55 ± 0,03

p = 0,038

Видно, что сродство к субстратам реакции (Kt) и коэффициент каталитической эффективности (Ka) мембранносвязанной АлДГ («тени» эритроцитов) выше, чем у альдегиддегидрогеназы в матриксе и гемолизате эритроцитов.

Использование KCl для солюбилизации АлДГ с мембраны эритроцитов позволило выявить определенную закономерность в изменении кинетической характеристики данного фермента. В частности, по мере удаления части АлДГ с мембраны эритроцитов, сродство фермента к субстратам реакции возрастает (табл. 4). При этом в супернатанте значение Kt, наоборот, возрастает.

Предполагается, что мембранная форма АлДГ неоднородна и представлена, как минимум, двумя формами фермента: лабильно- и прочносвязанной, на что указывают данные по солюбилизации КСl (0,15М и 0,3М) (см. табл. 4).

Таблица 4

Кинетические характеристики альдегиддегидрогеназы после солюбилизации с мембраны эритроцитов под влиянием 0,15М и 0,3М KCl (Kt, Vmax, Ka)

Фракции эритроцита

Kt

Vmax

Ka

«Тени» эритроцитов

До солюбилизации

0,54 ± 0,08

0,85 ± 0,08

1,57 ± 0,06

0,15М KCl

0,43 ± 0,05

0,94 ± 0,07

2,19 ± 0,08

p = 0,021

0,3М KCl

0,36 ± 0,04

1,15 ± 0,09

p = 0,016

3,20 ± 0,07

p = 0,007

Супернатант

0,15М KCl

0,65 ± 0,04

0,66 ± 0,06

1,02 ± 0,05

0,3М KCl

0,72 ± 0,05

0,64 ± 0,05

0,89 ± 0,04

Таким образом, можно полагать, что альдегиддегидрогеназа, вернее, ее различные надмолекулярные формы, имеют определенную топохимическую организацию в эритроцитах крови человека, что играет определяющее значение для регуляции данного фермента биотрансформации в клетке.

Рецензенты:

  • Веселов А.П., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биохимии и физиологии растений, декан биологического факультета ГОУ ВПО «ННГУ им. Н.И. Лобачевского», г. Нижний Новгород;
  • Корягин А.С., д.б.н., профессор кафедры физиологии и биохимии человека и животных ГОУ ВПО «ННГУ им. Н.И. Лобачевского», г. Нижний Новгород.

Работа поступила в редакцию 09.04.2012


Библиографическая ссылка

Зимин Ю.В., Соловьева А.Г. ТОПОХИМИЯ МЕМБРАННОЙ ФОРМЫ АЛЬДЕГИДДЕГИДРОГЕНАЗЫ ЭРИТРОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 5-2. – С. 412-414;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=29947 (дата обращения: 22.09.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074