Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,222

СИНАПТИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ТРАНСПЛАНТАТОВ НЕРВНОЙ ТКАНИ С МОЗГОМ ЖИВОТНОГО-РЕЦИПИЕНТА

Журавлева З.Н. 1 Журавлев Г.И. 2 Муганцева Е.А. 1
1 Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино
2 Институт биофизики клетки РАН, Пущино
Проведено электронно-микроскопическое исследование структурно-химических механизмов формирования синаптических связей между трансплантатом зубчатой извилины гиппокампа и неокортексом реципиента. Показано, что функциональная интеграция сопровождается пластической реорганизацией не только аксональных терминалей трансплантированных нейронов, но и нейрональных элементов мозга-реципиента, являющихся постсинаптическими мишенями. В этот процесс активно вовлекаются эндогенные нейропептиды и молекулы клеточной адгезии.
нейротрансплантация
ультраструктура
зубчатая извилина
нейропептидные ко-трансмиттеры
молекулы адгезии
1. Журавлева З.Н. Гиппокамп и нейротрансплантация // Журн. высш. нервн. деят. - 2004. - Т. 54, № 2. - С. 149-162.
2. Badylaka S.F., Nerem R.M. Progress in tissue engineering and regenerative medicine // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2010. - Vol. 107, № 8. - P. 3285-3286.
3. Bjorklund A., Lindvall O. Cell replacement therapies for central nervous system disorders // Nature Neurosci. - 2000. - Vol. 3. - P. 537-544.
4. Hamlyn L.H. The fine structure of the mossy fiber endings in the hippocampus of the rabbit // J. Anat. (Lond.). - 1962. - Vol. 96. - P. 112-120.
5. Henze D.A., Urban N.N., Barrionuevo G. The multifarious hippocampal mossy fiber pathway: a review // Neuroscience. - 2000. - Vol. 98, № 3. - P. 407-427.
6. Hökfelt T., Broberger C., Xu Z-Q.D., Sergeyev V., Ubink R., Diez M. Neuropeptides - an overview // Neurop- harm. - 2000. - Vol. 39. - P. 1337-1356.
7. Magavi S.S.P., Lois C. Transplanted neurons form both normal and ectopic projections in the adult brain // Development. Neurobiol. - 2008. Vol. 68. - P. 1527-1537.
8. Mizoguchi A., Nakanishi H., Kimura K., Matsubara K. et al. Nectin: an adhesion molecule involved in formation of synapses // J. Cell Biol. - 2002. Vol. 156, № 3. - P. 555-565.
9. Pierce J.P., Kurucz O.S., Milner T.A. Morphometry of a peptidergic transmitter system: dynorphin B-like immunoreactivity in the rat hippocampal mossy fiber pathway before and after seizures // Hippocampus. - 1999. - Vol. 9. - P. 255-276.
10. Tai C.Y., Kim S.A., Schuman E.M. Cadherins and synaptic plasticity // Curr. Opin. Cell Biol. - 2008. - Vol. 20. - P. 567-575.
11. Zhuravleva Z.N., Vinogradova O.S. Intracortical dentate fascia grafts: mossy fiber synapses in the host neocortex // J. Neural Transpl. Plast. - 1994. - Vol. 5, № 3. - P. 169-182.

В настоящее время трансплантация фетальной и эмбриональной нервной ткани используется для восстановления нарушенных функций мозга в результате нейродегенеративных заболеваний, инсультов и ишемии мозга [2, 3]. Незрелая трансплантированная ткань оказывает положительное влияние на поврежденный мозг благодаря содержанию биологически активных веществ и ростовых факторов. Однако для функциональной интеграции трансплантатов с мозгом реципиента необходимо формирование между ними реципрокных аксональных связей. Работы, выполненные в последние годы, показывают, что трансплантированные нейроны формируют в мозге реципиента как адекватные, так и эктопические проекции [1, 7]. Однако молекулярные и клеточные механизмы, которые контролируют процесс формирования синаптических функциональных контактов между трансплантированной незрелой нервной тканью и зрелыми нейронами мозга реципиента, не изучены. Наибольшую загадку представляет процесс взаимной адаптации пре- и постсинаптических нейронов при гетеротопической трансплантации. В настоящей работе были изучены адаптивные изменения в ультраструктуре и везикулярном составе гигантских синапсов зубчатой извилины гиппокампа при ее трансплантации в область неокортекса, с которым она в норме не взаимодействует. Нейромедиаторный состав гигантских синапсов хорошо известен. Основным трансмиттером в них является глутамат, содержащийся в малых светлых везикулах. Большие электронно-плотные пузырьки в этих синапсах хранят нейропептидные ко-трансмиттеры, главным образом динорфин и энкефалин [9]. Кроме мультимедиаторной системы нейропередачи гигантские синаптические окончания обладают специфическим набором молекул клеточной адгезии, которые формируют выраженные адгезионные соединения с поверхностью дендри- тов [5, 8].

Целью работы было выяснение структурных и нейрохимических механизмов, вовлекающихся в процесс функциональной интеграции гетеротопических трансплантатов зубчатой извилины гиппокампа с соматосенсорной областью неокортекса мозга реципиента.

Материал и методы исследования

Работа выполнена на крысах породы Вистар с соблюдением рекомендаций работы с животными, изложенными в Директивах Европейского Сообщества. Зубчатая извилина гиппокампа была выбрана в качестве донорской структуры для трансплантации, т.к. аксоны гранулярных нейронов, входящие в состав этой структуры, заканчиваются гигантскими синаптическими окончаниями, которые можно легко идентифицировать на ультраструктурном уровне. Они характеризуются большими размерами терминальных бутонов (до 5 мкм), интратерминальным способом формирования активных зон с дендритными шипиками и выраженными адгезивными соединения с поверхностью дендритных стволов [1, 4, 11]. Эмбриональную закладку зубчатой фасции выделяли из плодов 19-20 дней гестации; реципиентами служили девять половозрелых самцов. Для трансплантации производили трепанацию черепа над соматосенсорной областью неокортекса (координаты: AP = + 2,0; L = 5,5) и отсасывали небольшой объем ткани мозга, куда помещали кусочек эмбриональной закладки зубчатой извилины. Через 5 месяцев мозг животных фиксировали с помощью перфузии 2,5 %-м раствором глутарового альдегида. Затем из оперированного полушария выделяли трансплантат с прилежащей к нему областью неокортекса, а из противоположного - гиппокамповую формацию для контрольных исследований. Все процедуры с животными проводили под нембуталовым наркозом (40 мг/кг, внутрибрюшинно) и местной анестезией (2,0 %-й новокаин, подкожно). Далее кусочки мозга разрезали на тонкие пластины, дофиксировали осмиевой кислотой и обрабатывали для электронной микроскопии по стандартной методике. Ультратонкие срезы исследовали в электронном микроскопе JEM-100B (Япония). Фотопластины с микроизображениями гигантских синапсов, полученные в микроскопе, сканировали, сохраняли в виде компьютерных файлов и производили количественный и морфометрический анализ с помощью программы UTHSCSA Image Tool. Для этого использовали не менее 50 микроизображений синаптических окончаний из контрольной и экспериментальной групп. Проводили сравнительный количественный анализ везикулярного состава и степени выраженности адгезивных соединений в гигантских синапсах в норме и после трансплантации. Достоверность различий определяли по критерию Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

Трансплантаты, содержащие зрелые нервные и глиальные клетки, были обнаружены у всех экспериментальных животных. Электронная микроскопия показала, что все нейроны в трансплантатах имели хорошо дифференцированные дендритные и аксональные отростки, активно вступающие в синаптические взаимодействия друг с другом. Кроме того, гранулярные нейроны также проецировали свои аксоны в мозг реципиента. Между трансплантатами и мозгом животных-реципиентов наблюдались пучки аксонов и дендритов, которые в сопровождении астроцитарных отростков проникали в мозг реципиента. Среди них идентифицировались тонкие (около 0,1 мкм в диаметре) немиелинизированные аксоны, принадлежащие трансплантированным гранулярным клеткам зубчатой извилины.

В прилежащем к трансплантату неокортексе, благодаря уникальным ультраструктурным признакам, были идентифицированы гигантские окончания аксонов гранулярных нейронов. В мозге реципиента они контактировали с дендритами и дендритными шипиками нейронов соматосенсорной области. Такие синаптические окончания представляли собой химеры, в которых пресинаптические элементы принадлежали нейронам трансплантата, а постсинаптические элементы - нейронам животного-реципиента. Как и в норме, аксональные терминальные бутоны достигали 5-6 мкм в поперечнике, хотя некоторые их профили, обнаруженные в неокортексе, были по размерам несколько меньше. Как и в норме, они содержали два типа синаптических везикул: малые светлые везикулы и крупные нейропептидные гранулы. Эктопические гигантские синапсы гранулярных нейронов также воспроизводили два типа функциональных контактов с постсинаптическими нейронами: интратерминальные активные зоны с инвагинированными дендритными шипиками и адгезивные десмосомоподобные соединения с поверхностью дендритов. Около активных зон концентрировались синаптические везикулы, а около адгезивных соединений они всегда отсутствовали. В то же время рядом с адгезивными участками в пресинаптической части синапсов обычно присутствовали митохондрии, а в постсинаптической части - цистерны эндоплазматического ретикулума. Эктопические синаптические окончания имели морфологические признаки функционально зрелых контактов (рисунок).

При сравнении гигантских синапсов, сформированных на несвойственных им нейронных мишенях при трансплантации, с таковыми в контрольном гиппокампе выявились значительные различия в распределении больших гранулярных везикул. В норме они, как правило, были распределены равномерно по синаптоплазме, а в случаях примембранной локализации располагались вдали от синаптических активных зон. В экспериментальных условиях нейропептидные гранулы имели тенденцию скапливаться в области синаптических контактов. В эктопических гигантских синапсах по сравнению с нормой была также выявлена реорганизация адгезивных соединений. Даже визуальный электронно-микроскопический анализ показал, что они более многочисленны и осмиофильны. Часто симметричные адгезионные контакты наблюдались на стволах дендритов в местах ответвления дендритных шипиков. Иногда наблюдалась транслокация адгезионных соединений на ножки дендритных шипиков и даже их пространственное слияние с синаптическими активными зонами.

Гигантские синаптические окончания в неокортексе реципиента. Дендрит с отходящим от него дендритным шипиком расположен в нижней части фото: 1 - синаптические активные зоны; 2 - адгезивные контакты; 3 - большие пузырьки с электронноплотной гранулой, содержащие нейропептидные ко-трансмиттеры. Масштаб - 0,5 мкм

Количественное и морфометрическое исследование гигантских синапсов в норме и после трансплантации подтвердило ультраструктурные наблюдения о значительной реорганизации их важных структурных и нейрохимических составляющих. Полученные цифровые значения представлены в таблице.

Количественный анализ нейропептид-содержащих гранул (НПГ) и адгезивных контактов (АК) в гигантских окончаниях мшистых волокон в норме и после трансплантации, (M ± m)

Параметры

Контроль

Трансплантация

Доля НПГ от общего числа везикул в синаптической терминали, %

3,3 ± 0,6

5,8 ± 0,6 *

Число активных зон с НПГ

7,9 ± 1,6

62,3 ± 3,4 **

Среднее число АК в синапсе

1,7 ± 0,3

3,7 ± 0,4 **

Суммарная длина АК в синапсе, мкм

0,31 ± 0,08

0,71 ± 0,42 *

Отношение суммар­ной длины АК к длине аппозиции терминали к дендриту,  %

8,0 ± 3,0

29,0 ± 7,0 *

Примечание. Достоверность различий: * - p ≤ 0,01, ** - p ≤ 0,001 по сравнению с контролем для каждого параметра.

Результаты статистической обработки количественных данных показали достоверные различия всех использованных для сравнения параметров. Во-первых, в эктопических гигантских синапсах были выявлены изменения в нейромедиаторном составе синапсов. Обнаружено значительное увеличение (в 1,7 раз) числа нейропептидных грунул относительно общего числа синаптических везикул. При этом число синаптических активных зон, в состав которых входили большие гранулярные пузырьки, содержащие нейропептиды, возросло в 7,9 раз. Это свидетельствует о том, что при формировании аберрантных аксональных связей нейропептидные ко-трансмиттеры воздействуют непосредственно на постсинаптические рецепторы нейронов неокортекса или модифицируют их для контакта с чужеродными аксонами. Известно, что эндогенные нейропептиды синтезируются в телах нейронов, упаковываются в большие электронноплотные пузырьки и транспортируются в аксональные терминали. Они обычно освобождаются вдали от активных зон и ретроградно модулируют выброс основного медиатора глутамата. Как правило, нейропептиды оказывают тормозное воздействие и восстанавливают баланс между возбуждением и торможением. В ряде областей мозга крысы, в том числе, и в системе мшистых волокон гиппокампа, активация нейронов вызывает усиление секреции нейропептидов. Они вовлекаются в развитие долговременной посттетанической потенциации [6]. Модулирующая роль пептидной ко-трансмиссии в реорганизации нейро-нейрональных связей при регенерации мозга позвоночных животных показана нами впервые.

Во-вторых, по сравнению с мозгом in situ в гигантских синапсах после трансплантации было выявлено значительное увеличение количества и протяженности адгезионных контактов. Отношение зон адгезии к полной длине аппозиции терминали и дендрита превосходило в 3,6 раза (см. таблицу). Необходимо подчеркнуть, что концентрация молекул клеточной адгезии в постсинаптических областях не свойственна нейронам неокортекса в норме и, по-видимому, индуцирована пресинаптическими аксональными системами нейротрансплантатов. Полученные нами ранее [11] ультраструктурные свидетельства усиления локального синтеза метаболитов в постсинаптических дендритах и дендритных шипиках эктопических синапсов подтверждают такое предположение. Прежде адгезивным соединениям в гигантских синапсах гиппокампа приписывали исключительно механическую функцию, предназначенную для прикрепления терминали к дендриту [4]. С помощью современных методов молекулярной биологии идентифицирован их сложный нейрохимический состав. В организацию этих контактов входят кадгерин-катениновая и нектин-афадиновая адгезивные системы, а также синаптическая адгезионная молекула S-SCAM. Адгезивные системы играют ключевые роли в развитии и физиологии нервной системы. Они управляют эффективностью синаптической передачи, участвуют в морфогенезе дендритных шипиков, координируют сложные биохимические сигнальные процессы в пре- и постсинапсе [8, 10]. Указанные молекулярные соединения присутствуют и в других аксонных путях мозга, однако только в окончаниях аксонов гранулярных нейронов зубчатой извилины они сконцентрированы в специ­фические структурные конгломераты. Возможно, эти нейрохимические особенности определяют уникальные пластические свойства гранулярных клеток, позволяющие им встраиваться в уже существующие нейронные сети во время их генеза из клеток-предшественников в зрелом мозге.

Заключение

Таким образом, проведенное ультраструктурное исследование показало, что гетеротопически трансплантированная эмбриональная ткань зубчатой извилины гиппокампа крысы успешно интегрируется с помощью синаптических связей с мозгом взрослого животного-реципиента. При формировании синаптических взаимодействий между нейронами трансплантатов зубчатой извилины и нейронами соматосенсорной области неокортекса реципиента происходит взаимная структурно-химическая адаптивная реорганизация как пре-, так и постсинаптических отделов эктопических гигантских синапсов. В процессе образования и последующей стабилизации функциональных связей участвуют эндогенные нейропептиды и молекулы клеточной адгезии. Мы полагаем, что нейропептидные котрансмиттеры и адгезивные молекулы являются составной частью сложного молекулярно-клеточного механизма, координирующего установление аберрантных аксональных связей между трансплантатом и мозгом реципиента.

Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (грант № 09-04-01136).

Рецензенты:

  • Архипов В.И., д.б.н., ведущий научный сотрудник учреждения Российской академии «Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН», г. Пущино;
  • Кичигина В.Ф., д.б.н., зав. лабораторией ИТЭБ РАН учреждения Российской академии «Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН», г. Пущино.

Работа поступила в редакцию 30.06.2011.


Библиографическая ссылка

Журавлева З.Н., Журавлев Г.И., Муганцева Е.А. СИНАПТИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ТРАНСПЛАНТАТОВ НЕРВНОЙ ТКАНИ С МОЗГОМ ЖИВОТНОГО-РЕЦИПИЕНТА // Фундаментальные исследования. – 2011. – № 10-3. – С. 577-580;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=28920 (дата обращения: 18.02.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252