Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,074

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ТИМУСА ПОСЛЕ ПРИМЕНЕНИЯ ПОЛИОКСИДОНИЯ

Стручко Г.Ю. 1 Меркулова Л.М. 1 Москвичев Е.В. 1 Кострова О.Ю. 1 Михайлова М.Н. 1 Мухаммад Захид 1 Бессонова К.В. 1
1 ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова», Чебоксары
С помощью иммуногистохимических, люминесцентно-гистохимических и общегистологических методов исследован тимус нелинейных лабораторных крыс-самцов через три недели после введения полиоксидония. Впервые описано, что использование полиоксидония приводит к снижению уровня гистамина во всех структурах тимуса, особенно в лимфоцитах коркового и мозгового вещества, содержание серотонина и катехоламинов в люминесцирующих гранулярных клетках увеличивается, в тимоцитах – практически не изменяется. При этом соотношение (серотонин + гистамин)/катехоламины во всех структурах достоверно снижается, особенно в тимоцитах коркового и мозгового вещества. Впервые выявлено, что большая часть клеток внутренней кортикальной, субкапсулярной зон тимуса (50–60%) дают положительную реакцию на белок S-100 и экспрессируют CD 23, что позволяет их отнести к дендритным клеткам. Среди клеточных структур этих зон 20–25% – апудоциты (экспрессируют синаптофизин и дают положительную реакцию на хромогранин А), до 20% – макрофаги (CD68-позитивные и содержат фермент лизоцим). Установлено, что применение полиоксидония в течение трех недель приводит к увеличению количества CD3+-лимфоцитов в паренхиме тимуса на 15–25%, а CD5+- лимфоцитов – на 10–15%.
тимус
полиоксидоний
дендритные клетки
тучные клетки
биогенные амины
1. Варфоломеева М.И. Обоснование назначения и применения Полиоксидония в лечении и профилактике ОРВИ / М.И. Варфоломеева, Б.В. Пинегин // Трудный пациент. – 2011. – №6. – С. 26–35.
2. Ильин Д.А. Актуальные аспекты изучения тучных клеток in vitro // Современный мир, природа и человек. – Томск, 2011. – №1, Т.2 – С. 56–70.
3. Исамухамедова М.Т. Сочетание применения виферона и полиоксидония у детей раннего возраста с внутриутробными инфекциями / М.Т. Исамухамедова, М.К. Шарипова // Цитокины и воспаление. – 2010. – №9. – С. 39–44.
4. Кветной И.М. Соотношение апоптоза и пролиферации клеток тимуса при его инволюции / И.М. Кветной, В.О. Полякова, Н.С. Линькова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2011. – №4. – С. 442–444.
5. Лапина Т.И. Гистологическая картина тимуса кролика, стимулированного полиоксидонием / Т.И. Лапина, Н.А. Антонова // Естествознание и гуманизм. – Ставрополь, 2006. – Т.3, Вып. 1. – С. 78–79.
6. Нурмуханбетов А.Н. Влияние МХФ-2 на структурно-клеточную организацию тимуса опытных крыс с асептическим воспалением / А.Н. Нурмуханбетов, Т.П. Ударцева, М.К. Балабекова // Вестник КРСУ. – 2011. – №7, Т. 11. –
С. 102–106.
7. Сибилева Е.Н. Синдром увеличения вилочковой железы у детей раннего возраста // Педиатрия и неонатология. – 2008. – С. 36–47.
8. Труфакин В.А. Проблемы гистофизиологии иммунной системы / В.А. Труфакин, А.В. Шурлыгина // Иммунология. – 2002. – №1. – С. 4–8.
9. Хаитов Р.М. Иммунология. – М.: Изд-во «Медицина», 2006. – 320 с.

Изучение механизмов функционирования иммунной системы является актуальной медицинской проблемой, которая может помочь не только в лечении, но и в предотвращении развития различных заболеваний. Недостаточная изученность многих аспектов деятельности иммунной системы связана, с одной стороны, с чрезвычайно большим количеством типов клеток, участвующих в иммунных реакциях, а с другой - отсутствием доступных способов их идентификации в каждой конкретной ситуации [2, 4].

Иммунная система является уникальным защитным механизмом, обеспечивающим гомеостаз, и при контакте с любым антигеном она не только реагирует в виде специфического иммунного ответа, но и способна вовлекать в этот процесс через гуморальные факторы нервную и эндокринную системы [8]. Ведущая роль в таких взаимодействиях принадлежит тимусу, в котором присутствуют многочисленные клеточные типы, обеспечивающие процессы иммуногенеза. Морфологические перестройки в тимусе, возникающие в ответ на стресс, на различные антигены, носят адаптивный характер и сопровождаются изменением цитоархитектоники и микроокружения клеток, что, по-видимому, и является причиной развития иммунодефицитов в этих условиях [6, 7].

Как известно, применение препаратов с иммунотропными свойствами обязывает к тщательному контролю их действия на морфофункциональное состояние органов. Поэтому изучение этого вопроса является весьма актуальным и в теоретическом, и в прикладном аспектах. В настоящее время одним из наиболее изучаемых иммуномодуляторов является «Полиоксидоний», который обладает сложным и многогранным действием на иммунную и эндокринную системы, усиливая и клеточный, и гуморальный иммунитет [1, 3, 5, 8]. Однако для признания полиоксидония как универсального препарата с широким спектром действия не хватает данных о его влиянии на органы иммунитета на клеточном и тканевом уровнях.

Таким образом, всестороннее исследование взаимодействия морфофункционального состояния тимуса на фоне применения иммуномодулятора «Полиоксидоний» является важной и перспективной задачей современной иммуноморфологии, имеющей как фундаментальное, так и прикладное значение.

Цель исследования - оценить функциональное состояние тимуса через три недели применения полиоксидония

Материал и методы исследования

Объектом исследования явился тимус 130 белых нелинейных крыс-самцов одного возраста и одной массы (180-220 г), содержавшихся в обычных условиях при естественном освещении и сбалансированном рационе питания. Все действия, преду­сматривавшие контакты с экспериментальными животными, осуществлялись в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Животные были разделены на 3 группы: первая - интактные крысы (n = 25); вторая - контрольная группа животных с внутримышечным введением физиологического раствора по 0,5 мл 2 раза в неделю в течение 3 недель (n = 35); третья - животные с внутримышечным введением полиоксидония из расчета 0,1 мг/кг 2 раза в неделю в течение 3 недель (доза адекватна лечебной для человека, исходя из соотношения средней массы крысы и человека) (n = 70).

В работе использовались следующие методы:

1. Иммуногистохимические методы исследования с использованием моноклональных антител фирмы Santa Cruze, разделенных на группы по функциональной значимости:

  1. маркеры зрелых Т-лимфоцитов - CD3, CD5, CD45RO;
  2. маркеры В-лимфоцитов и NK-клеток- CD12, CD30;
  3. маркеры макрофагов- CD68, лизоцим;
  4. маркеры дендритных клеток - CD23, белок S-100;
  5. маркеры нейроэндокринных клеток - хромогранин А, синаптофизин.

2. Люминесцентно-гистохимический метод Фалька-Хилларпа - для избирательного выявления катехоламин- и серотонинсодержащих структур тимуса.

3. Люминесцентно-гистохимический метод Кросса, Эвена, Роста - для идентификации гистаминсодержащих структур тимуса.

4. Метод цитоспектрофлюориметрии - для количественной оценки уровня катехоламинов (КА), серотонина (СТ) и гистамина (ГСТ) в структурах тимуса. Для этого на люминесцентный микроскоп была установлена насадка ФМЭЛ-1А при выходном напряжении 900 В.

5. Метод непрямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител - для установления локализации белка S-100 в структурах тимуса.

6. Окраска полихромным толуидиновым синим по Унна - для качественной и количественной характеристики тучных клеток.

7. Окраска гематоксилином-эозином - в качестве общегистологической окраски с последующей морфометрией долек тимуса. Измерение диаметра коркового и толщины мозгового вещества производились с помощью светового микроскопа и винтового окулярного микрометра МОВ-1-15´, установленного на микроскоп при увеличении объектива 8´ и окуляра 15´.

Результаты исследования и их обсуждение

С помощью люминесцентной микроскопии у интактных крыс выявляются четко очерченные дольки тимуса с заметным корковым и мозговым веществом. Во внутренней кортикальной зоне располагается ряд люминесцирующих гранулярных клеток с беловато-желтыми включениями, ограничивающие мозговое вещество в виде ободка в 1-2 ряда - премедуллярные клетки. По периферии дольки в субкапсулярной зоне выявляются более мелкие клетки с зеленовато-желтыми гранулами в цитоплазме - субкапсулярные клетки. Применение полиоксидония приводит к изменению цитоархитектоники тимуса: дольки увеличиваются в размерах как за счет диаметра коркового, так и за счет площади мозгового вещества. Премедуллярные клетки окружают мозговое вещество плотным кольцом в 4-5 рядов. Клетки крупные, яркие, желтовато-белой люминесценции. Количество премедуллярных клеток увеличивается до 18-20 в поле зрения, что на 50-60% превышает норму. В 15-20% случаев наблюдается «вклинение» кортико-медуллярного ряда клеток в субкапсулярный (рис. 1).

У интактных животных преобладающим биогенным амином во всех исследованных структурах является гистамин, особенно в тимоцитах коркового и мозгового вещества, где его уровень в 3-4 раза выше содержания катехоламинов и серотонина в этих же структурах.

В премедуллярных клетках после применения полиоксидония содержание серотонина и катехоламинов увеличивается на 67%, уровень гистамина практически не изменяется. Это приводит к снижению соотношения (СТ+ГСТ)/КА до 5,04 против 6,31 у интактных животных. В то же время в тимоцитах коркового вещества содержание серотонина и катехоламинов увеличивается незначительно, а уровень гистамина падает почти в 2 раза, что проявляется в резком снижении соотношения (СТ+ГСТ)/КА до 3,92. У интактных животных этот индекс составляет 5,7.

Рис. 1. Тимус. Полиоксидоний, 3 недели. Крупные люминесцирующие клетки внутренней кортикальной зоны вокруг темного мозгового вещества. Метод Фалька. ЛЮМАМ-4. Об. 8, гомаль 1,7

В клетках субкапсулярного ряда уровень серотонина возрастает почти на 20%. Это придает им беловатую люминесценцию, что и отмечалось нами при визуализации. Содержание катехоламинов снижается на 15%, а гистамина - в 1,6 раза. Такое перераспределение биогенных аминов в макрофагах субкапсулярной зоны, вероятнее всего, является ответной реакцией на значительные изменения в клетках премедуллярного ряда и тимоцитах коркового вещества. Поэтому соотношение (СТ + ГСТ)/КА в субкапсулярных клетках практически не изменяется: 5,95 против 6,45 у интактных крыс.

Рис. 2. Тимус. Интактные животные. Т-2 формы тучных клеток с β1- и β2-метахромазией. Ок. толуидиновым синим по Унна. Об. 10, ок. 10, гомаль 3,0

Исследование морфологии тучных клеток с помощью окраски полихромным толуидиновым синим показало, что в норме преобладают дегранулированные формы клеток (79,2%) с β1- и β2-метахромазией (рис. 2). После введения полиоксидония отмечается увеличение количества тучных клеток (рис. 3). В 33,2% случаев - это недегранулированные формы клеток с β1-ме­- тахромазией. Соответственно дегранулированные формы занимают 62,6%, что на 16,6% меньше, чем у интактных крыс.

Рис. 3. Тимус. Полиоксидоний, 3 недели. Увеличение количества тучных клеток в септах дольки. Ок. толуидиновым синим по Унна. Об. 20, ок. 10, гомаль 3,0

Окраска срезов тимуса гемотоксилином-эозином и проведение морфометрии долек выявили следующее: толщина коркового вещества после применения полиоксидония увеличивается на 19%, а площадь мозгового вещества возрастает на 36%. При этом масса тимуса практически не отличается от нормы и контрольной группы.

Для изучения маркеров зрелых Т-лим­фо­цитов и Т-клеток памяти нами исполь­зо­вались моноклональные антитела к CD3 и CD5. Известно, что антигены CD3 и CD5 экспрессируются на поздних тимоци­тах и зрелых Т-клетках. Однако, если CD3+-клет­- ки - это строго специфичные Т-лимфоциты, то CD5-позитивными могут быть и В-лим­фоциты внутридольковых периваскулярных пространств. Выявлено, что у интактных и контрольной групп животных количество CD3+-клеток составляет 25-35% общей доли лимфоцитов. Они располагаются в основном в мозговом веществе тимуса и во внутридольковых периваскулярных пространствах. После применения полиоксидония число CD3+-клеток возрастает до 50%. Это связано не только с увеличением количества самих зрелых Т-лимфоцитов, но и с увеличением диаметра и площади мозгового вещества тимусной дольки на 20 и 36% соответственно. Количество CD5+-лимфоцитов незначительно превышает число CD3+-клеток за счет В-лимфоцитов внутридольковых периваскулярных пространств и составляет около 35-40% у интактных и 45-55% - у экспериментальных животных.

Для изучения гистотопографии макрофагов тимуса нами использовались моноклональные антитела к CD68 и фермент лизоцим. CD68-позитивные клетки у интактных животных всегда выявляются в небольшом количестве во всех зонах тимусной дольки и под капсулой рядом с жировой тканью (рис. 4). Аналогичная картина наблюдается и при обработке парафиновых срезов на лизоцим (рис. 5). После применения полиоксидония наблюдается увеличение количества макрофагов в 1,5-2,2 раза и группирование их вокруг мозгового вещества.

Одним из ключевых структурных элементов тимуса, помимо лимфоцитов и эпителиальных клеток, являются дендритные клетки. Для их выявления нами применялись антитела к антигену CD23 и белку S-100. У интактных животных дендритные клетки обнаруживаются, наряду с макрофагами и нейроэндокринными клетками, в основном во внутренней кортикальной зоне. Единичные клетки выявляются под капсулой, по ходу соединительной ткани, в мозговом веществе.

Гистологическая картина тимуса существенно меняется после введения полиоксидония. Отмечается значительное увеличение CD23+-клеток как в корковом, так и в мозговом веществе. Дендритные клетки экспрессируют большое количество белка S-100, что делает их яркими при люминесцентной микроскопии. Их количество и размеры заметно увеличиваются, особенно во внутренней кортикальной зоне и мозговом веществе дольки тимуса.

Среди общеизвестных структур тимуса выявляются клетки, которые по своим морфологическим и физиологическим характеристикам невозможно отнести ни к макрофагам, ни к дендритным клеткам. Они диффузно располагаются во всех зонах тимуса, особенно много их выявляется во внутреннем кортикальном слое. Для того чтобы получить информацию о данном типе клеток, нами использовались моноклональные антитела к хромогранину А и сипаптофизину - маркерам клеток нейроэндокринной системы.

Рис. 4. Тимус. Интактные животные. Макрофаги субкапсулярной зоны. Иммуногистохимическая реакция на CD68. Ув. 400×

Рис. 5. Тимус. Интактные животные. Макрофаги субкапсулярной зоны. Иммуногистохимическая реакция на лизоцим. Ув. 400×

Клетки АПУД-серии выявляются у интактных животных диффузно во всех зонах тимусной дольки. При люминесцентно-гистохимическом исследовании - это крупные, яркие с беловато-желтым свечением клетки и заметными гранулами в цитоплазме. Обработка парафиновых срезов на синаптофизин подтверждает наличие таких клеток во всех зонах, особенно в кортико-медуллярной. Использование иммуномодулятора приводит к увеличению количества клеток АПУД-серии и к повышению экспрессии в них синаптофизина.

Выводы

  1. Применение полиоксидония вызывает изменение морфофункционального состояния тимуса: во всех изучаемых клетках уровень гистамина снижается, особенно в лимфоцитах коркового и мозгового вещества, содержание серотонина и катехоламинов в люминесцирующих гранулярных клетках увеличивается в 1,2-1,7 раз, а в тимоцитах практически не изменяется. Отмечается увеличение тучных клеток с β1- и β2-метахромазией почти в 2 раза, на долю дегранулированных форм приходится 63% всех клеток. Выявляется увеличение площади тимусной дольки в 1,43 раза, толщины коркового вещества на 19%, площади мозгового вещества на 36%, корково-мозгового индекса в 1,5 раза при неизмененной массе органа.
  2. Большая часть клеток внутренней кортикальной, субкапсулярной зон (50-60%), а также среди тимоцитов мозгового вещества у интактных животных дают положительную реакцию на белок S-100 и экспрессируют антиген CD23, что позволяет отнести их к дендритным клеткам. До 20% клеток этих зон являются CD68-позитивными и содержат фермент лизоцим, проявляя тем самым свойства истинных макрофагов. 20-25% люминесцирующих гранулярных клеток экспрессируют синаптофизин и дают положительную реакцию на хромогранин А, т.е. относятся к клеткам АПУД-системы. Применение полиоксидония приводит к увеличению количества клеток во всех зонах тимуса, особенно во внутренней кортикальной зоне в основном за счет дендритных клеток и макрофагов. Количество CD3+-лимфоцитов в паренхиме тимуса возрастает на 15-25%, а CD5+-лимфоцитов - на 5-10%.

Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ МД-2936.2011.7.

Рецензенты:

  • Ямщиков Н.В., д.м.н., профессор, зав. кафедрой гистологии и эмбриологии ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ, г. Самара;
  • Челышев Ю.А., д.м.н., профессор, зав. кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, г. Казань.

Работа поступила в редакцию 06.04.2012.


Библиографическая ссылка

Стручко Г.Ю., Меркулова Л.М., Москвичев Е.В., Кострова О.Ю., Михайлова М.Н., Мухаммад Захид, Бессонова К.В. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ТИМУСА ПОСЛЕ ПРИМЕНЕНИЯ ПОЛИОКСИДОНИЯ // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 5-1. – С. 197-202;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=29875 (дата обращения: 16.09.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252