Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,087

EPOXYALANTOLACTONE AND ITS DERIVAIVES INHIBIT THE GROWTH OF MAMMARY GLAND ADENOCARCINOMAS

Pukhov S.A. 1 Neganova M.E. 1 Anikina L.V. 1 Shevtsova E.F. 1 Afanaseva S.V. 1 Klochkov S.G. 1
1 Institute of Physiologically Active Compounds Russian Academy of Sciences
Изучено действие природного сесквитерпенового лактона эпоксиалантолактона и его производных на выживаемость клеточной линии MCF7 и перекисное окисление липидов (ПОЛ), индуцируемое ионами железа. Исходное природное соединение не проявляет антиоксидантной активности в широком диапазоне концентраций, в то время как остальные синтезированные вещества эффективно ингибируют Fe3+-индуцированное ПОЛ. Эпоксиалантолактон и его производные ингибируют рост культуры клеточной линии MCF7 в дозозависимом виде за счет механизмов, связанных не только с продукцией свободных радикалов и влиянием на окислительные повреждения липидов. В большинстве случаев антиоксидантный потенциал этих соединений не препятствует проявлению их цитотоксичности по отношению к клеточной линии MCF7, что показано при предобработке клеток N-ацетилцистеином. Показано, что данные соединения могут представлять интерес в качестве потенциальных противоопухолевых агентов с различными мишенями действия.
In the present study we investigated the influence of natural sesquiterpene lactone epoxyalantolactone and its derivatives on the growth of MCF7 cells and lipid peroxidation induced by iron ions. Original natural compound does not show antioxidant activity in a wide range of concentrations, while synthesized compounds are effectively inhibit Fe3+-induced lipid peroxidation. Epoxyalantolactone and its derivatives inhibit the growth of MCF7 cell line in a dose-dependent manner by mechanisms related not only by the production of free radicals and lipid peroxidation. In most cases the antioxidant capacity of these compounds prevents the appearance of their cytotoxicity to MCF7 cell line, as shown by cell pretreatment with N-acetylcysteine​​. Have been demonstrated that tested compounds received considerable attention as potential agent with various mechanisms of action.
sesquiterpene lactones
adenocarcinoma
apoptosis
reactive oxygen species
lipid peroxidation
1. Klochkov S.G., Afanas’eva S.V., Pushin A.N. Acidic isomerization of alantolactone derivatives / Chem. of Nat. Comp. 2006. Vol. 42, no. 4. рр. 400–406.
2. Klochkov S.G., Afanas’eva S.V., Bulychev Yu.N., Neganova M.E., Shevtsova E.F. Synthesis and biological activity of isoalantolactone tryptamine conjugates / Rus. Chem. Bull., Int. Ed. 2012. Vol. 61, no. 2. рр. 409–415.
3. Klochkov S.G., Anan’ev I.V., Pukhov S.A., Afanas’eva S.V. Stereochemistry of the aza-Michael reaction with natural alantolactones / Chem. of Het. Comp. 2012. Vol. 48, no. 5. рр. 698–703.
4. Neganova M.E., Klochkov S.G., Shevtsova E.F., Blik V.A., Chepurnova N.E. Investigation of the antioxidant characteristics of a new tryptamine derivative of securinine and its influence on seizure activity in the brain in experimental epilepsy / Neurochem. J. 2011. Vol. 5, no. 3. рр. 208–214.
5. Apak R., Guclu K., Ozyurek M., Karademir S.E. Novel total antioxidant capacity index for dietary polyphenol and vitamins C and E, using their cupric ion reducing capability in the presence of neocuproine: CUPRAC Method. J. Agric. Food Chem. 2004. no. 52. рр. 7970–7981.
6. Konishi T., Shimada Y., Nagao T., Okabe H., Konoshima T. Antiproliferative sesquiterpene lactones from the roots of Inula helenium. Biol. Pharm. Bull. 2002. Vol. 25, no. 10. рр. 1370–1372.
7. Merfort I. Perspectives on sesquiterpene lactones in inflammation and cancer. Curr. Drug Targets. 2011. Vol. 12, no. 11. рр. 1560–1573.
8. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Meth. 1983. no. 65. рр. 55–63.
9. Rasul A., Di J., Millimouno F.M., Malhi M., Tsuji I., Ali M., Li J., Li X.. Reactive oxygen species mediate isoalantolactone-induced apoptosis in human prostate cancer cells. Molecules. 2013. Vol. 5, no. 18(8). рр. 9382–9396.
10. Zhang S., Won Y.K., Ong C.N., Shen H.M. Anti-cancer potential of sesquiterpene lactones: bioactivity and molecular mechanisms. Curr. Med. Chem. Anticancer Agents. 2005. Vol. 5, no. 3. рр. 239–249.

В последнее время интенсивно исследуются сесквитерпеновые лактоны растений семейства сложноцветных (Asteraceae) и механизмы их противоопухолевого действия [7]. Противоопухолевая активность сесквитерпеновых лактонов реализуется в основном через индукцию апоптоза. Немаловажную роль в этом процессе играют влияние лактонов на клеточный редокс-статус, образование активных форм кислорода (АФК) и, как следствие, окислительные повреждения в клетке и запуск митохондриально-зависимого пути апоптоза [10]. Было показано, что сесквитерпеновые лактоны, выделенные из известного в народной медицине многих стран растения девясил высокий (Inula helenium L.), обладают выраженным антипролиферативным действием в отношении ряда культур опухолевых клеток [6]. Изоалантолактон (основной сесквитерпеновый лактон I. helenium) индуцирует апоптоз в различных опухолевых клеточных линиях. Данный эффект обеспечивается за счет регуляции белков семейства Bcl, активации ростовых факторов и каспазы-3, причем все эти процессы тесно связаны с образованием АФК [9]. В настоящем исследовании мы оценили влияние минорного сесквитерпенового лактона I. helenium – эпоксиалантолактона – и его производных на рост клеток аденокарциномы молочной железы человека и способность этих соединений индуцировать или предотвращать окислительные повреждения липидов мембран клеток.

Материалы и методы исследования

Исследуемые соединения

Эпоксиалантолактон выделяли из корней растения девясил высокий (Inula helenium L., сем. Asteraceae) по стандартной методике, препаративные количества эпоксиалантолактона получали эпоксидированием алантолактона [1]. Производные эпоксиалантолактона 1 и 2 получали реакцией нуклеофильного присоединения аминов по активированной экзометиленовой связи лактонного цикла (реакция Михаэля) (рис. 1) [2].

Реакция эпоксиалантолактона с аминами (общая методика). Смесь эпоксиалантолактона и соответствующего амина (10 %-й избыток) растворяли при перемешивании в метаноле и оставляли при комнатной температуре на ночь. По завершении реакции происходило образование продукта в виде осадка. При использовании в качестве нуклеофилов вторичных аминов были получены аминопроизводные эпоксиалантолактона 1 (15 соединений).

При проведении реакции с рядом первичных аминов, которые содержали дополнительный n- или π-донорный фрагмент, отделенный от аминогруппы углеводородным мостиком, нами были получены производные нового структурного типа – гидрированные бензо[g]фуро[4,3,2-cd]индолоны 2 [3]. Таким способом было получено 10 производных.

Строение всех полученных соединений было установлено с помощью спектральных методов и в ряде случаев подтверждено методом РСА.

pic_40.tif

Рис. 1. Получение эпоксиалантолактона и его производных

Культуры клеток

Культуру клеток человека MCF7 (ATCC® HTB22™) (аденокарцинома молочной железы) выращивали в среде EMEM (НПП ПанЭко) с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone®, Thermo Scientific), 2мM L-глутамина (НПП ПанЭко) и 1 % гентамицина (ОАО Биохимик) в качестве антибиотика и инкубировали при 37 °C в атмосфере CO2 (5 %).

Цитотоксичность

Цитотоксичность синтезированных соединений была определена по МТТ-тесту [8]. Клетки MCF7 сеяли в 96-луночный планшет (CELLTREAT™) в количестве 1∙104 клеток/200 мкл и культивировали при 37 °C в атмосфере CO2 (5 %). После 24 часов инкубации к культурам клеток были добавлены различные концентрации тестируемых соединений (100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,12 и 1,56 мкМ), и далее клетки культивировали в тех же условиях 48 часов. Для каждой концентрации эксперименты были выполнены в трех повторностях. Все вещества растворяли в ДМСО (PANREAC QUÍMICA S.L.U), конечная концентрация ДМСО в лунке не превышала 1 % и не была токсична для клеток. В контрольные лунки добавляли растворитель в количестве 1 %. После инкубации в каждую лунку было добавлено 20 мкл MTT (бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия) (5 мг/мл) (Sigma-Aldrich) и планшеты дополнительно инкубировали в течение 2 часов. Далее из планшетов удаляли среду и в каждую лунку добавляли по 100 мкл ДМСО для растворения образовавшихся кристаллов формазана. С помощью планшетного анализатора (Victor3, PerkinElmer) определяли оптическую плотность при 530 нм, за вычетом измеренного фонового поглощения при 620 нм. Значение концентрации, вызывающее 50 % ингибирование роста популяции клеток (IC50), было определено на основе дозозависимых кривых с помощью программного обеспечения OriginPro 9.0.

Определение интенсивности перекисного окисления липидов

Перекисное окисление липидов гомогената мозга крыс определяли по модифицированному ТБК-тесту [4]. В качестве инициатора ПОЛ гомогената мозга крыс выступали ионы трехвалентного железа (FeNH4(SO4)2·12H2O). Оптическую плотность регистрировали на планшетном анализаторе при длине волны 540 нм. В качестве контроля использовали гомогенат мозга крыс в отсутствие соединений, но с добавлением равного объёма растворителя.

Определение восстановительной активности соединений

Восстановительную активность исследуемых веществ устанавливали на основании их активности в реакции переноса электрона с использованием CUPRAC-теста [5]. В качестве вещества-стандарта использовали известный антиоксидант – тролокс. Значение тролокс-эквивалента определяли графически по величине оптической плотности с использованием калибровочного графика – концентрационной зависимости количества восстановленной меди от содержания тролокса.

Предобработка N-ацетилцистеином

Для определения роли окислительного стресса в процессе ингибирования роста клеточной линии аденокарциномы молочной железы при действии эпоксиалантолактона и его производных исследовали их цитотоксичность в присутствии N-ацетилцистеина – специфичного АФК-акцептора. Для этого в лунки с культивированными клетками MCF7 (кроме контроля) добавляли 3 мкл N-ацетилцистеина (5 мМ) (Sigma-Aldrich) в EMEM и инкубировали в течение 4 часов, после этого вносили исследуемые соединения (100 мкМ) и определяли значение IC50 согласно процедуре, приведенной выше.

Результаты исследования и их обсуждение

Установлено, что исходный эпоксиалантолактон не проявляет антиоксидантной активности в широком диапазоне концентраций, в то время как остальные синтезированные вещества эффективно ингибируют Fe3+ -индуцированное ПОЛ (табл. 1).

Для ряда соединений антиоксидантная активность в значительной степени может быть связана с восстановительной активностью, определяемой в CUPRAC-тесте. Это прежде всего относится к производным L05-0003, L05-5488n и L05-5488, более активным, чем тролокс, и производным L05-5272n, L05-5272st, близким по активности к тролоксу, которые оказывают и наиболее сильное ингибирование ПОЛ.

Таблица 1

Антиоксидантная активность соединений

№ п/п

Соединение

Ингибирование ПОЛ, % от контроля

CUPRAC-тест, ТЭ*

1.

Эпоксиалантолактон

― **

2.

L05-0123

76,28 ± 2,84

3.

L05-0003

77,69 ± 0,33

1,14 ± 0,12

4.

L05-5488n

87,39 ± 2,57

1,20 ± 0,06

5.

L05-5488

85,73 ± 1,83

1,20 ± 0,10

6.

L05-0181

82,36 ± 1,29

7.

L05-8019

72,95 ± 2,74

8.

L05-8031

79,99 ± 3,81

9.

L05-0020

10.

L05-5272n

71,78 ± 3,81

0,65 ± 0,04

11.

L05-5272st

73,57 ± 3,56

0,77 ± 0,07

12.

L05-0165n

77,34 ± 6,09

13.

L05-0165v

80,99 ± 3,69

0,30 ± 0,09

14.

L05-3008

64,76 ± 8,28

0,23 ± 0,04

15.

L05-0073

73,42 ± 11,05

0,22 ± 0,06

Примечания:

* тролокс-эквивалент;

** нет влияния.

Практически все исследованные соединения обладают выраженной цитотоксической активностью. Как показали проведенные эксперименты, воздействие эпоксиалантолактоном и его производными в течение 48 часов ингибирует рост культуры клеточной линии MCF7 (табл. 2) в дозозависимом виде. Следует отметить, что цитотоксическая активность ряда аддуктов эпоксиалантолактона (соединения L05-0003, L05-6640, L05-0218, L05-6605, L05-6747) превышает активность исходного соединения в несколько раз.

Предварительная обработка N-ацетилцистеином снижает токсический эффект исследуемых соединений в разной степени (рис. 2) вплоть до практически полного подавления цитотоксического эффекта соединения L05-5272n. В случае изоалантолактона в работе [4] было показано, что предварительная обработка различных опухолевых клеточных линий N-ацетилцистеином сохраняет жизнеспособность клеток, указывая, что цитотоксическое действие на клетки осуществляется в основном через генерацию АФК.

Таким образом, можно предположить, что в основе цитотоксической активности производных эпоксиалантолактона лежат механизмы, связанные не только с продукцией свободных радикалов и влиянием на окислительные повреждения липидов. В большинстве случаев антиоксидантный потенциал этих соединений не препятствует проявлению их цитотоксичности по отношению к клеточной линии MCF7. В то же время для соединений L05-5272n и L05-5702 (структурный тип 1) участие АФК-зависимых механизмов в гибели клеток MCF7 более выражено и цитотоксический эффект этих соединений в большей степени может быть предотвращён добавлением N-ацетилцистеина.

Таблица 2

Цитотоксичность соединений в отношении культуры опухолевых клеток MCF7

№ п/п

Соединение

IC50, мкM

1.

Эпоксиалантолактон

47,79 ± 1,65

2.

L05-0020

> 250,00

3.

L05-0073

176,76 ± 11,59

4.

L05-0165v

154,69 ± 11,45

5.

L05-0165n

169,89 ± 2,77

6.

L05-0181

184,65 ± 35,82

7.

L05-5272st

137,38 ± 0,24

8.

L05-5272n

64,46 ± 4,90

9.

L05-5488

138,85 ± 6,61

10.

L05-5488n

210,18 ± 3,61

11.

L05-8019

> 250,00

12.

L05-8031

176,76 ± 13,92

13.

L05-3008

119,40 ± 0,09

14.

L05-0123

243,62 ± 8,34

15.

L05-0003

23,73 ± 3,34

16.

L05-0619

77,06 ± 11,29

17.

L05-6616

151,48 ± 12,56

18.

L05-6640

18,37 ± 0,60

19.

L05-0218

23,55 ± 0,74

20.

L05-5702

40,47 ± 2,83

21.

L05-1073

91,73 ± 2,12

22.

L05-6605

19,30 ± 0,01

23.

L05-0140

40,47 ± 0,98

24.

L05-6747

11,21 ± 0,55

25.

L05-5418

24,31 ± 1,39

pic_41.wmf

Рис. 2. Выживаемость клеток MCF7, предобработанных N-ацетилцистеином, под действием исследуемых соединений

Исследование действия эпоксиалантолактона и его производных на трансмембранный потенциал митохондриий, высвобождение проапоптотических факторов из митохондрий и влияние на клеточный цикл поможет уточнить предполагаемый механизм действия полученных соединений. Вместе с тем наличие активных соединений с разными механизмами действия среди синтезированной серии аддуктов позволяет рассматривать их как основу для разработки агентов с высоким противоопухолевым потенциалом.

Работа выполнена при поддержке Программы Президиума Российской академии наук «Фундаментальные науки – медицине».

Рецензенты:

Григорьев В.В., д.б.н., заведующий лабораторией нейрорецепции, ФГБУН «Институт физиологически активных веществ» Российской академии наук, ведомственная принадлежность Федеральное агентство научных организаций (ФАНО), г. Черноголовка;

Кинзирский А.С., д.м.н., профессор, заведующий лабораторией фармакологии, ФГБУН «Институт физиологически активных веществ» Российской академии наук, ведомственная принадлежность Федеральное агентство научных организаций (ФАНО), г. Черноголовка.

Работа поступила в редакцию 26.08.2014.