В связи с обострением экологических проблем и возрастанием антигенной нагрузки на организм человека, приводящей к структурно-функциональным нарушениям, особый интерес представляют изменения в иммунной системе при красном плоском лишае (КПЛ) слизистой оболочки полости рта (СОПР). Благодаря современным методам исследования удалось выявить закономерности развития лихеноидно-тканевой реакции при КПЛ, в основе которой лежат нарушения иммунитета, характеризующиеся как гиперчувствительность замедленного типа. В связи с этим коррекция иммунитета приобретает особое значение [1, 6].
К одному из подходов к иммунотерапии КПЛ СОПР можно отнести применение экзогенных интерферонов (реаферона, интерлока) и интерфероногенов (ридостина, неовира). Учитывая важную роль иммуногенетической составляющей в патогенезе КПЛ, перспективной представляется разработка комплексной схемы лечения данного заболевания с включением в нее, наряду с традиционными методами лечения, иммуномодуляторов, которые повышают функциональную активность иммунной системы. Перспективной и новой группой иммуномодулирующих препаратов являются индукторы интерферона, сочетающие антибактериальные, противовирусные и иммунокорригирующие свойства [2].
В последнее десятилетие особое внимание в патогенезе КПЛ исследователи уделяют проблеме состояния пролиферативной активности клеток эпителия. С помощью иммуногистохимического метода выявлены значительные различия в индексе меченых ядер у больных КПЛ и доказана связь повышенной экспрессии Ki-67 с прогрессированием заболевания [5]. Процессы пролиферации более выражены в эпителии очагов КПЛ СОПР по сравнению с нормальной слизистой оболочкой [7, 9, 10]. Изменения пролиферативной активности эпителия СОПР происходят, в том числе, и при других стоматологических заболеваниях, что отмечено в многочисленных работах отечественных и зарубежных авторов [3, 4, 8].
Анализируя данные литературы, мы нашли единичные сообщения, касающиеся иммуногистохимической характеристики пролиферирующих клеток воспалительного инфильтрата при КПЛ СОПР. Изучение уровня пролиферативной активности эпителиоцитов у больных КПЛ СОПР было проведено без учета степени тяжести воспалительного процесса [7, 9, 10]. Данных по определению пролиферативной активности по экспрессии антигена Ki-67 в эпителиоцитах слизистой оболочки щеки в зависимости от клинической формы КПЛ СОПР в отечественной литературе мы не встретили.
Цель исследования: сравнительное изучение пролиферативной активности эпителиоцитов по экспрессии антигена Ki-67 у больных КПЛ СОПР до и после лечения с включением в комплексную терапию иммуномодулятора.
Материал и методы исследования
Иммуногистохимическое исследование биоптатов очагов поражения слизистой оболочки щеки проводили у 23 больных (10 мужчин и 13 женщин - 43,5 и 56,5 % соответственно) с клиническими формами КПЛ СОПР: типичной (n = 12) и эрозивно-язвенной (n = 11). Длительность заболевания составила в среднем 1,8 ± 0,44 года. В качестве иммуномодулятора пациентам назначали препарат «Неовир» (натрия 10-метилен-карбоксилат-9-акридин), относящийся к группе низкомолекулярных синтетических индукторов интерферона (фармацевтическая фирма «АСГЛ - Исследовательские лаборатории», Санкт-Петербург). Контрольную группу составили 15 практически здоровых лиц без воспалительных поражений слизистой оболочки полости рта, из них 8 (53,3 %) мужчин и 7 (46,7 %) женщин.
Пролиферативную активность клеточных популяций в слизистой оболочке щеки оценивали в возрастной группе от 36 до 60 лет (зрелый возраст, второй период) с помощью иммуногистохимического метода (Ki-67 антиген), учитывая возрастные изменения слизистой оболочки полости рта.
Исследовали биоптаты слизистой оболочки щеки размерами 2,0×2,0 мм. У больных КПЛ иссечение фрагмента слизистой оболочки щеки производили из очагов поражения вблизи границы здоровой ткани. Процедуру биопсии осуществляли под местной анестезией (2 %-й раствор лидокаина). Для стандартизации обследования и исключения влияния циркадных ритмов на показатели пролиферации забор биоптатов осуществляли с 9 до 11 часов [4]. В качестве «здорового контроля» использовали биоптаты слизистой оболочки щеки пациентов без патоморфологических признаков в СОПР.
Для иммуногистохимического исследования образцы фиксировали в течение суток в 10 %-м растворе нейтрального формалина на фосфатном буфере pH 7,5, обрабатывали по общепринятым методикам с заливкой в гистовакс. На микротоме Leiсa изготавливали серийные срезы толщиной 5-6 мкм, которые монтировали на предметные стекла, обработанные 0,01 %-м раствором поли-l-лизина (Poly-l-Lyzine solution 0,01 %, Sigma USA). Демаскировку антигена осуществляли в 10 %-м растворе Epitope Retrieval Solution pH 6 (NovocastraTM) при температуре 95 °С на водяной бане в течение 30 мин.
Дальнейшее иммуногистохимическое окрашивание для выявления Ki-67 позитивных клеток проводили с помощью набора NovoLink (Polimer Detection System). В качестве первичных антител использовали RTU-Ki67-MM1 (NovocastraTM). Конечный продукт положительно окрашенных ядер визуализировали 3,3-диаминобензидинтетрахлори-дом (DAB), срезы докрашивали гематоксилином. В результате обработки препаратов выявлялись ядра пролиферирующих клеток, находившихся в S-фазе, в которой наблюдается максимальный синтез Ki-67. Подсчет индекса меченых ядер, отражающего уровень экспрессии антигена Ki-67, осуществляли в микроскопе Leiсa при увеличении 400. Индекс меченных Ki-67 ядер определяли после просмотра не менее 1500 ядер регенераторной зоны и выражали в процентах.
Статистическую обработку результатов осуществляли с вычислением среднего значения, ошибки среднего. Значимость различий определяли по критерию Стьюдента. Различия считали статистически достоверными, если достигнутый уровень значимости (р) не превышал принятого критического уровня значимости, равного 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
При КПЛ СОПР до начала лечения отмечались нарушения процессов ороговения, пролиферации и дифференцировки эпителиоцитов. Пролиферативный потенциал эпителиоцитов СОПР, если судить по экспрессии антигена Ki-67, качественно и количественно различался у пациентов контрольной группы (здоровые лица без патологогистологических признаков воспаления слизистой оболочки щеки) и больных КПЛ СОПР. Анализ результатов выявил достоверно более высокое содержание меченых Ki-67 клеток в эпителиальном пласте из очагов поражения слизистой оболочки щеки у больных КПЛ СОПР двух форм (типичной и эрозивно-язвенной) по сравнению с контрольной группой. Регистрировались индивидуальные отличия цитоархитектоники и регенераторного потенциала эрителиоцитов СОПР. В неизмененной слизистой оболочке положительно окрашенные Ki-67 ядра выявлялись только в базальных эпителиоцитах генеративного слоя с частотой 15,48 ± 0,41 %. У больных КПЛ СОПР индекс меченых клеток был достоверно в 2,9 раза выше и составлял 45,0 ± 1,0 % (р < 0,05). Следует отметить также «размывание» или расширение границ пролиферативного пула эпителиоцитов у больных КПЛ СОПР, то есть меченые клетки встречались в более высоких слоях, в частности, в шиповатом слое.
При сравнении типичной и эрозивно-язвенной форм КПЛ СОПР установлены существенные различия индекса меченых ядер. Наибольшая пролиферативная активность эпителиоцитов в очагах поражения слизистой оболочки щеки обнаружена у больных с эрозивно-язвенной формой (50,66 ± 1,34 %), при типичной форме КПЛ СОПР этот показатель был ниже (39,81 ± 1,17 %). Индексы меченых клеток при эрозивно-язвенной и типичной формах КПЛ были выше соответственно в 3,3 и 2,6 раза (р < 0,05),чем в контрольной группе (15,48 ± 0,41 %). Полученные данные позволяют заключить, что частота выявления Ki-67 положительно окрашенных ядер в эпителии слизистой оболочки щеки тесно связана с клинической формой КПЛ СОПР.
Сравнительный патоморфологический и иммуногистохимический анализ биоптатов слизистой оболочки щеки одних и тех же больных до и после традиционной терапии с использованием иммуномодулятора выявил положительную динамику морфологических изменений. Это, прежде всего, касалось количества и размеров инфильтратов в слизистой. Лимфоцитарная инфильтрация сохранялась в основном вокруг мелких сосудов, очаги свободнолежащих инфильтратов практически исчезли. Явления акантоза, гипер- и паракератоза также подверглись существенной регрессии. На фоне лечения традиционными методами без применения иммуномодулятора мы не наблюдали уменьшения выраженности гиперкератоза и паракератоза, сохранялась зернистость цитоплазмы клеток в верхних отделах шиповидного слоя эпителия, а также выраженная лимфоцитарная инфильтрация подэпителиальной зоны.
Анализ изменений индекса меченых Ki-67-ядер эпителиоцитов выявил выраженную тенденцию к нормализации пролиферативной активности у больных, получавших дополнительно к традиционной терапии иммуномодулятор: индекс пролиферации значительно снизился (в 2 раза) и составил 22,09 ± 1,05 %. Изменилась и локализация Ki-67 позитивных клеток - меченые эпителиоциты размещались только в двух первых рядах от базальной мембраны. Уменьшалось также количество пролиферирующих клеток в собственной пластинке слизистой оболочки. Эти данные позволяют заключить, что применение иммуномодулятора «Неовир» в комплексной терапии больных КПЛ СОПР приводит к уменьшению выраженности патоморфологических изменений СОПР и снижению пролиферативной активности эпителиоцитов в пораженных участках.
Заключение
Проведенное иммуногистохимическое исследование пролиферативной активности эпителиоцитов слизистой оболочки щеки выявило достоверное повышение процентного содержания Ki-67 положительно окрашенных ядер у больных КПЛ СОПР. Установлены различия в интенсивности мечения ядер эпителиоцитов Ki-67 в зависимости от клинической формы КПЛ СОПР: более высокий уровень экспрессии Ki-67 в эпителии очагов поражения слизистой оболочки щеки выявлен при эрозивно-язвенной форме заболевания.
Применение иммуномодулятора «Неовир» в комплексной терапии больных КПЛ СОПР приводит к снижению пролиферативной активности эпителиоцитов и, как следствие, уменьшению выраженности патоморфологических изменений в слизистой оболочке щеки.
Рецензенты:
-
Поляков Л.М., д.м.н., профессор, зав. лабораторией медицинской биотехнологии, зам. директора по научной работе НИИ биохимии Сибирского отделения РАМН, г. Новосибирск;
-
Любарский М.С., д.м.н., профессор, зав. отделом клинической морфологии, заместитель директора по научной работе НИИ клинической и экспериментальной лимфологии Сибирского отделения РАМН, г. Новосибирск.
Работа поступила в редакцию 21.09.2011.
Библиографическая ссылка
Загородняя Е.Б., Оскольский Г.И., Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М., Щеглов А.В. ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КРАСНОГО ПЛОСКОГО ЛИШАЯ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ПОЛОСТИ РТА // Фундаментальные исследования. – 2011. – № 10-3. – С. 495-497;URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=28899 (дата обращения: 20.04.2024).