Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,074

USE OF QUINAZOLINE (HINAZOLIL)-FORMAZANS COMPLEXES FOR IDENTIFICATION OF IONS NI2+, PB2+, CO2+ IN THE SEEDS OF PLANTS

Kuznetsova E.A. 1
1 The State Higher Education Professional Institution State University-Education-Science-Production Complex
Получены 4 вида формазанов с разными радикалами, которые представлены распространенными в биологических объектах функциональными группами: –Н, –СН3, –OCH3, –NO2. Приведены результаты спектрофотометрического исследования оптической плотности комплексных соединений тяжелых металлов Ni2+, Pb2+, Co2+ с лигандами группы хиназолил-формазанов. Изучена локализация комплексов формазанов с тяжелыми металлами в морфологических частях зерновки. Отмечено, что комплексы с никелем и кобальтом расположены главным образом в межклетниках, по которым осуществляется транспорт ионов. Комплексы со свинцом распределены в периферических слоях зерновки более равномерно, обнаруживаются в оболочках и клетках алейронового слоя. Выявленные свойства и закономерности позволят обоснованно разрабатывать методы очистки растительной продукции от загрязнения тяжелыми металлами в пищевых технологиях.
Received four types of formazans with different radicals, which are presented common in biological objects functional groups: –Н, –СН3, –OCH3, –NO2. The results of spectrophotometric analysis of the optical density of the complex heavy metals compounds consist of Ni2+, Pb2+, Co2+ with ligands of hinazolil-formazans. Localization of formazans complexes with heavy metals in the morphological parts of grains have been studied. It is noted that complexes containing of nickel and cobalt are located mainly in the intercellular spaces, ions transport is realized through these spaces. Complexes with lead are distributed in the peripheral layers of grains more evenly and can be found in the shells and aleurone layer cells. Identified properties and regularities allow feasible to develop methods for purification of plant products from contamination by heavy metals in food technology.
complex formation
hinazolil-formazan
heavy metals
localization
seeds
1. Dubcova Ju.Ju. Jekologicheskaja rol’ komplek­so­ obrazovanija kadmija i cinka s biologicheski aktivnymi ligandami v tkanjah rastenij: Dis….kand. biol. nauk. Novosibirsk, 2004 91 р.
2. Kuznecova E.A. Soderzhanie tjazhelyh metallov v pochvah tipichnogo agrolandshafta Orlovskoj oblasti i ih nakoplenie v zerne sel’skohozjajstvennyh kul’tur // Agrohimija. 2009. no. 8. рр. 60–64.
3. Larionov G.A. Vozmozhnost’ ispol’zovanija helatoobrazujushhih agentov dlja snizhenija soderzhanija tjazhelyh metallov v rastenijah / G.A. Larionov, K.A. Kirillov, M.A. Ershov // Materialy Vseros. nauchno-prakt. konf. «Agrojekologicheskie problemy sel’skohozjajstvennogo proizvodstva v uslovijah antropogennogo zagrjaznenija» // Ul’janovskaja gos. sel’skohoz. Akademija. Ul’janovsk, 2004. pp. 55–61.
4. Seregin I.V. Raspredelenie kadmija, svinca, nikelja i stroncija v nabuhajushhih zernovkah kukuruzy / I.V. Seregin, A.D. Kozhevnikova // Fiziologija rastenij. 2005. t/ 52. no. 4. pp. 635–640.
5. Jagodin B.A Kol’co zhizni. M.:ANO Nezavisimyj institut jekspertizy i sertifikacii, 2002. 135 p.
6. Turan M. Organic chelate assisted phytoextraction of B, Cd, Mo and Pb from contaminated soils using two agricultural crop spesies / M. Turan, I. Angin // Acta agr. Scand. Sect. A. 2004. Vol. 54, no. 4. pp. 221–231.

В эпоху глобального загрязнения окружающей среды зольный состав растений рассматривается как один из существенных показателей качества, без которого невозможна оценка сырья для производства продуктов питания.

Средние уровни содержания большинства тяжелых металлов в семенах растений, произрастающих в Орловской области в условиях производственных посевов, в целом соответствуют общим закономерностям, установленным для переноса макро- и микроэлементов в звене «почва – растение», и отражают существующие различия в химических свойствах и биологической роли элементов, видовых особенностях растений. Однако отмечается превышение 0,51 уровня ДУ и наличие сопоставимых с порогом фитотоксичности пределов накопления никеля и свинца, которые определены приоритетными загрязнителями исследованных агроценозов [2]. Именно этот факт придает особую актуальность выявлению механизмов химического отклика растений на токсическое действие тяжелых металлов и поиску способов снижения содержания загрязнителей в хозяйственно полезных частях растений. В то же время в растительной продукции в исследуемом регионе наблюдается недостаток биогенного химического элемента кобальта, а недостаточное поступление какого-либо микроэлемента приводит к отклонению от нормы роста растения или к прекращению развития [5]. В целях диагностики недостатка поступления кобальта в растительную продукцию и своевременной ликвидации дефицита элемента с помощью микроудобрений может представлять интерес гистохимический метод идентификации ионов кобальта в семенах растений.

Известно, что важным механизмом концентрирования тяжелых металлов, содержащихся в клетках растений, является их хелатирование – образование комплексных соединений. Лигандами могут быть органические кислоты, аминокислоты, фитохелатины, глютатион, никотинамид и другие органические соединения. Органические хелаты нашли широкое применение при разработке приемов снижения доступности тяжелых металлов растениям [3, 6], выявлении механизма детоксикации [1], изучении распределения по анатомическим частям органов растений [4].

Несмотря на огромное разнообразие природных соединений, образующих комплексы с тяжелыми металлами, набор функциональных групп, образующих непосредственно координационные связи с Pb2+, Ni2+, Со2+ в природных объектах, не велик. Хорошо окрашенные устойчивые комплексы образуются при взаимодействии тяжелых металлов с формазанами – органическими соединениями, содержащими группировки R1N = N–C(R2) = N–NH–R3.

Целью представленного исследования является изучение возможности использования комплексонов хиназолил-формазанового ряда для идентификации ионов Pb2+, Ni2+, Со2+ в семенах растений. Объектом исследования были зерно пшеницы и семена гороха. Материал для исследования представлен комплексонами, синтезированными по основному методу синтеза формазанов – азосочетанием соответствующих 2-хиноксалилгидразонов с арилдиазонией хлоридами при низкой температуре (t = 0–+ 5 °С) в присутствии десятикратного объема соляной кислоты. Строение формазанов подтверждено сходством их УФ- и ИК-спектров и окислением в соли тетразолия с последующим восстановлением в исходные формазаны. Полученные соединения – стабильные кристаллические вещества с температурами плавления от 102 до 180 °С, с максимумом поглощения в видимой области от 400 до 480 нм. Очистка формазанов проводилась кристаллизацией и хромотографически.

Состав комплексов и область значений рН, в которой они устойчивы, зависят не только от природы металла, но и от состава и строения групп радикалов. Были синтезированы 4 вида данного комплексона с разными радикалами Х, которые представлены распространенными в биологических объектах функциональными группами: –Н, –СН3, –OCH3, –NO2.Формула синтезированного комплексона представлена на рис. 1.

pic_60.wmf

Рис. 1. Комплексон 1-(хиназолил-4’)-3-фенил-5(п-фенил)-формазан, где Х = H, CH3, OCH3 или NO2

В состав молекулы каждого формазана входит комплексообразующий центр – имин (NH) формазановой группировки. Наличие такого реакционного центра обусловливает способность выбранных формазанов к комплексообразованию с ионами тяжелых металлов. Комплексообразователи подобраны таким образом, что они содержат как доноры, так и акцепторы электронной плотности. Выбор заместителей (доноров – акцепторов) предпринят с целью избирательности комплексообразователей к ионам металлов (увеличение разрешающей способности для обнаружения тех или иных металлов).

Для проведения дальнейших исследований готовили растворы формазанов с концентрацией 1 ммоль/л растворением точных навесок формазанов в водно-спиртовом растворе (соотношение воды и спирта Н2О:С2Н5ОН = 1:4) непосредственно перед использованием. Все растворы имели окраску различных оттенков желтого цвета. Для выявления способности давать окрашенные комплексы и определения максимума спектра поглощения готовили стандартные растворы Pb2+, Cd2+, Ni2+ с концентрацией 1 ммоль/л. Спектрофотометрическое исследование оптической плотности комплексных соединений и свободных комплексонов проводили на приборе СФ-46 в прямоугольной кварцевой кювете К-10. Значения оптической плотности определяли в диапазоне 220–680 нм. Контроль рН осуществляли с использованием рН-150М. Для проведения гистохимических исследований проводилась обработка продольных срезов семян растений водно-спиртовым раствором формазанов и при помощи микроскопа Axioskop 2 MAT фирмы «Carl Zeiss» методом контрастирования в светлом поле по характерному окрашиванию тканей идентифицировали места локализации ионов изучаемых химических элементов. С помощью электронного сканирующего микроскопа JEOL JSM 6390 была рассмотрена микроструктура внутренней части наружных покровов зерна пшеницы и семени гороха на продольных срезах нативных и обработанных хиназолил-формазаном семян.

Для выявления максимумов поглощения синтезированных формазанов были сняты спектры поглощения. Раствором сравнения служил водно-спиртовой раствор Н2O:С2Н5ОН = 1:4), толщина поглощающего слоя L = 10 мм. Спектрофотометрическое исследование полученных растворов комплексных соединений ТМ с лигандами хиназолил-формазанов показали, что в видимой и УФ-области спектров поглощения происходит изменение положения максимума по сравнению со спектрами свободных комплексообразователей. Результаты по комплексообразованию вышеперечисленных металлов с выбранными комплексонами представлены в таблице.

Проведенные исследования показали, что в результате комплексообразования с Ni2+ в видимой области спектра наблюдается появление новых максимумов поглощения по сравнению со спектрами свободных лигандов на длинах волн 450, 510, 600 нм (радикал -H), 590 нм – с радикалом –CH3, 450, 580, 600 нм (с радикалом –OCH3), 490, 500, 625 нм – с радикалом –NO2.

При образовании комплексных соединений хиназолил-формазанов с солью Pb2+ происходит изменение спектров поглощения комплексов по сравнению со спектрами свободных лигандов. У комплекса с формазаном, имеющим радикал –Н, – это максимум в видимой области спектра при длинах волн 425, 435, 445, 460 и 495 нм. У комплекса с радикалом –CH3 – это максимумы при длинах волн 490, 575 нм. У комплекса с радикалом -NO2 – новые максимумы при длинах волн 490, 505, 520, 535, 620 нм. У комплекса с радикалом –OCH3 появляется новый максимум на длине волны 490 нм, максимумы свободного лиганда на длинах волн 345, 540, 565, 600 нм исчезают.

Изменения, наблюдаемые в видимой и УФ-областях спектров поглощения при комплексообразовании с Pb2+, Ni2+, Со2+

Комплексообразователь, имеющий радикал

Положение максимума в спектре поглощения, нм

Свободный комплексон

Комплекс с Pb2+

Комплекс с Ni2+

Комплекс с Со2+

–Н

245, 295, 365

225, 240, 265, 355, 425, 435, 460,495

245, 280, .330, 385, 450, 510, 610

245, 275, 335, 375, 505

–CH3

270, 335, 345

240, 275, 335, 355, 490, 575

245, 275, 330, 375, 590

245, 275, 335,515

–OCH3

270, 335, 345, 410, 540, 565, 600

240, 275, 490

275, 335, 450, 580, 600

275, 335

–NO2

270, 335, 430, 450

240, 275, 335, 490, 505, 520, 535,620

270, 325, 335,625

270, 340, 490,

Для кобальтовых хелатных соединений характерно сохранение λmax – 270 нм в случае с формазаном, имеющим радикал NO2 (небольшое смещение на 5 нм с комплексонами¸ имеющими радикалы –CH3 и –OCH3) и λmax = 335 нм со смещением вправо на 5 нм относительно спектра свободного лиганда. При этом исчезают в видимой области λmax = 410, 540, 565, 600 в случае с комплексоном, содержащим радикал –OCH3; λmax = 430, 450 нм – с ; с формазанами, имеющими радикалы NO2 и –CH3, наоборот, появляются новые в области 515 нм.

При смешивании растворов лигандов с растворами солей свинца, никеля и кобальта наблюдались видимые изменения окраски растворов. Комплексные соединения хиназолил-формазанов, содержащие в своем составе все 4 радикала с солью Ni2+, имели насыщенное синее окрашивание; с солью РЬ2+ – розовое окрашивание; с солью Со2+ наблюдалась окраска от светло-серого до темно-серого цвета.

Наибольшую интенсивность при одинаковых длинах волн имеют комплексные соединения исследуемых тяжелых металлов с хиназолил-формазаном, содержащим в качестве радикала –СН3.Окраска этих комплексов, наблюдаемая визуально, имеет более интенсивные по яркости оттенки.

Поэтому для дальнейших гистохимических исследований было отдано предпочтение комплексону 1-(хиназолил-4’)-3-фенил-5-(п-метилфенил) формазану, содержащему в качестве радикала –СН3.

Обработка зерна злаковых культур формазаном позволяет при гистохимическом исследовании зерновки обнаружить локализацию тяжелых металлов в ее периферических частях по характерному окрашиванию тканей.

Результаты микроскопических исследований, проводимые с использованием микроскопа Axioskop 2 MAT фирмы «Carl Zeiss» методом контрастирования в светлом поле представлены на рис. 2.

В результате микроскопических исследований обнаружено, что комплексы с никелем и кобальтом расположены главным образом в межклетниках, по которым осуществляется транспорт ионов. Комплексы со свинцом распределены в периферических слоях зерновки более равномерно, обнаруживаются в оболочках и клетках алейронового слоя. Это указывает как на сорбцию ионов структурными полисахаридами матрикса клеточных стенок, так и на локализацию их в вакуолях и других клеточных структурах.

pic_65.tif pic_63.tif

Рис. 2. Локализация тяжелых металлов в периферических частях зерновки пшеницы: 1 – синее окрашивание, характерное для комплексов с никелем; 2 – розовое окрашивание, характерное для комплексов со свинцом; 2 – серое окрашивание, характерное для комплексов с кобальтом

С помощью электронного сканирующего микроскопа JEOL JSM 6390, используя увеличение х2000, была рассмотрена микроструктура внутренней поверхности семенной оболочки зерновки пшеницы и семени гороха на продольных срезах нативного семени и обработанного хиназолил-формазаном (рис. 3).

1 pic_61.tif 2 pic_64.tif

3 pic_66.tif 4 pic_62.tif

Рис. 3. Микроструктура внутренней поверхности семенной оболочки зерновки пшеницы: 1 – без обработки; 2 – обработанной комплексоном и семени гороха; 3 – без обработки; 4 – обработанного комплексоном

Изменения, происходящие в микроструктуре семян растений, визуально определяются на поверхности матрикса клеточных стенок в виде светящихся кристаллидных отложений величиной от 2 до 5 мкм, содержащих Pb2+, Ni2+, Со2+, определяемые с помощью рентгеноспектрального ЭДС детектора miniCup в системе электронного сканирующего микроскопа.

Выполненные исследования позволяют продемонстрировать локализацию Pb2+, Cd2+ и Ni2+ в периферических частях зерновки, что является одним из путей изучения проявления механизмов толерантности растений к металлическим загрязнениям. Выявленные свойства и закономерности позволят идентифицировать загрязнения тяжелыми металлами растительного сырья в процессе его переработки, обоснованно разрабатывать методы очистки растительной продукции от загрязнения тяжелыми металлами в пищевых технологиях, а также обнаружить недостаточное количество биогенных элементов в растительной продукции с целью корректировки обогащения ими рационов питания и кормления сельскохозяйственных животных.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант 12-04-97586 р_центр_а).

Рецензенты:

Иванова Т.Н., д.т.н., профессор, зав. кафедрой «Технология и товароведение продуктов питания», Госуниверситет УНПК, г. Орел;

Осипова Г.А., д.т.н., доцент кафедры «Технология хлебопекарного, кондитерского и макаронного производства», Госуниверситет-УНПК, г. Орел.

Работа поступила в редакцию 23.09.2013.