Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,118

Терентьев А.А., Молдогазиева Н.Т.

В течение последнего десятилетия накоплены данные, свидетельствующие о наличии ряда важных общих свойств у онкофетальных белков, к которым принадлежит альфа-фетопротеин (АФП), и полипептидных факторов роста. В-первых, у этих двух групп негомологичных белков существует ряд общих структурных особенностей, например высокое содержание остатков цистеина, включая наличие сдвоенных цистеинов.

Во-вторых, факторы роста, как и АФП, способны регулировать пролиферацию, дифференцировку, миграцию и апоптоз эмбриональных и опухолевых клеток.

При сравнительном анализе первичных структур альфа-фетопротеина и факторов роста в составе АФП обнаружен структурный мотив, сходный с функционально важным участком эпидермального фактора роста (ЭФР) и, этот мотив характерен также для ряда других белков, содержащих ЭФР-подобные модули. Так, последовательности LDSYQCT в составе АФП (аминокислотные остатки, а.о. 14-20) и LDKYACN в составе ЭФР человека (а.о. 26-32) обладают 57% идентичности (табл.1). Последовательность LDKYACN в составе эпидермального фактора роста человека является важным компонентом основной β-складчатой структуры, входящей в состав петли В и содержит аминокислотные остатки (а.о.), принимающие участие в связывании с рецептором. Исходя из этого, можно предположить, что последовательность LDSYQCT в составе АФП также является частью его рецептор-связывающего участка.

ЭФР-подобные мотивы обнаружены также в составе других белков, принимающих участие в регуляции различных процессов во время эмбрионального развития и опухолевого роста. На этом основании сделано предположение о том, что ЭФР-подобные мотивы, возможно, ответственны за наличие общих функций АФП и факторов роста, и могут рассматриваться в качестве структурных маркеров белков, регулирующих пролиферацию, дифференцировку, миграцию и апоптоз эмбриональных и опухолевых клеток.

БЕЛКИ СЕМЕЙСТВА ЭФР И ИХ РЕЦЕПТОРЫ

Эпидермальный фактор роста синтезируется в виде большой молекулы предшественника, препро-ЭФР, состоящей из 1207 а.о., из которой образуется зрелая молекула (53 а.о.). Примечательно, что в состав предшественника входит восемь ЭФР-подобных мотивов и гидрофобный участок, расположенный у С-конца, благодаря которому он может существовать в виде гликозилированного мембранного белка.

Семейство эпидермального фактора роста, кроме самого ЭФР, включает TGF-α, амфирегулин, гепаринсвязывающий ЭФР-подобный фактор роста, бетацеллюлин, эпирегулин, томорегулин и различные изоформы неурегулинов (NRG-1, NRG-2, NRG-3 и NRG-4). Все члены этого суперсемейства обладают общностью строения, в именно состоят из 50-60 а.о. и содержат шесть остатков цистеина, образующих три внутримолекулярные дисульфидные связи. Интересно, что аналогичные мотивы содержатся в ряде мембранных белков, а также белках экстрацеллюлярного матрикса, которые участвуют в регуляции пролиферации, миграции и адгезии клеток, а также в белок-белковых взаимодействиях.

Дисульфидные связи формируют три петли: А, В и С, которые образуются благодаря дисульфидным мостикам между С6-С20, С14-С31 и С33-С42, соответственно (рис 2). Между петлями В и С находится шарнирный участок, образуемый в ЭФР человека аминокислотным остатком N32. С помощью ЯМР спектроскопии показано, что все представители семейства ЭФР имеют сходную пространственную структуру, представленную двумя частично перекрывающимися доменами: N-концевым (а.о. 1-35 в составе ЭФР), содержащим основную, трехцепочечную антипараллельную β-складчатую структуру, и С-концевым (а.о. 30-53), содержащим минорную β-складчатую структуру.

ЭФР осуществляет свое действие с участием мембранного рецептора (РЭФР), который принадлежит к семейству рецепторов ErbB. Это семейство у млекопитающих включает в себя четыре рецептора: ErbB1 (или РЭФР, HER1), ErbB2 (HER2/Neu), ErbB3 (HER3) и ErbB4 (HER4). Рецепторы данного семейства состоят из внеклеточного лиганд-связывающего домена, единственного гидрофобного трансмембранного домена и внутриклеточного домена, обладающего тирозинкиназной активностью (RТК - receptor tyrosine-kinase). Внеклеточный домен РЭФР человека состоит из 619 а.о. и подразделяется на четыре субдомена, обозначаемые I, II, III и IV.

Анализ кристаллической структуры комплекса ЭФР с его рецептором показывае, что в составе РЭФР можно выделить три участка взаимодействия с молекулой лиганда: участок 1 локализован в субдомене I рецептора, а участки 2 и 3 - в субдомене III. Петля B в составе ЭФР (а.о. 20-31) взаимодействуют с участком 1, петля А (а.о. 6-19) и R41 в составе ЭФР взаимодействуют с участком 2, а С-концевая часть и R45 молекулы ЭФР - с участком 3. При этом наиболее важными для взаимодействия оказываются следующие а.о. в составе ЭФР:

  1. в составе петли B - это М21, I23, L26 и А30, которые участвуют в гидрофобных взаимодействиях с участком 1 рецептора. Аминокислотный остаток N32 в составе ЭФР участвует в образовании водородных связей. Важность этих а.о. была подтверждена в экспериментах по мутагенезу ЭФР, показавших, что точечные замены этих а.о. приводят к уменьшению или потере связывающей способности.
  2. А.о. Н10, Y13 и L15 в составе петли А участвуют в образовании гидрофобных связей между ЭФР и участком 2 рецептора.
  3. Третью группу составляют а.о, входящие в состав С-концевого участка ЭФР: это L47, который участвует в образовании гидрофобных взаимодействий с а.о. участка 3 рецептора, и R41, Q43 и R45, которые, видимо, образуют водородные связи.

АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИН

Как и все секретируемые белки, АФП синтезируется в виде предшественника, из которого путем отщепления сигнального пептида и гликозилирования в ходе процессинга образуется зрелая молекула, полипептидная цепь которой состоит у человека из 591 а.о.. АФП является гликопротеидом с молекулярной массой около 69 кДа и содержанием углеводов до 3-5%. В настоящее время расшифрована первичная структура АФП одиннадцати биологических видов, в том числе, человека, шимпанзе, гориллы, лошади, собаки, свиньи, быка, сурка, мыши, крысы и курицы (базы данных Swiss-Prot/TrEMBL, GenBank). АФП относится к белкам, богатым остатками цистеина - они составляют 5,4% аминокислотных остатков в его составе, причем половина из них является сдвоенными цистеинами. Остатки цистеина, включая сдвоенные цистеины, характеризуются высокой степенью консервативности - они обнаруживаются в последовательностях всех белков семейства альбумина, к которому принадлежит АФП, и у всех биологических видов. Из 32 остатков цистеина, содержащихся в полипептидной цепи АФП, два первых остатка не участвуют в образовании дисульфидых связей, а остальные образуют 15 равномерно расположенных внутримолекулярных дисульфидных мостиков, образующих цистиновый каркас молекулы.

С использованием метода кругового дихроизма продемонстрировано, что вторичная структура АФП представлена, в основном, α-спиралью (до 65-67%) и не содержат β-складчатой структуры. Пространственная организация АФП была изучена методом электронной микроскопии, который продемонстрировал существование U-образной структуры с тремя областями плотности масс: одна на вершине и две по краям молекулы. Таким образом, была показана трехдоменная организация молекулы АФП. Домены I, II и III имеют сходную вторичную структуру и содержат 68, 55 и 71% α-спирали, соответственно, но отличаются параметрами третичной структуры. Домены I и III имеют жесткую, компактно упакованную третичную структуру и связаны между собой протеолитически лабильным, гибким доменом II. С-концевая часть домена II содержит шарнирный участок, который придает всем остальным доменам подвижность и, тем самым, может способствовать взаимодействию АФП с лигандами или с другими белками.

Способность альфа-фетопротеина стимулировать пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток, как эмбриональных, так и опухолевых, опосредуется рецепторами для альфа-фетопротеина, существующими на их поверхности. Однако, строение рецептора для АФП, а также механизмы его действия остаются до сих пор не изученными.

Интенсивные исследования, осуществляемые в течение последнего десятилетия с целью выяснения биологической роли АФП и выявления его функционально важных участков, показали, что альфа-фетопротеин является мультимодульным и полифункциональным белком. В составе АФП обнаружено более двадцати коротких аминокислотных последовательностей, сходных с функционально важными участками ряда физиологически активных белков, в том числе полипептидных факторов роста. Часть из этих последовательностей получена путем химического синтеза в виде отдельных пептидных фрагментов и изучена в различных тестах биологической активности. Локализация таких пептидных сегментов с экспериментально подтвержденной или только предполагаемой функциональной активностью в полипептидной цепи АФП позволила создать его структурно-функциональной карту.

Одним из этих функционально важных участков является гептапептид LDSYQCT, который является ЭФР-подобным мотивом АФП человека. Этот гептапептид был получен методом химического синтеза на твердой фазе и изучен в различных тестах биологической активности. Выяснилось, что синтетический пептид способен регулировать пролиферацию лимфоцитов периферический крови человека, активационный апоптоз клеток больных инфекционным миокардитом и бронхиальной астмой, а также обладает иммуномодулирующей способностью.

ОБНАРУЖЕНИЕ ЭФП-ПОДОБНЫХ МОТИВОВ

Как уже упоминалось ранее, в составе АФП обнаружен структурный мотив, сходный с участком петли В в составе ЭФР человека. Это последовательности LDSYQCT в составе АФП (а.о.14-20) и LDKYACN в составе ЭФР человека (а.о. 26-32), которые обладают 57% идентичности и 86% суммарного сходства (с учетом консервативных замен а.o.). Примечательно, что аналогичный мотив обнаружен также в составе томорегулина, а также трансформирующих факторов роста TGF-β1 и TGF-β2 человека (табл.1 и 2). Следовательно, в составе АФП и TGF-β, не относящихся к семейству ЭФР и не гомологичных факторам роста семейства ЭФР, обнаруживается ЭФР-подобный мотив, что указывает на существование структурных предпосылок для наличия общих функциональных свойств. Интересно также, что структурные мотивы, сходные с ЭФР-подобным мотивом АФП, но уже в инвертированном виде обнаруживаются в составе ряда белков семейства ЭФР. Это последовательности RCEHADL (а.о. 40-46) в составе TGF-α, RCERVDL (а.о. 40-46) в составе бетацеллюлина, PCRDKDL (а.о. 5-11) в составе NRG-3, а также RCQYRDL (а.о. 41-47) в составе самого ЭФР человека.

ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ЗНАЧЕНИЕ ЭФР-ПОДОБНЫХ МОТИВОВ

Как уже описывалось ранее, последовательность LDKYACN в составе ЭФР человека (а.о. 26-32) содержит аминокислотные остатки, участвующие в связывании с рецептором. Это L26, А30 и N32, образующие гидрофобные и водородные связи с рецептором. На основании сравнения ЭФР-подобных мотивов различных белков, можно сделать предположение о том, что аминокислотные остатки в их составах также могут участвовать во взаимодействии с рецептором. Так, сравнение последовательности LDSYQCT в составе АФП (а.о.14-20) с последовательностью LDKYACN в составе ЭФР человека (а.о. 26-32) показывает, что аминокислотным остаткам L26 и А30 соответствуют L14 и Q18 в составе АФП человека, которые также способны участвовать в гидрофобных взаимодействиях. А остатку N32 соответствует T20, гидроксильная группа которого также может участвовать в образовании водородных связей.

Четыре из семи а.о. инвертированного гептапептида RCQYRDL (а.о. 41-47) в составе ЭФР человека, а именно R41, Q43, R45, L47 участвуют во взаимодействии с рецептором. Если сравнивать эти две последовательности ЭФР человека (LDKYACN и RCQYRDL), то L47 соответствует L26, Q43 соответствует А30, а R41 - N32, и боковые цепи этих а.о. участвуют в образовании гидрофобных или водородных взаимодействий. Видимо, взаимодействие ЭФР с его рецептором осуществляется, в основном, без участия CO- и NH-групп остова полипептидной цепи, т.е. направление полипептидной цепи не имеет значения. В этом случае можно предполагать, что инвертированные последовательности, обнаруженные в составе других факторов роста семейства ЭФР, также могут принимать участие в связывании с рецептором.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, альфа-фетопротеин и факторы роста семейств ЭФР и TGF-β демонстрируют ряд сходных структурно-функциональных свойств, среди которых, в первую очередь, хотелось бы выделить наличие сходных пептидных мотивов, в том числе и в инвертированном виде. Наличие сходных пептидных мотивов создает структурные предпосылки для существования общих функциональных свойств у этих двух групп негомологичных белков. Можно предположить, что наличие ЭФР-подобных мотивов может служить структурным маркером участия белков в регуляции процессов пролиферации, дифференцировки, миграции и апоптоза как эмбриональных, так и опухолевых клеток.