Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,222

GENETIC POLYMORPHISM OF MOLECULES CHARACTERIZED BY ENDOTHELIAL DYSFUNCTION FORMATION SEVERE AND COMPLICATED FORMS OF INFLUENZA IN CHILDREN

Miromanova N.A. 1 Miromanov A.M. 1
1 Chita State Medical Academy
Представлены результаты исследования встречаемости генотипов полиморфного маркера гена эндотелина-1 (EDN1 Lys198Asn) и синтазы окиси азота (NOS3 C786T) у детей при гриппe. Установлено, что распространенность генотипов полиморфных молекул гена NOS3 С786Т и EDN1 Lys198Asn у детей при сезонном гриппе, а также легком и среднетяжелом течении пандемического гриппа не отличается от здоровых. Генотип Т/Т полиморфизма гена NOS3 (С786Т) и Asn-аллель гена EDN1 Lys198Asn ассоциированы с тяжелым течением гриппа А H1N1pdm09. Генотип С/Т полиморфизма гена NOS3 (С786Т) ассоциируется с более легким течением гриппа А H1N1pdm09 и может быть расценен как фактор защиты. Тяжелое течение пневмонии при гриппе А H1N1pdm09 ассоциировано с аллелем Asn гена EDN1 Lys198Asn и аллелем Т гена NOS3 (С786Т).
Results of research of occurrence of genotypes of a polymorphic marker of a gene endothelin-1 (EDN1 Lys198Asn) and NO-synthase (NOS3 C786T) at children are presented of influenza. It is established, that prevalence of genotypes of polymorphic molecules of gene NOS3 С786Т and EDN1 Lys198Asn at children at a seasonal influenza, and also a lung and midcriticall a current of a pandemic influenza does not differ from the healthy. Genotype Т/Т of polymorphism of gene NOS3 (С786Т) and an Asn-allele of gene EDN1 Lys198Asn associates with a serious current of a influenza А H1N1pdm09. Genotype С/Т of polymorphism of gene NOS3 (С786Т) associates with easier current of influenza А H1N1pdm09and can be regarded as the protection factor. A serious current of a pneumonia at influenza А H1N1pdm09 associates with allele Asn gene EDN1 Lys198Asn and allele Т gene NOS3 (С786Т).
influenza
pneumonia
NO-synthase
endothelin
polymorphism
children
1. Community-acquired pneumonia in children: prevalence, diagnosis, treatment and prevention. Chuchalin A.G. Moscow: Camera-ready, 2011. 64 p.
2. Kostrjukova E.S., Zakharzhevskaya N.B., Kostin P.A., Ilina E.N., Larin A.K., Gribanov O.G., Selezneva O.V., Prikhodko E.A., Akopian T.A., Generozov E.V., Lazarev V.N., Levitsky S.A., Kondrashov I.G., Alekseev D.G., Bazaleev N.A., Klimov E.A., Esaulova M.R., Yushchuk N.D., Gabby V.M., Syarheenka V.I. Therapeutic Archives, 2012, no. 3, pp. 48–54.
3. Kuznik B.I. Cellular and molecular mechanisms of regulation of the hemostatic system in health and disease. Chita: Express Publishing, 2010. 832 p.
4. Gorbunov V.V., Lukyanov S.A., Govorin A.V., Romanova E.N., Gergesova E.E., Gorbunova T.V. [electronic resource]. Transbaikalia Medical Gazette, 2011, no. 2, pp. 104–111. – Mode of access: http://medacadem.chita.ru/zmv (date accessed: Aug.2. 2011).
5. Ratnikova L.I., Kartopolova E.V. Infectious Diseases, 2012, no. 4, pp. 27–30.
6. Romanova E.N., Govorin A.V. Therapeutic Archives, 2013, no. 3, pp. 58–62.
7. Diagnosis, treatment and prevention of influenza and acute respiratory infections in children. Uchaikin V.F. Moscow, 2001. 16 p.
8. Bradley J.S. Clinical Infectious Diseases, 2011, pp. 1–5.
9. Bachmann S., Mundel P. American Journal of Kidney Diseases, 1994, no. 24, pp. 112–129.
10. Sobrier F. Hupertension, 1999, no. 33, рр. 924–926.
11. Marco K.C., Braga G.U., Barbosa F. Journal of Toxicology and Environmental Health-part A-current Issues, 2011, no. 74 (20), рр. 1323–1333.

Одними из хорошо изученных маркеров, характеризующих дисфункцию эндотелия, являются оксид азота и эндотелин. В норме уровень эндотелина чрезвычайно низкий, однако под воздействием различных факторов (гипоксия, ишемия, стресс) стимулируется его синтез. Известно, что эндотелин оказывает мощное вазоконстрикторное действие, может способствовать внутрисосудистому свертыванию крови [3]. Регуляторное действие оксида азота (NO) в организме обеспечивается его генерацией из L-аргинина, катализируемой изоформами NO-синтаз (NOS) [10]. Показано, что физиологические концентрации NO играют важную роль в регуляции функций иммунной системы, эндотелия сосудов, нейротрансмиссии, поддержании гемостаза. В то же время недостаток, как и избыток NO может вызывать ряд патологических состояний (тромбообразование, ишемию органов, дисбаланс регуляторных систем) [9]. Представляется вероятным, что активность определенных изоформ NOS, являющихся продуктами экспрессии соответствующих генов (NOS1-3), может обеспечивать различную концентрацию NO в организме и таким образом определять его функцию как физиологического регулятора либо как токсического агента. Так, в ряде работ продемонстрировано уменьшение концентрации NO в кровеносном русле у носителей полиморфного участка 786С гена eNOS [11]. Кроме того, и изменение концентрации эндотелина у пациентов с мутациями в соответствующем гене может стать значимым в развитии и усугублении дисфункции эндотелия. К настоящему времени роль дисфункции эндотелия продемонстрирована в патогенезе гриппа А H1N1pdm09 у взрослого контингента населения, в том числе и в случае формирования вторичной вирусно-бактериальной пневмонии с развитием синдрома острого повреждения легких [4, 5]. Имеются единичные работы и по изучению генетического полиморфизма молекул, характеризующих дисфункцию эндотелия при пневмонии у взрослых в сезон эпидемиологического неблагополучия по гриппу 2009–2010 гг. [2, 6]. Однако подобные исследования не затронули детского населения. В связи с чем представляется актуальным поиск генетических критериев, характеризующих дисфункцию эндотелия при гриппе у детей с целью прогнозирования тяжести течения инфекции и формирования осложнений.

Цель исследования – изучить частоту встречаемости генотипов полиморфного маркера гена эндотелина-1 (EDN1 Lys198Asn) и синтазы окиси азота (NOS3 C786T) у детей с неосложненным гриппом и при осложненном его течении пневмонией.

Материалы и методы исследования

В исследование включен 201 ребенок с гриппом АH1N1pdm09, рандомизированный в две группы: первую группу составили 114 детей с неосложненным гриппом. Для определения тяжести течения гриппа А H1N1pdm09 пользовались общепринятой классификацией гриппа [7]. Группу сравнения для этой группы составили 27 детей с сезонным гриппом A H3N2 в постэпидемический период. 87 детей с развившейся внебольничной вторичной вирусно-бактериальной пневмонией на фоне пандемического гриппа объединены во вторую группу. Диагноз внебольничной пневмонии устанавливался на основании достоверных критериев, предложенных А.Г. Чучалиным и соавт. [1]. В качестве критериев тяжести внебольничной пневмонии у детей использовали модифицированную шкалу тяжелых внебольничных пневмоний у взрослых (2007) [8]. Группу сравнения для второй клинической группы составили 50 детей с внебольничной пневмонией в постэпидемический по гриппу период. Дети с атипичной этиологией внебольничной пневмонии (микоплазменная, хламидийная) из данной группы исключались.

Диагноз гриппа А H1N1pdm09 устанавливался на основании эпидемиологического анамнеза, комплекса характерных клинических симптомов и верифицировался путем обнаружения РНК вируса в назофарингеальных мазках методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и/или с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА) в парных сыворотках с нарастанием титра антител. Сезонный грипп устанавливался на основании идентификации РНК вируса гриппа A H3N2 в назофарингеальных мазках.

Распределение исследуемых по группам, полу и возрасту представлено в табл. 1.

Таблица 1

Распределение больных по группам, полу и возрасту

Группы обследуемых

n

Возраст, мес. (M ± m)

Пол (абс.ч./ %)

Мальчики

Девочки

I клиническая группа

114

 

63 (72,4 %)

51 (27,6 %)

Грипп А H1N1pdm09 легкой степени тяжести

40

38,5 ± 8,7

27 (67,5 %)

13(32,5 %)

Грипп А H1N1pdm09 средней степени тяжести

56

56,5 ± 8,7

29 (51,8 %)

27 (48,2 %)

Грипп А H1N1pdm09 тяжелой степени тяжести

18

59,3 ± 8,2

7 (38,9 %)

11 (61,1 %)

Группа сравнения (сезонный грипп)

27

45,6 ± 5,5

12 (44,5 %)

15 (55,5 %)

II клиническая группа

87

 

53 (60,9 %)

34 (39,1 %)

Нетяжелая пневмония как осложнение гриппа А H1N1pdm09

67

19,98 ± 1,6

43 (64,2 %)

24 (35,8 %)

Тяжелая пневмония как осложнение гриппа А H1N1pdm09

20

21,35 ± 4,8

10 (50 %)

10 (50 %)

Группа сравнения (внебольничная пневмония), из них:

– пневмония нетяжелая

– пневмония тяжелая

50

35

15

21,6 ± 3,1

19,73 ± 3,6

21(60 %)

9 (60 %)

14 (40 %)

6 (40 %)

В качестве контрольной группы для оценки распределения генотипов исследуемых полиморфизмов в популяции обследовано 200 здоровых детей, сопоставимых по полу и возрасту с основной группой.

Материалом для молекулярно-генетического анализа служили образцы ДНК, выделенные из периферической венозной крови. Для исследования выбрана точка мутации эндотелина-1 (EDN1) в позиции 198 (Lys > Asn) и эндотелиальной синтазы окиси азота (NOS3) в позиции 786 (C > T). Амплификацию проводили в термоцикле (модель Ре «Бис» – М111 (ООО «Бис-Н», Новосибирск). В работе использовались стандартные наборы праймеров НПФ «Литех»-«SNP» (Москва). Визуализация продуктов амплификации выполнена с помощью электрофореза в 3 % агарозном геле с добавлением бромистого этидия, проходящем в ультрафиолетовом свете.

Полученные данные подвергали статистической обработке с помощью программы «BIOSTAT». При сравнении частот и групп по качественному бинарному признаку пользовались критерием χ2. Различия считались статистически значимыми при p < 0,05. Для определения частот аллельных вариантов генов применялся закон Харди – Вайнберга. С целью оценки ассоциаций аллелей с генотипом рассчитывали относительный риск (ОР) и отношение шансов (ОШ).

Результаты исследования и их обсуждение

Распределение распространенности генотипов полиморфного локуса С786Т гена NOS3 и Lys198Asn гена EDN1 в группе больных с различным течением гриппа и контрольной группе соответствовало ожидаемому равновесию Харди – Вайнберга.

По данным распределения распространенности генотипов гена NOS3 С786Т у больных с различным течением гриппа получены достоверные различия с группой здоровых лиц (табл. 2).

Таблица 2

Распределение генотипов и частоты аллельных вариантов NOS3 (C786T) среди больных с гриппом

Группа

Генотип, %

Аллель, р

C/C

C/T

T/T

С

Т

Контроль, n = 200

106 (53 %)

92 (46 %)

2 (1 %)

0,76

0,24

Сезонный грипп, n = 27

10 (37 %)

16 (59 %)

1 (4 %)

0,67

0,33

Грипп А H1N1pdm09 легкой степени, n = 40

15 (37,5 %)

24 (60 %)

1 (2,5 %)

0,67

0,33

Грипп А H1N1pdm09 средней степени, n = 56

20 (36 %)

35 (62 %)

1 (2 %)

0,67

0,33

Грипп А H1N1pdm09 тяжелой степени, n = 18

11 (61 %)*/**

4 (22 %)*/**

3 (17 %)*/**

0,72

0,28

Нетяжелая пневмония как осложнение гриппа А H1N1pdm09, n = 67

32 (48 %)*

31 (46 %)

4 (6 %)*

0,7

0,3

Тяжелая пневмония как осложнение гриппа А H1N1pdm09, n = 20

10 (50 %)*/**

6 (30 %)*/**

4 (20 %)*/**

0,6*/**

0,4*/**

Нетяжелая пневмония группы сравнения, n = 35

21 (60 %)

14 (40 %)

0,8

0,2

Тяжелая пневмония группы сравнения, n = 15

9 (60 %)

5 (33,3 %)

1 (6,7 %)

0,77

0,23

Примечания: * – статистическая значимость различий с контролем; ** – статистическая значимость различий с группой клинического сравнения.

При этом отмечено, что данные различия затрагивают группу пациентов с тяжелым течением гриппа А H1N1pdm09 и в случае развития пневмонии, ассоциированной с этим вирусом. Так, частота генотипа С/С, С/Т и Т/Т у больных с гриппом A H3N2, а также у детей с легким и среднетяжелым течением пандемического гриппа не отличалась от группы контроля (соответственно р = 0,184, р = 0,17, р = 0,071). Кроме того, у детей с легким и среднетяжелым проявлением инфекции гриппа А H1N1pdm09 частота выявляемой распространенности различных генотипов полиморфного варианта гена NOS3 была сопоставима с таковой у пациентов при сезонном гриппе (р = 0,96, р = 0,853). Тяжелое течение гриппа А H1N1pdm09 сопровождалось достоверно частым обнаружением генотипа С/С и генотипа Т/Т полиморфного локуса С786Т гена NOS3 не только в сравнении с группой здоровых лиц, но и больных с сезонным гриппом (р = 0,0001), а также пациентов с легким и среднетяжелым течением пандемического гриппа (р = 0,003). Частота генотипов С/С и Т/Т отличалась от группы контроля только у больных с пневмонией в сезон циркуляции вируса гриппа А H1N1pdm09 как при тяжелом, так и нетяжелом ее течении (р = 0,05, р = 0,0001 соответственно). Частота генотипа С/Т отличалась от здоровых лиц только при тяжелом течении пневмонии при гриппе А H1N1pdm09 (р = 0,0001). Тяжелая пневмония у детей в период циркуляции гриппа характеризовалась достоверно частым обнаружением генотипа Т/Т в сравнении не только с группой контроля, но и группой сравнения (р = 0,0001). В то же время статистически значимые различия распределения генотипов NOS3 (C786T) при различном течении пневмонии при гриппе нами не выявлены. Частота генотипа С/Т отличалась от здоровых лиц только при тяжелом течении пневмонии при гриппе А H1N1pdm09 (р = 0,0001). Тяжелая пневмония у детей в период циркуляции гриппа характеризовалась достоверно частым обнаружением генотипа Т/Т в сравнении не только с группой контроля, но и группой сравнения (р = 0,0001). В то же время статистически значимые различия распределения генотипов NOS3 (C786T) при различном течении пневмонии при гриппе нами не выявлены.

При сравнении частоты аллельных вариантов гена NOS3 С786Т в группе обследуемых как с пандемическим гриппом, так и сезонным статистически значимая разница от группы контроля не выявлена, а в случае развития пневмонии данные отличия касались только тяжелого течения пневмонии при гриппе (р = 0,003) (табл. 2). Расчет относительного риска выявил положительную ассоциацию аллеля Т гена NOS3 полиморфизма C786T с тяжелым течением пневмонии при гриппе (ОР = 1,5, ДИ [–1,0; 3,21]). Генотип Т/Т полиморфизма гена NOS3 (С786Т) ассоциирован с развитием тяжелого гриппа (ОР 1,16 при доверительном интервале – ДИ от –1,11 до 1,9), а генотип С/Т при легком и среднетяжелом его течении проявляет себя как протективный фактор (соответственно, ОР 0,97, ДИ [–1,41; 1,27]; ОР 0,99, ДИ [–1,27; 1,23]).

Распределение генотипов EDN1 Lys198Asn и частоты его аллельных вариантов у здоровых лиц и у пациентов с различным течением гриппа представлено в табл. 3.

Таблица 3

Распределение генотипов и частоты аллельных вариантов EDN1 (Lys198Asn) среди больных с гриппом

Группа

Генотип, %

Аллель, р

Lys/Lys

Lys/Asn

Asn/Asn

Lys

Asn

Контроль, n = 200

156 (78 %)

42 (21 %)

2 (1 %)

0,89

0,11

Сезонный грипп, n = 27

21 (78 %)

6 (22 %)

0,89

0,11

Грипп А H1N1pdm09 легкой степени, n = 40

26 (65 %)

14 (35 %)

0,83

0,17

Грипп А H1N1pdm09 средней степени, n = 56

38 (68 %)

18 (32 %)

0,84

0,16

Грипп А H1N1pdm09 тяжелой степени, n = 18

6 (33 %)*/**

10 (56 %)*/**

2 (11 %)*/**

0,61*/**

0,39*/**

Нетяжелая пневмония как осложнение гриппа А H1N1pdm09, n = 67

29 (43 %)*

37 (55 %)*

1 (2 %)*

0,7*

0,3*

Тяжелая пневмония как осложнение гриппа А H1N1pdm09, n = 20

7 (35 %)*/**

10 (50 %)*/**

3 (15 %)*/**

0,6*/**

0,4*/**

Нетяжелая пневмония группы сравнения, n = 35

22 (62,9 %)

13 (37,1 %)

0,81

0,19

Тяжелая пневмония группы сравнения, n = 15

10 (66,6 %)

4 (26,7 %)

1 (6,7 %)

0,8

0,2

Примечания: * – статистическая значимость различий с контролем, ** – статистическая значимость различий с группой клинического сравнения.

Распространенность генотипов Lys/Lys и Lys/Asn оказалась одинаково частой у здоровых детей и у больных с сезонным гриппом (р = 0,866), а также у пациентов с легким (р = 0,139) и среднетяжелым течением гриппа А H1N1pdm09 (р = 0,176). В то же время генотип Lys/Asn EDN1 в 1,4 раза чаще регистрировался у пациентов с тяжелым течением пандемического гриппа по сравнению со здоровыми лицами (р = 0,0001) и в 2,2 раза чаще, чем у пациентов с сезонным гриппом (р = 0,007). Кроме того, у детей при тяжелом течении гриппа А H1N1pdm09 распространенность генотипа Asn/Asn полиморфного локуса EDN1 Lys198Asn оказалась повышенной относительно группы контроля (р = 0,0001). Среди пациентов других исследуемых групп данный генотип нами не обнаруживался. Распределение генотипов Lys/Lys, Lys/Asn и Asn/Asn оказалось одинаково частым у здоровых детей и у больных с нетяжелым и тяжелым течением внебольничной пневмонии, этиологически не связанной с вирусом гриппа (соответственно р = 0,102, р = 0,161). Кроме того, частота выявления этих генотипов не отличалась и у пациентов с различной тяжестью течения внебольничной пневмонии вне эпидемического сезона по гриппу (р = 0,26). В то же время у детей при тяжелой пневмонии, обусловленной пандемическим вирусом гриппа, частота регистрации исследуемых генотипов отличалась не только от группы здоровых лиц, но и от пациентов группы сравнения (р = 0,022) и детей с нетяжелым течением пневмонии в сезон циркуляции гриппа А H1N1pdm09 (р = 0,04). У пациентов при тяжелом течении пневмонии при гриппе относительно детей группы сравнения с тяжелым течением пневмонии генотип Asn/Asn обнаруживался чаще в 2,2 раза, а генотип Lys/Asn – чаще в 1,9 раза.

Сравнивая частоту аллельных вариантов гена EDN1 Lys198Asn, выявили, что при тяжелом течении пандемического гриппа аллель Asn встречается с частотой 0,61, что достоверно реже, чем у здоровых индивидуумов и пациентов с легким и среднетяжелым течением гриппа А H1N1pdm09, а также у детей при сезонном гриппе (табл. 3). Обнаружение аномальной Asn-аллели чаще наблюдалось у детей с тяжелым течением гриппозной инфекции в сравнении как с группой контроля, так и пациентами остальных исследуемых групп (р = 0,0001). А расчет относительного риска выявил положительную ассоциацию данного аллеля с тяжелым течением пандемического гриппа (ОР = 3,38, ДИ [1,97; 4,65]). В случае развития пневмонии при пандемическом гриппе отмечалось более редкое обнаружение аллели Lys (р = 0,0001). Соответственно, мутантная аллель Asn у детей при гриппе, осложненном пневмонией, выявлялась чаще в сопоставлении со здоровыми индивидуумами и пациентами группы сравнения (соответственно р = 0,0001, р = 0,002). Достоверных отличий распространенности аллели Asn у детей с различной тяжестью течения пневмонии при гриппе нами не выявлено (р = 0,182). Расчет относительного риска выявил положительную ассоциацию данного аллеля с тяжелым течением пневмонии при гриппе А H1N1pdm09 (ОР = 1,37, ДИ [-0,39; 2,12]). Тогда как аллель Lys при тяжелом течении пневмонии у детей с гриппом оказывала протективное действие (ОР = 0,72, ДИ [–2,12; 0,39]).

Таким образом, определение полиморфизма генов молекул, характеризующих дисфункцию эндотелия, дает возможность осуществлять индивидуальный прогноз тяжести и характера течения пандемического гриппа и позволяет тем самым расширить перечень хорошо известных предикторов тяжести его течения в детском возрасте и повысить вероятность прогноза.

Рецензенты:

Шаповалов К.Г., д.м.н., доцент, заведующий кафедрой анестезиологии, реанимации и интенсивной терапии, ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Чита;

Малежик Л.П., д.м.н., профессор кафедры нормальной физиологии, ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Чита.

Работа поступила в редакцию 15.10.2014.