Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,074

KINETIC MODELS FOR TESTING THE ANTIOXIDANT PROPERTIES EMOXIPINE, OSALMID AND PARACETAMOL

Perevozkina M.G. 1
1 State Agrarian University of Northern Trans-urals
Изучены особенности антиоксидантного действия эмоксипина, осалмида и парацетамола в процессе каталитического и инициированного окисления липидных субстратов. Показано, что соединения действуют по двум механизмам: реагируют с пероксильными радикалами с константой скорости реакции k7 = 0,61∙104 (М∙с)–1 (эмоксипин), k7 = 6,86∙104 (М∙с)–1 (осалмид) и k7 = 4,00∙104 (М∙с)–1 (парацетамол), а также разрушают гидропероксиды на 20–75 % с образованием молекулярных продуктов, снижают максимальную скорость окисления в 5–30 раз. Установлена высокая антиоксидантная активность парацетамола в безводной инициируемой среде и низкая в водно-липидной катализируемой среде. Показан идентичный механизм действия стационарного антиоксиданта дибунола при окислении липидных субстратов в растворе хлорбензола в присутствии 3∙10–3 М инициатора 2,2¢-азобисизобутиронитрила и водно-липидной системе в присутствии 2∙10–3 М хлорида меди (II), 1∙10–3 М цетилтриметиламмоний бромида. Рассчитана скорость инициирования в обеих системах, получены значения 4,2∙10–8 и 6,7∙10–5 М∙с–1 в безводной и водно-липидной среде соответственно. Показано, что скорость окисления модельных субстратов в водно-липидной среде в 1000 раз выше, чем в безводной среде. Установлено, что a-токоферол проявлял слабую антиоксидантную активность при каталитическом окислении водно-липидных субстратов.
The features of the antioxidant effect of emoxipine, osalmid and paracetamol in the catalytic and initiated oxidation of lipid substrates. It is shown that the compounds of the oxidation effect by two mechanisms: a peroxyl radicals react with the reaction rate constant k7 = 0,61∙104 (М∙s)–1 (emoxipine), k7 = 6,86∙104 (М∙s)–1 (osalmid) and k7 = 4,00∙104 (М∙s)–1 (paracetamol), as well as destroy hydroperoxides by 20–75 %, to form the molecular products reduce the maximum oxidation rate at 5–30 times. The high antioxidant activity of paracetamol in anhydrous initiated by the environment and low in the water-catalyzed lipid environment. Shown is identical to the mechanism of action of stationary antioxidant BHT oxidation of lipid substrates in a solution of chlorobenzene in the presence of 6∙10–3 М initiator of 2,2¢-azobisisobutyronitrile and the water-lipid system in the presence of 2∙10–3 М chloride copper (II), 1∙10–3 М cetyltrimethylammonium bromide. The calculated rate of initiation in both systems, the obtained values of 4,2∙10–8 and 6,7∙10–5 M∙s–1 in the dry and water-lipid environment, respectively. It is shown that the rate of oxidation of model substrates in the water-lipid environment to 1000 times higher than in an anhydrous environment. Found that a-tocopherol exhibits a weak antioxidant activity in the catalytic oxidation of water-lipid substrates.
antioxidants
a-tocopherol
BHT
emoxipine
osalmid
paracetamol
peroxide oxidation
antioxidant activity
1. Burlakova E.B., Krashakov S.A., Hrapova N.G. Kineticheskie osobennosti tokoferolov kak antioksidantov. Chernogolovka, 1992. 56 p.
2. Volchegorskij I.A., Tur E.V., Soljannikova O.V. i dr. Jeffektivnost› primenenija proizvodnyh 3-oksipiridina i jantarnoj kisloty v kompleksnom lechenii pervichnoj otkrytougol›noj glaukomy // Jeksperimental›naja i klinicheskaja farmakologija, 2012, Vol. 75, no. 7, pp. 20–26.
3. Golikov A.P., Ovchinnikov A.L., Polumiskov V.Ju. Antioksidant jemoksi¬pin: vlijanie na formirovanie ochaga nekroza i reparativnye processy pri infarkte miokarda // Kardiologija, 1990, no. 7, pp. 50–53.
4. Dorovskih V.A., Celujko S.S., Kodincev V.V. i dr. Jemoksipin v klinike i jeksperimente. – Blagoveshhensk: Izd. Polisfera, 2005. 110 p.
5. Mustafaeva M.N., Mizikov V.M. Paracetamol (Perfalgin) kak anal›geticheskaja sostavljajushhaja medikamentoznoj sedacii // Anesteziologija i reanimatologija, 2011, no. 2, pp. 23–26.
6. Perevozkina M.G. Kinetika kataliticheskogo okislenija micelljarnyh substratov v prisutstvii lekarstvennyh preparatov razlichnogo farmakologicheskogo dejstvija // Fundamental›nye issledovanija, 2014, no. 3 (1), pp. 68–75.
7. Perevozkina M.G. Modelirovanie processov okislenija lipidov biomembran v prisutstvii antioksidantov // Aktual›nye voprosy veterinarnoj biologii, 2014, no. 2 (22), pp. 10–22.
8. Perevozkina M.G. Testirovanie antioksidantnoj aktivnosti polifunkcional›nyh soedinenij kineticheskimi metodami: monografija. Novosibirsk: Izd. SibAK, 2014. 240 p.
9. Upnickij A.A. Principy diagnostiki i lechenija funkcional›nyh rasstrojstv zhelchnogo puzyrja i sfinktera Oddi // Spravochnik poliklinicheskogo vracha, 2012, no. 2, pp. 53–56.
10. Shljapintoh V.Ja., Kapuhin O.N., Postnikov L.M. i dr. Hemiljuminescentnye metody issledovanija medlennyh himicheskih processov. Moscow: Nauka, 1966. 300 p.

Настоящая работа продолжает серию наших экспериментов [6, 7], посвященных тестированию ингибиторов окисления различного химического строения кинетическими методами. На сегодняшний день известно большое количество природных (убихиноны, токоферолы, каротиноиды, флавоноиды) и синтетических антиоксидантов (АО), имеющих несколько активных функциональных групп и обладающих комбинированным действием. Многие из них применяются для стабилизации пищевых продуктов, фармацевтических и косметических препаратов, полимеров, топлива, смазочных масел. В медицине уделяется большое внимание антиоксидантотерапии как способу неспецифической коррекции широкого спектра заболеваний, сопровождающихся усилением свободнорадикального окисления липидов биомембран. Ведется целенаправленный поиск перспективных антиоксидантов из числа традиционных лекарственных препаратов с целью расширения спектра их фармакологического действия.

Цель исследования – тестирование антиоксидантной активности ряда лекарственных препаратов при различных способах инициирования в гомогенных и гетерогенных системах, в сравнении со стандартными антиоксидантами: дибунолом и a-токоферолом.

Материалы и методы исследования

Антиоксидантную активность (АОА) изучали волюмометрическим методом поглощения кислорода в модифицированной установке типа Варбурга при окислении этилолеата (ЭО) в присутствии 1∙10−3 М цетилтриметиламмоний бромида (ЦТМАБ) в качестве поверхностно-активного вещества (ПАВ), с добавками 2∙10−3 М хлорида меди (II) в пробе при t = (60 ± 0,2) °С, Wi = 6,7∙10-5 М∙с–1. Соотношение липидов и воды составляло 1:3, а общий объем пробы 4 мл. Разработанная нами кинетическая модель тестирования антиоксидантов, подбор концентраций катализатора и ПАВ описываются в работе [8]. Процесс окисления метилолеата (МО) в среде инертного растворителя хлорбензола инициировали за счет термического разложения 3∙10–3 М 2,2¢-азобисизобутиронитрила (АИБН) в пробе при t = (60 ± 0,2) °С, Wi = 4,2∙10-8 М∙с–1. В качестве критериев оценки антиоксидантных свойств соединений использовали – периоды индукции (t), начальные и максимальные скорости окисления (Wнач, Wmax). Антиоксидантную активность, количественно определяемую по формуле АОА = τi – τS/τS, где τS и τi – периоды индукции окисления субстрата в отсутствие и в присутствии исследуемого АО соответственно. Антирадикальную активность (АРА) соединений тестировали в системе инициированного окисления этилбензола хемилюминесцентным методом (ХЛ) по известной методике [10]. Окисление инициировалось АИБН при t = (60 ± 0,2) °С, Wi = 2,3∙10-8 М∙с–1 [8]. Кинетику накопления гидропероксидов изучали при аутоокислении линолевой кислоты (ЛК) методом обратного йодометрического титрования в среде хлорбензола, t = (60 ± 0,2) °С.

Результаты исследования и их обсуждение

В медицине парацетамол используется как противовоспалительное, жаропонижающее и обезболивающее средство, соединение ингибирует фермент циклооксигеназу, тормозит образование простагландинов, участвующих в механизме возникновения гиперальгезии и повышенной температуры [5]. Осалмид применяется как желчегонное средство [9]. Эмоксипин используется в офтальмологии как ретинопротектор, в последнее время применяется при лечении гипертонии и ишемической болезни сердца [2, 3, 4]. Формулы изучаемых соединений представлены в табл. 1.

Таблица 1

Химические формулы изучаемых антиоксидантов

Название АО

Формула

Парацетамол

(N-(4-гидроксифенил)ацетамид)

pic_9.tif

Осалмид

(N-(4¢-гидроксифенил)-2-гидроксибензамид)

pic_10.tif

Эмоксипин

(2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина гидрохлорид)

pic_11.tif

a-Токоферол

(6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметил-2-фитилхроман)

pic_12.tif

Дибунол

(2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол)

pic_13.tif

Методом хемилюминесценции в группе исследуемых соединений была оценена величина константы скорости реакции k7 фенолов с пероксильными радикалами [10]:

perevoz01.wmf

где InH – ингибитор окисления; In● – радикал ингибитора; perevoz02.wmf – пероксильный радикал. Стехиометрический фактор ингибирования f, показывающий количество свободных радикалов, реагирующих с молекулой ингибитора, для большинства изучаемых соединений был близок 2 (табл. 2).

Таблица 2

Значения константы скорости реакции антиоксидантов с пероксильными радикалами perevoz03.wmf, Wi = 2,3∙10-8 М∙с–1; САО = 1∙10–3 М; t = 60 °С

№ п/п

Название АО

K7∙104, М–1∙с–1

f

1

Парацетамол

4,00

2,4

2

Осалмид

6,86

2,4

3

Эмоксипин

0,61

2,0

4

a-Токоферол

360

2,0

5

Дибунол

1,40

2,0

При исследовании кинетики изменения интенсивности ХЛ в присутствии исследуемых соединений было установлено, что все АО оказывают ингибирующее действие на процесс окисления модельного субстрата. Показано, что наибольшую активность в реакции с пероксильными радикалами проявлял осалмид, константа скорости реакции k7 которого обусловлена акцепторным характером заместителя в пара-положении, наличием p-р-сопряжения между амидной группой и фенолом. АРА осалмида складывается из активности двух гидроксильных групп, в парацетамоле донорный заместитель содержится в пара-положении. В эмоксипине в положениях 2 и 4 по отношению к гидроксилу расположены донорные алкильные заместители. Сравнение констант скорости реакции k7 исследуемых соединений и a-токоферола показывает, что основной природный АО более активен в реакции с пероксильными радикалами ~ в 360 раз.

Для доказательства механизма действия антиоксидантов изучали кинетику окисления липидного субстрата при различных условиях инициирования процесса. Кинетику окисления соединений в условиях каталитического окисления этилолеата изучали в широком диапазоне концентраций (1∙10–6–1∙10–1 М). Осалмид проявлял высокую антиоксидантную активность по сравнению с парацетамолом и эмоксипином в соизмеримых концентрациях. На рис. 1 показаны типичные кинетические кривые (КК) окисления этилолеата в водно-липидной среде в присутствии осалмида. Установлено, что все исследуемые концентрации осалмида уменьшали начальную и максимальную скорости окисления в 2–5 раз по сравнению с контролем (табл. 3). Кинетические кривые окисления этилолеата с добавками парацетамола представлены на рис. 2. В изученном диапазоне концентраций парацетамола наблюдалось отсутствие периода полного торможения, но отмечалось снижение начальной и максимальной скоростей окисления по сравнению с контролем в 3–5 раз (табл. 3). Такой характер КК для парацетамола предполагает подавление антиоксидантных свойств фенольного гидроксила за счет образования хелатных комплексов с катионами меди (II) и проявление ингибирующего эффекта только за счет амидной группы.

pic_14.wmf

Рис. 1. Кинетика окисления этилолеата в водно-липидной среде в присутствии добавок осалмида, М: 1 – контроль; 2 – 1∙10–4; 3 – 5∙10–4; 4 – 1∙10–3; 5 – 1∙10–2; 2∙10−3 М CuCl2; 1∙10−3 М ЦТМАБ; t = 60 °С

Таблица 3

Кинетические параметры окисления этилолеата в водно-липидной среде в присутствии 2∙10−3 М CuCl2 в зависимости от концентрации АО, Wi = 6,7∙10-5 М∙с–1, t = 60 °С

С(АО), М

τi, мин

Wнач∙10–5, М∙с–1

Wmax∙10–5, М∙с–1

Wmax ЭO/Wmax AO

Контроль ЭО

15

7,5

14,0

Парацетамол

5∙10–5

15

7,3

13,7

1,0

1∙10-4

20

6,2

10,0

1,4

5∙10–4

30

4,7

4,0

3,5

1∙10−3

40

2,5

3,1

4,5

5∙10−3

40

2,2

2,6

5,4

1∙10−2

45

2,0

2,4

5,8

Осалмид

5∙10–5

25

5,1

10,0

1,4

1∙10-4

45

2,9

4,4

3,2

5∙10–4

215

1,4

4,2

3,3

1∙10−3

350

0,6

2,7

5,2

5∙10−3

425

0,5

2,5

5,6

1∙10−2

500

0,4

2,5

5,6

Эмоксипин

5∙10–5

30

3,4

5,1

2,7

1∙10-4

40

2,1

4,3

3,3

5∙10-4

45

1,5

3,7

3,8

1∙10−3

55

1,0

3,5

4,0

5∙10−3

70

0,8

3,2

4,4

1∙10−2

90

0,7

2,6

5,4

a-Токоферол

1∙10–5

30

4,3

8,8

1,6

5∙10–5

35

4,1

8,2

1,7

1∙10–4

40

3,8

7,4

1,9

5∙10-4

70

3,0

7,9

1,8

1∙10−3

45

4,3

16,8

0,8

Дибунол

1∙10–5

65

7,0

12,3

1,1

5∙10–5

110

2,6

9,3

1,5

1∙10–4

140

2,1

8,7

1,6

5∙10–4

360

1,3

8,4

1,7

1∙10−3

600

1,0

8,0

1,8

На рис. 3 показано, что при всех концентрациях эмоксипин тормозит начальные и максимальные скорости окисления. В присутствии эмоксипина наблюдаются периоды индукции и периоды аутоускорения. Вероятно, в этих условиях лимитирующей является реакция разрушения эмоксипином гидропероксидов по молекулярному механизму. Зависимости периодов индукции от концентрации эмоксипина приведены в табл. 3.

Показано, что в водно-липидной среде дибунол проявлял себя как сильный ингибитор: наблюдался период полного торможения, период аутоускорения и достижение максимальной скорости окисления. Периоды индукции увеличивались пропорционально увеличению концентрации дибунола (табл. 3). По наклону прямой в координатах t,[InH] была рассчитана скорость инициирования в обеих системах, получены значения 4,2∙10–8 и 6,7∙10–5 М∙с–1 в безводной и водно-липидной среде соответственно. Максимальные скорости окисления липидов в гомогенной и гетерогенной системах были равны 8,0∙10–7 и 1,4∙10–4 М∙с–1 соответственно.

pic_15.wmf

Рис. 2. Кинетика окисления этилолеата в водно-липидной среде в присутствии добавок парацетамола, М: 1 – контроль; 2 – 1∙10–4; 3 – 1∙10–3; 4 – 1∙10–2; 2∙10−3 М CuCl2; 1∙10−3 М ЦТМАБ, t = 60 °С

pic_16.wmf

Рис. 3. Кинетика окисления этилолеата в водно-липидной среде в присутствии добавок эмоксипина, М: 1 – контроль; 2 – 1∙10–6; 3 – 5∙10–5; 4 – 1∙10–4; 5 – 5∙10–4; 6 – 1∙10–3; 7– 5∙10–3; 8 – 1∙10–2; 2∙10−3 М CuCl2, 1∙10−3 М ЦТМАБ, t = 60 °С

Анализ кинетических кривых окисления этилолеата с добавками АО показал существенные отличия механизма действия a-токоферола от дибунола в зависимости от концентраций. С увеличением концентрации a-токоферола наблюдалась инверсия антиоксидантного действия (табл. 3), при этом увеличивалась максимальная скорость окисления. Причиной ускорения процесса могло быть комплексообразование OH-группы a-токоферола с катионами меди (II). В процессе окисления a-токоферол образует достаточно активные токофероксильные радикалы (In·) [1], способные участвовать в побочных реакциях продолжения цепей с молекулами субстрата.

Установлено, что a-токоферол имеет экстремальную зависимость периодов индукции от концентрации с максимумом в 5∙10–4 М. Для осалмида и эмоксипина периоды индукции возрастали с увеличением концентрации соединения, периоды индукции парацетамола возрастали до 1∙10–3 М и в дальнейшем практически не изменялись (табл. 3).

Ингибирующее действие указанных соединений тестировали в широком диапазоне концентраций (1∙10–5–1,5∙10–3 М) в условиях инициированного окисления метилолеата в среде хлорбензола. Исследуемые АО увеличивали периоды индукции в процессе окисления модельного субстрата. Для осалмида, парацетамола, эмоксипина и дибунола наблюдалась линейная зависимость между периодом индукции и концентрацией. Действие a-токоферола в изучаемом диапазоне концентраций описывалось также линейной зависимостью (рис. 4).

pic_17.wmf

Рис. 4. Зависимость периодов индукции от концентрации АО: 1 – парацетамол; 2 – дибунол; 3 – a-токоферол; 4 – осалмид; 5 – эмоксипин; субстрат окисления МО, Wi = 4,2∙10–8 М∙c–1, t = 60 °С

Таблица 4

Кинетические параметры окисления МО в присутствии различных концентраций исследуемых АО, Wi = 4,2∙10–8 М∙c–1, t = 60 °С

С(АО)∙10–4, М

tинд, мин

Wнач∙10–7, M∙c–1

Wmax∙10–7, M∙c–1

Wмак. MO/Wмак. AO

АОА = τi –τS/τS

Метилолеат (контроль)

0

26

1,90

8,00

Парацетамол

2

220

0,57

1,30

6,2

8,5

4

425

0,50

1,16

6,9

16,3

6

625

0,31

0,66

12,1

24,0

8

820

0,21

0,30

26,7

31,5

10

1030

0,20

0,28

28,6

39,6

Осалмид

2

110

1,06

2,19

3,7

4,2

4

200

0,76

1,98

4,0

7,7

6

300

0,62

1,30

6,2

11,5

8

410

0,46

1,18

6,8

15,8

10

500

0,37

1,12

7,1

19,2

Эмоксипин

2

45

1,81

7,12

1,1

1,7

4

65

1,74

5,81

1,4

2,5

6

110

1,62

4,30

1,9

4,2

8

160

1,53

4,03

2,0

6,2

10

180

1,51

3,91

2,1

6,9

a-Токоферол

2

160

0,78

6,51

1,2

6,2

4

280

0,76

6,42

1,2

10,8

6

400

0,77

6,50

1,2

15,4

8

500

0,76

6,34

1,2

19,2

10

600

0,76

6,42

1,2

23,1

Дибунол

2

190

0,68

6,32

1,3

7,3

4

380

0,69

6,21

1,3

14,6

6

570

0,67

6,40

1,3

21,9

8

750

0,68

6,12

1,3

28,9

10

950

0,69

6,30

1,3

36,5

В работе была проанализирована закономерность изменения начальной (Wo2нач) и максимальной (Wo2max) скорости окисления в присутствии различных концентраций изучаемых АО. Установлено, что указанные кинетические параметры практически не изменялись с ростом концентрации дибунола и α-токоферола, но существенно уменьшались при введении других АО (табл. 3, 4). По всей вероятности, выявленная закономерность связана с участием АО в реакциях нерадикального разрушения гидропероксидов.

pic_18.wmf

Рис. 5. Кинетика накопления гидропероксидов при аутоокислении линолевой кислоты в присутствии равных концентраций АО: 1 – контроль; 2 – эмоксипин; 3 – осалмид; 4 – парацетамол. Стрелкой показан ввод АО. С(АО) = 2∙10–4 M, t = 60 °C

 

Были проведены эксперименты по прямому тестированию кинетики накопления гидропероксидов после введения в частично окисленный липидный субстрат каждого из исследуемых АО. Из рис. 5 видно, что после ввода АО в течение первого часа наблюдалось снижение концентрации гидропероксидов практически до исходного уровня. Установлено, что АО способствовали разрушению гидропероксидов на 20–75 %.

Выводы

1. Получен ряд уменьшения константы скорости реакции k7 соединений с пероксильными радикалами: 3,60∙106 М–1∙с–1 (a-токоферол) > 6,86∙104 М–1∙с–1 (осалмид) > 4,00∙104 М–1∙с–1 (парацетамол) > 1,40∙104 М–1∙с–1 (дибунол) > 0,61∙104 М–1∙с–1 (эмоксипин).

2. Установлено, что осалмид и парацетамол в процессе окисления способны как эффективно уничтожать пероксильные радикалы, так и разрушать гидропероксиды молекулярным путем. Вероятно, что антирадикальная активность ингибиторов обусловлена присутствием в их химической структуре фенольного гидроксила, а способность разрушения гидропероксидов связана с наличием амидной группы.

3. Показан идентичный механизм действия стационарного антиоксиданта дибунола при инициированном окислении безводных и катализируемых водно-липидных субстратов.

4. Установлена слабая антиоксидантная активность a-токоферола при каталитическом окислении водно-липидных субстратов.

5. Установлена высокая антиоксидантная активность парацетамола в безводной инициируемой среде и низкая в водно-липидной катализируемой среде.

6. С целью расширения спектра фармакологического действия изучаемых соединений были получены патенты на изобретение (осалмид, парацетамол).

Рецензенты:

Ерёмин Д.И., д.б.н., профессор кафедры почвоведения и агрохимии, ФГБОУ ВПО «Государственный аграрный университет Северного Зауралья», г. Тюмень;

Грехова И.В., д.б.н., профессор кафедры общей химии, ФГБОУ ВПО «Государственный аграрный университет Северного Зауралья», г. Тюмень.

Работа поступила в редакцию 06.02.2015.