Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,222

THE PEPTIDE HORMONES CCK, ANP AND ANG II INDUCED OSCILLATIONS OF CYTOSOLIC CALCIUM IN ADIPOCYTES OF WHITE FAT

Turovsky E.A. 1 Turovskaya M.V. 1 Tolmacheva A.V. 1 Dolgacheva L.P. 1 Zinchenko V.P. 1 Dynnik V.V. 2
1 Institute of Cell Biophysics
2 Institute of Theoretical and Experimental Biophysics
В экспериментах на культивируемых адипоцитах мышей (9 дней in vitro) с использованием флуоресцентной микроскопии показано, что пептидные гормоны: предсердный натрийуретический пептид (ANP), холецистокинин (ССК) и ангиотензин II (AngII) вызывают периодические высокоамплитудные Са2+-колебания. Колебания, индуцированные ANP, подавлялись конкурентным ингибитором ADP-рибозилциклазы (CD38) – никотинамидом. Колебательные режимы, инициированные холецистокинином, подавлялись ингибиторами фосфолипазы С и протеинкиназы G, но не подавлялись ингибиторами NO-синтазы. Низкие концентрации (1–50 нМ) ангиотензина II вызывали Са2+-колебания в части адипоцитов, тогда как более высокие концентрации AngII (0,1–0,5 мкМ) вызывали транзитное увеличение [Ca2+]i. Преинкубирование адипоцитов с ингибитором фосфатидил-инозитол-3-киназы – вортманнином приводило к уменьшению амплитуды Ca2+-ответа, а ингибирование протеинкиназы G с помощью КТ5823 снижало скорости увеличения и откачки [Ca2+]i.
In experiments on mouse white adipocytes (9 DIV in vitro) using fluorescent microscopy and imaging analysis systems it was shown that a peptide hormones cholecystokinin (CCK), Atrial natriuretic peptide (ANP) and angiotensin II (Ang II) induced periodical high-amplitude Ca2+-oscillations. ANP induced Ca2+-oscillations were suppressed by competitive antagonist of ADP-ribosylcyclase (CD38) – nicotinamide. CCK induced oscillatory regimes were suppressed by antagonists of phospholypase C and protein kinase G but were not inhibited with using antagonist of NO-synthase. AngII at low concentration (1–50 nM) initiated Ca2+-oscillations in some of adipocytes. Ca2+-oscillations were lost with using higher concentration (0,1–0,5 мкМ) of AngII and only transitory Ca2+-responses were recorded. The amplitude of transitory Ca2+-responses were decreased after pre-incubation of adipocytes with wortmannin (phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor), and inhibition of the protein kinase G with КТ5823 evoked reduction of the rates of [Ca2+] increasing and recovery.
Ca2+-oscillations
adipocytes
atrial natriuretic peptide
cholecystokinin
angiotensin II
1. Birkenfeld A.L., Boschmann M., Engeli S., Moro C, Arafat A.M., Luft F.C., Jordan J. Atrial natriuretic peptide and adiponectin interactions in man // PLoS One. 2012. Vol. 7. рр. 43238.
2. Darimont C., Vassaux G., Ailhaud G., Negrel R. Differentiation of preadipose cells: paracrine role of prostacyclin upon stimulation of adipose cells by angiotensin II // Endocrinol. 1994. Vol. 135. рр. 2030–2036.
3. Jilka R.L., O’Brien C.A., Ali A.A., Roberson P.K., Weinstein R.S., Manolagas S.C. Intermittent PTH stimulates periosteal bone formation by actions on post-mitotic preosteoblasts //Bone. 2009. Vol. 44. рр. 275–286.
4. Khan A.M., Cheng S., Magnusson M., Larson M.G., Newton-Cheh C., McCabe E.L., Coviello A.D., Florez J.C., Fox C.S., Levy D., Robins S.J., Arora P., Bhasin S., Lam C.S., Vasan R.S., Melander O., Wang T.J. Cardiac natriuretic peptides, obesity, and insulin resistance: evidence from two community-based studies // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2011. Vol. 96. рр. 3242–3249.
5. Kim S., Whelan J., Claycombe K., Reath D.B., Moustaid-Moussa N. Angiotensin II increases leptin secretion by 3T3-L1 and human adipocytes via a prostaglandin-independent mechanism // J. Nutr. 2002. Vol. 132. рр. 1135–1140.
6. Kotani K., Sakane N., Saiga K. Tsuzaki K., Sano Y., Mu H., Kurozawa Y. The angiotensin II type 2 receptor gene polymorphism and body mass index in healthy Japanese women // Ann. Clin. Biochem. 2007. Vol. 44. рр. 83–85.
7. Lafontan M., Moro C., Berlan M., Crampes F., Sengenes C., Galitzky J. Control of lipolysis by natriuretic peptides and cyclic GMP // Trends. Endocrinol. Metab. 2008. Vol. 19. рр. 130–137.
8. Schling P., Mallow H., Trindl A., Löffler G. Evidence for a local reninangiotensin system in primary cultured human preadipocytes // Int. J. Obes. 1999. Vol. 23. рр. 336–341.
9. Sengenes C., Berlan M., De Glisezinski I., Lafontan M., Galitzky J. Natriuretic peptides: a new lipolytic pathway in human adipocytes // FASEB J. 2000. Vol. 14. рр. 1345–1351.
10. Smeets R.L., Fouraux M.A., van Emst-de Vries S.E., De Pont J.J., Willems P.H. Protein kinase C-mediated inhibition of transmembrane signalling through CCK(A) and CCK(B) receptors // Br. J. Pharmacol. 1998. Vol. 123. рр. 1189–1197.
11. Turovsky E.A., Turovskaya M.V., Berezhnov A.V., Tolmacheva A.V., Kaimachnikov N.P., Dolgacheva L.P., Zinchenko V.P., Maevskii E.I., Dynnik V.V. Convergence of Ca2+-signaling pathways in adipocytes. The role of L-arginine and protein kinase G in generation of transient and periodic Ca2+-signals // Biochemistry (Moscow). 2012. Vol. 6. рр. 35–44.

Предсердный натрийуретический пептид (ANP) преимущественно продуцируется предсердными кардиомиоцитами и регулирует липолиз в жировой ткани [9], усиливает высвобождение адипоцитами свободных жирных кислот. Стимуляция мобилизации липидов у человека при физических нагрузках происходит за счет увеличения уровня ANP в плазме. Понижение уровня циркулирующих натрийуретических пептидов отмечается при развитии инсулиновой резистентности и диабета 2-го типа [4]. Рецептор к натрийуретическому пептиду относится к группе рецепторов, содержащих гуанилатциклазу, активация которого приводит к повышению внутриклеточного уровня сGMP, фосфорилированию гормон-чувствительной липазы и перилипина А протеинкиназой G (PKG).

ССК – гормон и нейропептид, продуцируемый кишечником, который регулирует чувство сытости и выделение панкреатических гормонов. Рецептор к холецистокинину сопряжен с G-белком, PLC, PI3K и Са2+-системой сигнализации. Помимо классического пути передачи сигнала, обусловленного G-белком, CCK-рецептор сопряжен с рядом путей, характерных для тирозинкиназных рецепторов: MAP киназный путь, включая ERK, JNK и p38-MAPK; PI3K путь; и PLC-гамма путь [10].

Ренин-ангиотензиновая система представляет собой объединение ферментов и гормонов, регулирующих артериальное давление, электролитный и водный баланс [8]. Известно, что предшественник ангиотензина II ангиотензиноген синтезируется и секретируется адипоцитами. Показано, что AngII регулирует липогенез в адипоцитах, взаимодействуя с AngII рецепторами 2-го типа (AT2R) [6]. Нокаут по рецептору препятствует ожирению. Как и инсулин, AngII действует через рецепторы с тиразинкиназной активностью и запускает сигнальный каскад с участием фосфоинозитид-3-киназы. Также показано, что в адипоцитах мыши AngII инициирует секрецию простациклина, который вызывает процессы пролиферации и дифференцировки жировых клеток [2], увеличивает экспрессию гена лептина и его секрецию [5].

Материалы и методы исследования

В экспериментах использовали первичную культуру белых адипоцитов мыши на 9 день культивирования (9 DIV), полученную из мезенхимальной фракции стволовых клеток эпидидимального жирового депо в соответствии с общепринятой методикой [11]. Измерение динамики цитозольного кальция ([Ca2+]i) проводили с помощью системы анализа изображений «Cell observer» (Carl Zeiss, Германия), на базе моторизованного микроскопа Axiovert 200M с высокоскоростной черно-белой CCD-камерой AxioCam HSm. Источником света служила ртутная лампа НВО 100. Возбуждение флуоресценции Fura-2 проводили при двух длинах волн (340 и 387 нм) с использованием запирающих светофильтров BP 340/30 и BP 387/15.

Результаты исследования и их обсуждение

Предсердный натрийуретический пептид в широком диапазоне концентраций (3 нМ – 10 мкМ) вызывал в культивируемых белых адипоцитах периодические Са2+-колебания двух типов (рисунок, а), отличающихся не только амплитудой и периодом, но и наличием лаг-фазы в части клеток, предшествующей началу колебаний (рисунок, а, кривая 1). Колебания, индуцированные данным пептидом, подавлялись конкурентным ингибитором фермента рибозилциклазы (CD38) – никотинамидом (NAM) (рисунок, а), а также ингибиторами протеинкиназы G и рианодинового рецептора (не показано). К появлению двух типов колебаний приводила также аппликация негидролизуемого аналога цГМФ и активатора PKG – 8-Bromo-cGMP (рисунок, б). Таким образом, можно предположить, что в генерации колебаний под действием ANP происходит активация сигнального каскада, включающего ряд внутриклеточных ферментов: sGC → cGMP → PKG → CD38 → cADPR, что вызывает мобилизацию [Ca2+]i через рианодиновый рецептор. Известно, что ANP в использованных нами концентрациях стимулирует липолиз в адипоцитах за счет увеличения уровня cGMP, активации cGMP-зависимой протеинкиназы (PKG), фосфорилирующей гормон-чувствительную липазу и перилипин [7]. Значение колебаний цитозольного кальция в процессе липолиза остается невыясненным, однако в ряде работ показана их ведущая роль в регуляции процессов пролиферации и дифференцировки клеток [3]. Экспериментальные исследования in vitro и in vivo показали, что ANP вызывает выход адипонектина и адипокина, способных вызывать увеличение чувствительности к инсулину [1]. По-видимому, Са2+-сигнальная система, управляемая ANP, участвует в процессах секреции адипонектина и адипокина.

Добавление AngII в диапазоне концентраций 1–50 нМ инициировало кальциевые колебания в 5–10 % адипоцитов (рисунок, в), тогда как в большинстве клеток наблюдалось либо медленное увеличение Са2+в цитозоле, либо транзитное его повышение. Более высокие концентрации AngII (0,1–0,5 мкМ) вызывали транзитное увеличение [Ca2+]i (рисунок, г – кривая 2), а периодических режимов не наблюдалось. Колебательные ответы не возникали после опустошении эндоплазматического ретикулума тапсигаргином, однако медленные Са2+-сигналы сохранялись в этих условиях и исчезали в бескальциевой среде, что указывает на активацию депо-управляемых Са2+-каналов плазматической мембраны. Ингибиторы фосфатидил-инозитол-3-киназы – вортманнин, и протеинкиназы G – КТ5823 оказывали влияние на Са2+-ответы под действием AngII. Вортманнин понижал амплитуду [Ca2+]i сигнала, а ингибитор PKG снижал скорости увеличения и откачки [Ca2+]i (рисунок, г – кривая 1) за счет неполного ингибирования каналов мобилизации кальция из эндоплазматического ретикулума и Са2+-АТФаз плазматической мембраны.

Добавление холецистокинина (ССК) в диапазоне концентраций 10–100 нМ также инициировало в дифференцированных клетках белого жира колебательные режимы [Ca2+]i (рисунок, д). Ингибиторы фосфолипазы С и IP3-рецептора подавляли Са2+-колебания, инициированные ССК, однако к такому же эффекту приводило и ингибирование протеинкиназы G (рисунок, е). В данном случае в генерации колебаний возможно участие двух петель положительной обратной связи – короткая: (Са2+ → IP3-рецептор → Са2+) и длинная: (Са2+ → PLC → IP3 → IP3-рецептор→Ca2+). В виду того, что нами ранее было показано функционирование в адипоцитах PI3-киназного сигнального каскада с участием: eNOS → sGC → PKG → CD38 → RyR → Са2+, направленного на мобилизацию Са2+ через рианодиновый рецептор [11], и поскольку ССК-рецепторы активируют и этот путь, в определенных условиях возможно тандемное включение автоколебательного механизма Ca2+-зависимого выброса Ca2+ через канал рианодинового рецептора. Колебания подавлялись в присутствии ингибитора (5 мкМ KT5823) одной из ключевых молекул (PKG) приведенного выше сигнального пути, и в этом случае пептид ССК вызывал лишь импульсное повышение Са2+, которое устранялось в присутствии ингибиторов фосфолипазы С и IP3-рецептора.

pic_59.tif

Изменение [Ca2+]i в дифференцированных белых адипоцитах под действием пептидных гормонов. Эффекты ингибиторов ключевых ферментов сGMP-сигнального каскада:а – аппликация предсердного натрийуретического пептида (ANP) в концентрации 1 мкМ (кривая 1) и 100 нМ (кривая 2) вызывает появление колебаний [Ca2+]i, которые подавляются 1 мМ конкурентного ингибитора рибозилциклазы – никотинамидом (NAM); б – активатор протеинкиназы G (аналог циклического ГМФ) в концентрации 100 нМ; в – аппликация 50нМ ангиотензина II (Ang II); г – аппликация 100 нМ ангиотензина II вызывает транзитное увеличение Са2+в цитозоле адипоцитов (кривая 2 – контроль), а ингибирование протеинкиназы G при предварительном инкубировании клеток с 5 мкМ КТ5823 (кривая 1) значительно уменьшает скорости входа и откачки [Ca2+]i; д – аппликация холецистокинина (ССК) в концентрации 10 нМ (кривая 1) и 100 нМ (кривая 2) вызывает появление колебаний [Ca2+]i; е – преинкубирование клеток с ингибитором протеинкиназы G – КТ5823 препятствует генерации колебаний на добавление ССК

Заключение

Таким образом, пептидные гормоны ангиотензин II, холецистокинин и предсердный натрийуретический пептид, взаимодействуя с рецепторами адипоцитов белого жира, могут вызывать колебания концентрации внутриклеточного Са2+ и оказывать модулирующее действие на физиологические сигналы. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что все исследованные пептиды активируют Са2+-систему сигнализации в белых адипоцитах и при этом могут быть задействованы различные внутриклеточные пути передачи сигналов. Каждый из исследованных пептидных гормонов имеет собственный рецептор и разветвленный сигнальный каскад, но в клетках белого жира активация любого из рецепторов исследованных пептидов может приводить в определенных условиях к появлению периодических режимов нескольких типов. Полученные данные носят приоритетный характер, поскольку периодические и затухающие Са2+-колебания, стохастические процессы и распространение Са2+-волн наблюдались неоднократно в экспериментах на клетках других типов, а в адипоцитах ранее были зарегистрированы только импульсные Са2+-ответы. Следует отметить, что основные известные изменения в системе передачи сигналов при инсулиновой резистентности и диабете 2-го типа прежде всего происходят в Са2+-системе сигнализации. Дальнейшие исследования связи наблюдаемых режимов активации Са2+-системы сигнализации с регуляцией липидного обмена позволят понять причины развития диабета 2-го типа при ожирении.

Работа выполнена при финансовой поддержке: Президиума РАН (программа № 7, проект № 01201258223); Министерства образования и науки Российской Федерации (ГК 16.512.11.2092, проект № 01201179771); ФНМ (проект № 01201256033); РФФИ (проект № 10-04-01306).

Рецензенты:

Новоселов В.И., д.б.н., профессор лаборатории механизмов рецепции, Институт биофизики клетки РАН (ИБК РАН), г. Пущино;

Асланиди К.Б., д.ф.-м.н., лаборатория регуляции внутриклеточных процессов, Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН (ИТЭБ РАН), г. Пущино.

Работа поступила в редакцию 11.07.2013.