Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,222

REPARATIVE REGENERATION OF THE EYE’S ANTERIOR WALL IN RESPONSE TO IMPLANTATION OF THE NANODISPERSED PLACENTA

Perevozchikov P.A. 1
1 Izhevsk State Medical Academy
В эксперименте на самцах белых крыс трехмесячного возраста с массой тела 220–300 г. изучена репаративная регенерация соединительнотканных структур передней стенки глаза животного методом иммуногистохимического анализа с определением экспрессии Ki-67 при имплантации биологического контейнера с нанодисперсной плацентой, крупноизмельченной плацентой, а также у ложнооперированных животных (разрез конъюнктивы без имплантации биологического контейнера). Пролиферативные процессы в виде образования рыхлой соединительнотканной капсулы в зоне операции с формированием в ней множеством новообразованных сосудов, активизация фибробластов были в значительной степени выражены при имплантации биоконтейнера с нанодисперсной плацентой. Отмечено усиление процессов пролиферации с активизацией фибробластов и формированием гемокапилляров в наружных и средних слоях склеры, прилежащей зоне имплантации биоконтейнера, только в группе животных с имплантацией биоконтейнера с нанодисперсной плацентой. Таким образом, нанодисперсная плацента за счет приобретения ею вследствие механоактивации новых физических свойств, таких как повышенная проницаемость и гидрофильность, значительно усиливает процессы пролиферации в соединительнотканных структурах передней стенки глаза реципиента.
In the experiment on male white rats of three-months age with the body weight of 220–300 g reparative regeneration of the connective-tissue structures of the anterior wall of the animals eye was studied by an immunohistochemical analysis with determination of Ki-67 expression when implanting the biological container with a nanodispersed placenta and the biological container with a coarse-ground placenta. The control group included animals with conjunctiva section without the implantation of the biocontainer. Proliferative processes such as the formation of a loose connective-tissue capsule in an operation zone with multiple angiogenesis and the fibroblast activation were considerably marked after the implantation of the biocontainer with a nanodispersed placenta. Strengthening of proliferation processes with fibroblast activization and the generation of haemocapillaries in external and middle layers of the sclera adjacent to the biocontainer impantation zone was noted only in group of animals implanted with the biocontainer with a nanodispersed placenta. Thus, due to mehanoactivation the nanodispersed placenta acquires new physical properties such as increased permeability and hydrophily and as a result the placenta substantially strengthens proliferation processes in the connective-tissue structures of the anterior wall of the recipient eye.
mechanoactivation
reparative regeneration
nanodispersed placenta
immunohistochemistry
1. Zharov V.V., Perevozchikov P.A., Lyalin A.N. The biological container for a revasсularization of connective tissue (The Russian Federation patent no. 2369361. The applicant and patent holder – Republican Ophthalmological Clinical Hospital; the application no. 2008113277/14 was registered 04.04.2008).
2. Kanukov V.N., Stadnikov A.A. Experimental and histological bases of new technologies in ophthalmosurgery. Orenburg: Yuzhniy Ural; 2009. 104 p.
3. Lapochkin V.I. Acquired myopia: classification, diagnosis, treatment regimen. In: Collection of scientific articles of the Russian scientific and practical conference of ophthalmologists with the international participation «The Izhevsk springs – 2008». Izhevsk, 2008, pp. 112–120.
4. Konygin G.N. et al. The mechanoactivated medicine of calcium a gluconate: X-ray diffraction, microscopic and X-ray electronic researches. Chemistry in interests of a sustainable development, 2005, Vol. 13, no. 3, pp. 249–252.
5. Muslimov S.A. Morphological aspects of regenerative surgery. Ufa: Bashkortostan; 2000. 168 p.
6. Perevozchikov P.A., Vasiliev U.G., Karban O.V. Morphological features of reparative regeneration after implantation of the biological material nanodispersed placental origin. Morphological newsletter, 2011, no. 4, pp. 37–42.
7. Perevozchikov P.A., Vasiliev U.G., Karban O.V. Stimulation of a collagenogenesis in scleral tissue in an experiment. Astrakhan Medical Journal, 2013, no. 1, pp. 187–190.
8. Zharov V.V. et all. Atomic Force Microscopy in Studying Regeneration of Tissues in Sclera Plasty in Ophthalmology / Journal of surface investigation. X-ray, synchrotron and neutron techniques, 2009, Vol. 3, no. 5, pp. 804–808.
9. Somov E.E. Scleroplastica. Petersburg: Peterburg Pidiatric Medical Institute; 1995. 144 p.
10. Sellheyer K., Spitznas M. Development of the human sclera: a morphological study / Graefe’s Archive Clin Exp Ophthalmol, 1988, no. 226, pp. 89–100.

Изучение процессов репаративной регенерации до сих пор остается актуальным в биологии и медицине [2, 5]. Особенно это важно для биологических тканей, в которых регенерация очень низка или практически отсутствует, в частности, в офтальмологии ‒ в ходе манипуляции для укрепления наружной стенки глаза при ее дистрофических процессах [3, 9, 10].

В предварительных исследованиях эффективности применения различных аллоплантов и имплантатов выявлено их значительное модулирующее влияние на поврежденные ткани [7]. Использование измельченных в порошок биологических материалов в виде крупнодисперсной взвеси уменьшает травматичность методики за счет минимизации разрезов слизистой оболочки, однако репаративная регенерация возникает также только на поверхности склеры в зоне ее введения [5, 6].

Известно, что измельчение до наноразмерной структуры вещества без изменения его химического состава изменяет в сторону увеличения его физические свойства: проникающую способность, гидрофильность и т.д. [4]. Однако изучение влияния имплантации биологических материалов, измельченных до наноразмерного уровня, на динамику репаративных процессов в соединительнотканных структурах передней стенки глаза в настоящее время не проводилось.

Цель исследования – изучить закономерности репаративной регенерации соединительнотканных структур передней стенки глаза в ответ на имплантацию нанодисперсной плаценты.

Материалы и методы исследования

Экспериментальные исследования выполнены на самцах белых крыс трехмесячного возраста с массой тела 220–300 г. В первой группе животным (опыт) под слизистую на склеру глаза под местной анестезией имплантировали биологический контейнер (БК) размерами 3,0 ± 0,5×1,0 ± 0,2 мм. Биоконтейнер представлял собой отрезок сосуда амниотической оболочки человека и был наполнен 0,05 ± 0,01 г порошком нанодисперсной плаценты, полученной методом механоактивации [1]. Порошок состоял [8] из отдельных частиц размером от 200 до 500 нм, сформированных зернами размером от 40 до 100 нм. Частицы в свою очередь образовывали слабосвязанные агломераты размером от 2 до 10 мкм. Во второй опытной группе животным под слизистую на склеру глаза под местной анестезией имплантировали биологический контейнер, заполненный порошком из крупноизмельченной плаценты с размерами частиц более 45 мкм, в аналогичной дозе. Третья группа животных (контроль) состояла из ложнооперированных крыс, которым под анестезией проводили разрез, аналогичный таковому в ходе имплантации.

Экспериментальные исследования проведены с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». Забой производили под тиопенталовым наркозом путем декапитации. Изучены группы животных к концу 3, 7, 30 и 60 суток после манипуляций (по 5 животных в каждой группе). Фиксацию осуществляли в 10 % растворе нейтрального формалина, заливали в парафин. Исследование структуры порошка измельченной плаценты человека и поверхности гистологических срезов зоны оперативного вмешательства проводились на сканирующей зондовой лаборатории Ntegra (NT-MDT) в прерывисто-контактной методике на воздухе после предварительной химической очистки от парафина. Аналогичным образом изучена структурная организация коллагеновых волокон в участках предварительно проведенных манипуляций. Для общего морфологического анализа препараты окрашивали гематоксилин-эозином. Изучение пролиферативной активности соединительнотканного окружения трансплантируемого материала выявляли иммуногистохимически с определением экспрессии Ki-67 ПАП методом.

Результаты исследования и их обсуждение

В ходе проведенных экспериментальных исследований выявлено, что постимплантационный период у животных протекал без видимых осложнений: отсутствовали признаки отторжения и вторичной инфекции.

В ранние сроки (3–7-е сутки) после имплантации БК во всех рассмотренных случаях имплантат сохранялся в обеих опытных группах. Отмечалась умеренная воспалительная инфильтрация как оболочки БК, представленной стенкой сосуда, так и окружающей конъюнктивы и субконъюнктивальной основы. Это проявлялось в лимфоцитарно-моноцитарных клеточных ответах, умеренной инфильтрации мононуклеарами тканей прилежащей склеры и конъюнктивы, появлении отдельных лейкоцитов в стенке и в содержимом БК. В контроле же проявления клеточных реакций были значительно менее выражены. Прилегающий участок склеры реципиента в первой опытной группе характеризовался разрыхлением стромы, между коллагеновыми волокнами которой видны нейтрофилы и лимфоциты, а также мелкие полихромно окрашенные пылевидные частицы, аналогичные наблюдаемым при исследовании гистологического среза БК. При этом отмечено сохранение наноразмерной структуры измельченной плаценты 40–100 нм. Разволокнение поверхностных слоев склеры во второй опытной группе было незначительное, их инфильтрация под БК не отмечалась. В контроле склера была интактна.

Иммуногистохимическое исследование с определением экспрессии Ki-67 ПАП методом показало выраженную пролиферативную активность клеток соединительно-тканной основы слизистой оболочки глаза вокруг БК (рис. 1, 2) в первой контрольной группе, умеренновыраженную пролиферативную активность в зоне имплантации БК с крупноизмельченной плацентой (рис. 3) и низкую пролиферативную активность в зоне разреза слизистой и подслизистой оболочек в опытной группе (рис. 4).

Через 30 суток после проведенной манипуляции как у контрольных, так и опытных животных зона внешней поверхности раневого повреждения подвергалась полной реэпителизации. В контроле на месте хирургического вмешательства сформировался рубец в виде ограниченного участка плотной волокнистой соединительной ткани с сетевидно распределенными коллагеновыми волокнами. Лейкоцитарно-клеточные реакции в зоне и непосредственно вокруг повреждения у контрольных животных отсутствовали. У животных опытных групп в зоне имплантации наблюдались остатки стенки БК в виде небольших скоплений участков эластических и коллагеновых волокон с наличием лимфоцитарно-клеточного ответа в них. У животных обеих опытных групп в непосредственном окружении БК наблюдались значительные клеточные скопления, включающие лимфоциты, пролиферирующие и зрелые клетки фибробластического ряда, эпителиоидные клетки.

При этом фибробласты формировали тонкую соединительную капсулу вокруг БК с множеством гемокапиляров и наличием эпителиоидных клеток, однако в первой опытной группе при имплантации БК с нанодисперной плацентой процессы клеточных реакций, а также формирование новых капилляров было более выражено. Кроме того, отмечалась пролиферативная активность клеток фибробластического ряда в прилежащей к БК склере реципиента, в ее поверхностных и средних слоях, а также формирование в них гемокапилляров, что практически отсутствовало во второй группе животных с имплантацией БК с крупноизмельченной плацентой.

pic_31.tif

Рис. 1. Обзорное изображение экспрессии Ki-67 в зоне имплантации биоконтейнера в 1-й опытной группе на 7-е сутки после вмешательства. Вторые антитела, меченные пероксидазой. Ув. х50: 1 – участок соединительной ткани с признаками высокой пролиферативной активности, 2 – остатки биоконтейнера; А – слизистая оболочка; Б – подслизистая оболочка

pic_32.tif

Рис. 2. Экспрессия Ki-67 в зоне, непосредственно прилежащей к имплантируемому биоконтейнеру в 1-й опытной группе на 7-е сутки после вмешательства. Вторые антитела, меченные пероксидазой. Ув. х200: 1 – пролиферативно активные клетки

pic_33.tif

Рис. 3. Экспрессия Ki-67 в зоне, непосредственно прилежащей к имплантируемому биоконтейнеру во 2-й опытной группе на 7-е сутки после вмешательства. Вторые антитела, меченные пероксидазой. Ув. х200: 1 – пролиферативно активные клетки

pic_34.tif

Рис. 4. Экспрессия Ki-67 в зоне механической травмы в контрольной группе на 7-ые сутки после вмешательства. Вторые антитела, меченные пероксидазой. Ув. х200: 1 – пролиферативно активные клетки

Через 60 суток в области разреза у контрольных животных участок хирургического вмешательства выявлялся в виде ограниченной зоны рубцовой ткани конъюнктивы. В обеих опытных группах БК практически полностью рассасывался. Вокруг донорских структур в первой опытной группе образовалась капсула, внутренние слои которой состояли из эпителиоидных клеток и крупных макрофагов. Наружные слои капсулы состояли из вновь образованной рыхлой соединительной ткани с множеством вновь сформированных сосудов, активных фибробластов. Новообразованная соединительная ткань по плотности приближалась к отдаленной от зоны имплантации. Макромолекулярная организация вновь образованных коллагеновых волокон указывала на достаточную степень их морфологической зрелости. Волокнистая организация межклеточного вещества склеры приобретала упорядоченный характер. При имплантации БК с крупноизмельченной плацентой данные процессы проявлялись в значительно меньшей степени. Толщина склеры во второй опытной группе была на 23 %, а в контроле на 31 % меньше по отношению к первой опытной группе.

Заключение

Таким образом, нанодисперсная плацента, по всей видимости, за счет приобретения ею новых физических свойств вследствие механоактивации, таких как повышенная проницаемость и гидрофильность, значительно усиливает процессы пролиферации в соединительнотканных структурах реципиента в зоне ее введения. Кроме того, повышаются репаративные свойства склеральной ткани при ее изначально низкой пролиферативной активности.

Рецензенты:

Васильев Ю.Г., д.м.н., профессор кафед­ры гистологии, эмбриологии и цитологии, ГБОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Ижевск;

Селякин С.П., д.м.н., профессор кафед­ры анатомии человека, ГБОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Ижевск.

Работа поступила в редакцию 18.02.2014.