Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,087

FERMENTATION OF ENZYMATIC HYDROLYZATE OF MISCANTHUS CELLULOSE BY PACHYSOLEN TANNOPHILUS Y-1532 AND SACCHAROMYCES CEREVISIAE Y-1693

Baybakova O.V. 1
1 Federal State Budget Institution of Science Institute for Problems of Chemical and Energetic Technologies
Исследована кинетика прироста биомассы дрожжей и утилизации субстрата для штаммов Pachysolеn tannophillus ВКПМ Y-1532 и Saccharomyces сerevisiae ВКПМ Y-1693 на синтетических глюкозных и ксилозных средах. Установлены преимущества Saccharomyces сerevisiae ВКПМ Y-1693 по скорости прироста биомассы и скорости утилизации субстрата по сравнению с Pachysolеn tannophillus ВКПМ Y-1532. При повышении концентрации субстрата до 30 г/л для P. tannophilus ВКПМ Y-1532 наблюдается субстратное ингибирование. Установлено, что S. сerevisiae ВКПМ Y-1693 не утилизирует ксилозу, а для P. tannophilus ВКПМ Y-1532 выход этанола крайне низок и составляет 23 % от теоретического. Получен биоэтанол на среде ферментативного водного гидролизата технической целлюлозы мискантуса с помощью обоих видов дрожжей. Показано, что Saccharomyces сerevisiae ВКПМ Y-1693 синтезирует этанол с выходом 62,5 %.
The kinetics of cell growth and of substrate utilization for Y-1532 Pachysolеn tannophillus and Y-1693 Saccharomyces сerevisiae yeasts was studied on synthetic carbohydrate media. At a substrate concentration of 20 g/L, the specific growth rate of Saccharomyces was shown to be 1,8 times higher than that of Pachysolеns and the glucose fermentation rate to be 1,4 times higher. With increasing substrate concentration as high as 30 g/L for Y-1693 Saccharomyces сerevisiae, the growth rate and glucose fermentation rate increase as well by a factor of 1.4 and 1,2, respectively; for Y-1532 Pachysolеn tannophillus, the substrate was observed to be inhibited. Bioethanol was produced on a medium of aqueous Miscanthus hydrolyzate using both yeasts. The joint use of the strains was shown to be unreasonable, so far as it does not increase the ethanol yield. Y-1693 Saccharomyces сerevisiae on the aqueous enzymatic Miscanthus hydrolyzate medium was found to synthesize ethanol in 62,5 % yield.
bioethanol
alcohol fermentation
yeast
cell growth kinetics
substrate consumption
1. Borisova S.V. Ispol›zovanie drozhzhey v promyshlennosti / S.V. Borisova, O.A. Reshetnik, Z.Sh. Mingaleeva. SPb.: GIORD, 2008. 216 р.
2. Gismatulina Ju.A., Budaeva V.V. Himicheskij sostav rossijskogo miskantusa i kachestvo celljulozy, poluchennoj iz nego // Himija v interesah ustojchivogo razvitija. 2013. T. 21. no. 5. рр. 539–544.
3. Kuznecova O.Ju. Sovremennye aspekty razvitija bionano- i/ili nanobiotehnologii // Vestnik Kazan. tehnol. un-ta. 2013. T. 16. no. 3. рр. 156–163.
4. Skiba E.A., Orlov S.E., Budaeva V.V. Optimizacija sostava gljukozo-ammonijnoj sredy po vyhodu jetanola dlja shtamma Saccharomyces serevisiae Y-1693 // Vestnik TGU. Biologija. 2012. no. 2. рр. 66–73.
5. Khol›kin Yu.I Tekhnologiya gidroliznykh proizvodstv / Yu.I. Khol›kin. M.: Lesnaya promyshlennost›, 1989. 314 р.
6. Jarovenko V.L. Tehnologija spirta / V.L. Jarovenko, V.A. Marinchenko, V.A. Smirnov [i dr.]. Pod red. prof. V.L. Jarovenko M.: Kolos, 1999. 464 р.

Проблеме переработки биомассы с целью получения биотоплива в мире уделяется значительное внимание [3]. Основным продуцентом биоэтанола в России являются дрожжи Saccharomyces сerevisiae, применяемые в производстве этилового спирта как на пищевом сырье, так и на гидролизных средах. Однако сахаромицеты не сбраживают в этанол пентозы, которых в гидролизатах может быть значительное количество (это зависит от вида сырья и способа получения гидролизата). Известно несколько видов дрожжей, сбраживающих ксилозу в этанол: Pachysolеn tannophillus, Candida shehatae, Candida tropicalis, Pichia stipitis и другие [1, 5].

Для выбора продуцента биоэтанола необходимо предварительное определение удельной скорости прироста биомассы дрожжей и скорости утилизации субстрата на синтетических средах. Целью данной работы было получение биоэтанола на среде ферментативного гидролизата целлюлозы мискантуса с помощью продуцентов Pachysolen tannophilus и Saccharomyces сerevisiae и обоснование выбора продуцента.

Материалы и методы исследования

Штамм Pachysolen tannophilus ВКПМ Y-1532 был получен из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ, г. Москва) и предназначался для производства спирта на гидролизатах древесины. Штамм Saccharomyces сerevisiae ВКПМ Y-1693 был выделен из ферментера Котласского целлюлозно-бумажного комбината Архангельской области и использовался для производства этанола на сульфитных щелоках.

На первом этапе изучалась биосинтетическая активность штаммов на синтетических средах. Использовалась полная дрожжевая среда, рекомендованная ВКПМ для дрожжей рода Pachysolen (ПДС-1) и её модификации (табл. 1).

В стерильные среды вносился инокулят сахаромицетов или пахизолена в количестве 5 %. Культивирование проводилось в анаэробных условиях при температуре 28 °С и рН 4,5.

Таблица 1

Состав синтетических сред

Компонент среды

Дозировка компонентов, г / 1000 мл

ПДС-1

ПДС-2

ПДС-3

Глюкоза

20

30

Ксилоза

20

Пептон

10

14

10

Дрожжевой экстракт

5

7

5

На втором этапе в качестве питательной среды был использован ферментативный водный гидролизат технической целлюлозы энергетического растения Мискантус китайский, полученной азотнокислым способом на опытном производстве ИПХЭТ СО РАН [2]. Гидролизат представлял собой янтарно-жёлтую мутноватую жидкость с характерным кисловатым запахом мискантуса. Редуцирующие вещества (РВ) гидролизата представлены преимущественно глюкозой: всего РВ – 51,2 ± 0,5 г/л, в том числе ксилозы 1,7 ± 0,2 г/л; рН 4,5. Гидролизат не является полноценной средой для дрожжей, ранее было установлено, что в него дополнительно следует вносить азот в количестве, пропорциональном концентрации РВ в полученном гидролизате [4]. Поэтому в гидролизат был внесен сульфат аммония в количестве 10 г/л. Гидролизат был пастеризован при 100 °С без выдержки, охлаждён до 30 °С и направлен на спиртовое брожение. Было проведено 4 варианта биосинтеза этанола с использованием следующих продуцентов, вносимых в питательную среду в количестве 5 %:

А – P. tannophilus ВКПМ Y-1532;

Б – S. сerevisiae ВКПМ Y-1693, продолжительность культивирования 3 суток; после этого внесен P. tannophilus ВКПМ Y-1532;

В – одновременно внесены P. tannophilus ВКПМ Y-1532 и S. сerevisiae ВКПМ Y-1693;

Г – S. сerevisiae ВКПМ Y-1693.

Брожение проводилось в анаэробных условиях при рН 4,5 и температуре 28 °С, продолжительность брожения для различных вариантов составила от 7 до 10 суток.

Общее количество дрожжевых клеток в бражках определялось прямым подсчётом на камере Горяева. Редуцирующие вещества (РВ) в средах определялись спектрофотометрическим методом (спектрофотометр «UNICO UV-2804», США) в пересчете на глюкозу, для ПДС-3 – в пересчёте на ксилозу. Концентрация ксилозы в ферментативном гидролизате определялась железоорсиновым способом. Крепость бражек (объемная доля спирта) определялась ареометром для спирта в дистилляте, полученном после предварительной перегонки спирта из бражки согласно ГОСТ Р 51135-98-2003.

Результаты исследования и их обсуждение

Кинетика утилизации субстратов на синтетических глюкозных средах

Основное потребление субстрата P. tannophilus ВКПМ Y-1532 произошло через трое суток брожения на ПДС-1 и через пять на ПДС-2 (рис. 1).

pic_1.wmf

Рис. 1. Зависимость концентрации РВ от продолжительности брожения P. tannophilus на глюкозных средах

Скорость сбраживания глюкозы была рассчитана по формуле

altuh01.wmf

где Ксб – константа скорости сбраживания, ч–1; τсб – фиксируемый период времени от начала брожения; s0 и s – концентрация РВ в начале брожения (в сусле) и во время τсб (в бражке) [6].

Для ПДС-1 Ксб составляет 0,049 ч–1, для ПДС-2 – 0,033 ч–1, что свидетельствует о субстратном ингибировании метаболизма дрожжей при повышении концентрации субстрата всего на 10 г/л. Получен хороший выход этанола: на ПДС-1 через четверо суток синтезируется 1,1 об. % этанола, что соответствует выходу 85 % от теоретического; на ПДС-2 через 7 суток синтезируется 1,7 об. % этанола, что соответствует выходу 88 %.

Аналогичным образом проведены опыты по сбраживанию синтетических сред с помощью продуцента S. сerevisiae ВКПМ Y-1693. Получены типичные для данного рода дрожжей кривые прироста биомассы и утилизации субстрата. Результаты определения кинетических параметров приведены в табл. 2.

Таблица 2

Кинетика прироста биомассы дрожжей и утилизации субстрата и расчет экономического коэффициента брожения для продуцентов P. tannophilus ВКПМ Y-1532 и S. сerevisiae ВКПМ Y-1693

Показатель

P. tannophilus ВКПМ Y-1532

S. сerevisiae ВКПМ Y-1693

ПДС-1

ПДС-2

ПДС-1

ПДС-2

Удельная скорость прироста биомассы μ, ч–1

0,047

0,036

0,086

0,124

Время удвоения, ч

14,8

19,2

8,1

5,6

Константа сбраживания сахара, Ксб, ч–1

0,049

0,033

0,068

0,077

Конечная концентрация этанола в бражке, об. %

1,10

1,70

1,25

1,70

Выход этанола, % от теоретического

85

88

92

88

Экономический коэффициент брожения, YP/S

0,550

0,567

0,625

0,567

Если сравнить кинетику прироста биомассы дрожжей и утилизации субстрата для дрожжей P. tannophilus ВКПМ Y-1532 и S. сerevisiae ВКПМ Y-1693 при концентрации субстрата 20 г/л, то удельная скорость прироста биомассы сахаромицетов выше в 1,8 раза, чем пахизолена, а скорость сбраживания глюкозы выше в 1,4 раза.

При концентрации 30 г/л различие скоростей прироста биомассы дрожжей и утилизации субстрата для этих культур будет ещё выше. На повышение концентрации субстрата дрожжи реагируют неодинаково: для S. сerevisiae ВКПМ Y-1693 повышается и скорость прироста биомассы (в 1,4 раза), и скорость сбраживания глюкозы (в 1,2 раза); для P. tannophilus ВКПМ Y-1532 наблюдается субстратное ингибирование: скорость прироста биомассы дрожжей снижается в 1,3 раза; скорость сбраживания – в 1,5 раза.

Таким образом, формальный анализ кинетики прироста биомассы дрожжей и утилизации субстрата продуцентами P. tannophilus ВКПМ Y-1532 и S. сerevisiae ВКПМ Y-1693 позволяет сделать следующие выводы: при совместном использовании данных штаммов концентрация дрожжей P. tannophilus ВКПМ Y-1532 должна быть в два раза выше, чем S. сerevisiae ВКПМ Y-1693, а внесены они должны быть в конце брожения, при снижении концентрации субстрата до 20 г/л.

Определение биосинтетической способности продуцентов на синтетической ксилозной среде

В синтетические ксилозные среды (ПДС-3) было внесено 20 % инокулята дрожжей рода Pachysolen или Saccaromyces. При культивировании на ксилозной среде S. сerevisiae ВКПМ Y-1693 были подтверждены литературные данные: штамм не способен к утилизации ксилозы.

Концентрация редуцирующих веществ на 7 сутки культивирования P. tannophilus составила 13,1 г/л, то есть утилизация ксилозы штаммом идет крайне медленно, выход этанола составил всего 23 %. Из литературных данных известно, что 50 % ксилозы метаболизируется P. tannophilus в этанол и 50 % – в ксилит [1]. Таким образом, эффективность синтеза этанола на ксилозной синтетической среде штаммом ВКПМ Y-1532 крайне низкая.

Определение биосинтетической способности продуцентов на среде ферментативного гидролизата целлюлозы мискантуса

Убыль редуцирующих веществ в процессе брожения гидролизатов представлена на рис. 2.

pic_2.wmf

Рис. 2. Зависимость концентрации редуцирующих веществ от продолжительности брожения на среде ферментативного гидролизата

Для вариантов Б и Г кривые фактически совпадают, сахар утилизируется через 3 суток. Таким образом, внесение в среду P. tannophilus после утилизации S. сerevisiae основной части РВ (вариант Б) не привело к положительным результатам. При совместном использовании культур (вариант В) утилизация сахаров интенсифицируется и наблюдается через двое суток. При использовании только P. tannophilus (вариант А) скорость сбраживания сахаров минимальна: их утилизация происходит только на 8 сутки.

В табл. 3 представлены результаты брожения. Скорость сбраживания РВ через трое суток продуцентом P. tannophilus ВКПМ Y-1532 в 13 раз ниже, чем S. сerevisiae ВКПМ Y-1693. При совместном использовании культур скорость сбраживания увеличивается в 1,1 раза по сравнению с S. сerevisiae ВКПМ Y-1693.

Таблица 3

Кинетика утилизации субстрата и расчет экономического коэффициента брожения для продуцентов P. tannophilus ВКПМ Y-1532 и S. сerevisiae ВКПМ Y-1693 на среде ферментативного гидролизата

Показатель

Варианты

А

Б

В

Г

Константа сбраживания сахара через трое суток брожения, Ксб, ч–1

0,004

0,050

0,059

0,052

Остаточная концентрация РВ в гидролизате после брожения, г/л

9,5

8,0

6,7

8,0

Конечная концентрация этанола в бражке, об. %

1,4

2,0

2,0

2,0

Выход этанола, % от теоретического

44,0

62,5

62,5

62,5

Экономический коэффициент брожения, YP/S

0,270

0,390

0,390

0,390

Бродильная активность P. tannophilus достаточно низкая: через 10 суток культура синтезирует 1,4 об. % этанола или 44 % от теоретического при полной утилизации РВ гидролизата. В остальных вариантах получено 2 об. % этанола, причём дображивание шло крайне медленно. Таким образом, совместное использование штаммов нецелесообразно, так как оно не приводит к повышению выхода биоэтанола. Кроме того, усложняется технология получения биоэтанола, так как требуется проведение дополнительных работ на стадии культивирования засевных дрожжей.

Полученная крепость бражки соответствует выходу этилового спирта 62,5 % от теоретического, или 40 л из 100 кг сбраживаемых сахаров. Выход этанола меньше, чем на гидролизных заводах (55–58 л из 100 кг сбраживаемых сахаров [5]), что объясняется неполноценностью состава питательной среды. Можно предположить, что мискантус как сырье содержит компоненты, частично ингибирующие активность зимазного комплекса дрожжей.

Выводы

Сравнение кинетики прироста биомассы дрожжей и утилизации субстрата для дрожжей P. tannophilus ВКПМ Y-1532 и S. сerevisiae ВКПМ Y-1693 при концентрации субстрата 20 г/л показывает, что удельная скорость прироста биомассы сахаромицетов выше в 1,8 раза, чем пахизолена, а скорость сбраживания глюкозы выше в 1,4 раза. При повышении концентрации субстрата до 30 г/л для S. сerevisiae ВКПМ Y-1693 повышается и скорость прироста биомассы (в 1,4 раза), и скорость сбраживания глюкозы (в 1,2 раза); для P. tannophilus ВКПМ Y-1532 наблюдается субстратное ингибирование.

Получен биоэтанол на среде ферментативного гидролизата с помощью продуцентов Pachysolen tannophilus и Saccharomyces сerevisiae. Выход этанола составил для продуцента P. tannophilus ВКПМ Y-1532 44 % от теоретического, а для S. сerevisiae ВКПМ Y-1693 – 62,5 %. При совместном применении культур скорость сбраживания увеличивается в 1,1 раза по сравнению с S. сerevisiae ВКПМ Y-1693, но повышения выхода этанола не наблюдается, поэтому совместное использование штаммов нецелесообразно. Таким образом, для получения биоэтанола на среде ферментативного гидролизата мискантуса рекомендовано применение штамма S. сerevisiae ВКПМ Y-1693.

Рецензенты:

Новожилов Е.В., д.т.н., профессор, заведующий кафедрой биотехнологии и биотехнических систем, Северный (Арктический) федеральный университет, г. Архангельск;

Разговоров П.Б., д.т.н., профессор кафедры технологии пищевых продуктов и биотехнологии, Ивановский государственный химико-технологический университет, г. Иваново;

Сечин А.И., д.т.н., профессор, Федеральное агентство по образованию, НИУ РЭТ Томский политехнический университет, г. Томск.

Работа поступила в редакцию 15.07.2014.