Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,087

PRENATAL HORIOIDAL ANGIOGENESIS

Reva G.V. 1 Yamamoto Т. 1, 2 Reva I.V. 1, 2 Novikov A.S. 1 Lomakin A.V. 1 Krasnikov Y.A. 1 Аbdullin E.A. 3 Аlbrandt К.F. 1, 3 Моjilevskaya Е.S. 1 Chaika V.V. 1 Golochvast К.S. 1 Vashenko E.V. 1 Usov V.V. 1 Gulkov A.N. 1 Panichev A.M. 1 Gaponko O.V. 3
1 Far Eastern Federal University
2 International Medical Research Center
3 Regional Сlinical Hospital (RCH) № 2
Известно, что ведущими механизмами в патогенезе возрастной макулярной дистрофии (ВМД) являются сосудистые нарушения. С решением проблем индукции васкуляризации сосудистой оболочки появится возможность разработки патогенетически обоснованного лечения заболеваний органа зрения, связанных с ангиодисгенезом. Изучение механизмов васкуляризации структур сосудистой оболочки глаза человека является наиболее актуальным на современном этапе, знание механизмов меланогенеза в сосудистой оболочке глаза человека может пролить свет на проблему развития ВМД и опухолей не только в структурах глаза, но и решить проблему онкогенеза в целом. Поэтому с помощью современных иммуногистохимических методов исследования изучена роль эффекторных клеток иммунофагоцитарного звена в развитии сосудистой оболочки. Изучены различные фенотипы CD – эффекторов, маркирующихся на ранних этапах развития глаза человека в структурах сосудистой оболочки глаза человека. Мониторинг не только формирования сосудистого бассейна, но и меланизации структур хориоидеи позволили составить алгоритм развития сосудистого бассейна в онтогенезе человека и установить роль эффекторных иммуноцитов различной кластерной дифференцировки в ангиогенезе цилиарного тела, радужки и собственно сосудистой оболочки.
Known that the leading mechanisms in the pathogenesis of age-related macular degeneration (AMD) is vascular disorders. With the induction of vascular of vascularization shell will be able to develop an informed treatment pathogenetically diseases associated with angiodisgenesis. Study on mechanisms of vascularization of choroid is most relevant at the present stage, the knowledge of the mechanisms of melanogenesis in vascular clad eyes may shed light on human development problem AMD and neoplasms not only within the structures of the eye, but also solve the problem of oncogenesis. Therefore, using modern methods of research examined the role of immune histochemical effector cells immune phagocytes levels in the development of the choroid. Studied a variety of phenotypes of CD-effectors,are marked in the early stages of development, the human eye choroid in the structures. Monitoring not only the formation of vascular pool and melanes structures provided a choroidal vascular development pool algorithm in human ontogenesis and install a different cluster of differentiation to effector immunocytes in angiogenesis of IRIS, ciliares body and choroid.
age-related macular degeneration
diabetic retinopathy
melanogenesis
angiogenesis
choroid
1. Amissah-Arthur K.N., Panneerselvam S., Narendran N., Yang Y.C. Optical coherence tomography changes before the development of choroidal neovascularization in second eyes of patients with bilateral wet macular degeneration // Eye (Lond). 2012 Mar; 26(3): 394–9.
2. Arora K.S., Jefferys J.L., Maul E.A., Quigley H.A. The choroid is thicker in angle closure than in open angle and control eyes // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2012, Nov 27; 53(12): 7813–8.
3. Baba T., McLeod D.S., Edwards M.M., Merges C., Sen T., Sinha D., Lutty G.A. VEGF 165 b in the developing vasculatures of the fetal human eye // DevDyn. 2012 Mar; 241(3): 595–607.
4. Birke K., Lütjen-Drecoll E., Kerjaschki D., Birke M.T. Expression of podoplanin and other lymphatic markers in the human anterior eye segment // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2010 Jan; 51(1): 344–54.
5. Chan-Ling T., Dahlstrom J.E., Koina M.E., McColm J.R., Sterling R.A., Bean E.G., Adamson S., Hughes S., Baxter L.C. Evidence of hematopoietic differentiation, vasculogenesis and angiogenesis in the formation of human choroidal blood vessels // Eye Res. 2011 May; 92(5): 361–76.
6. Gendron S.P., Bastien N., Mallet J.D., Rochette P.J. The 3895-bp mitochondrial DNA deletion in the human eye: a potential involvement in corneal ageing and macular degeneration // Mutagenesis. 2013 Mar; 28(2): 197–204.
7. Grossniklaus H.E., Ling J.X., Wallace T.M., Dithmar S., Lawson D.H., Cohen C., Elner V.M., Elner S.G., Sternberg P. Jr. Macrophage and retinal pigment epithelium expression of angiogenic cytokines in choroidal neovascularization // Mol Vis. 2002 Apr 21; 8: 119–26.
8. Jhanji V., Liu H., Law K., Lee V.Y., Huang S.F., Pang C.P., Yam G.H. Isoliquiritigenin from licorice root suppressed neovascularisation in experimental ocular angiogenesis models // Br J Ophthalmol. 2011 Sep; 95(9): 1309–15.
9. Hernandez-Pastor L.J., Ortega A., Garcia-Layana A., Giraldez J. Ranibizumab for neovascular age-related macular degeneration // Am J Health Syst Pharm. 2008 Oct 1; 65(19): 1805–14.
10. Figurska M., Robaszkiewicz J., Wierzbowska J. 2010; 112(4–6): 147–50. Safety of ranibizumab therapy in wet AMD and the role of vascular endothelial growth factors in physiological angiogenesis // KlinOczna.
11. Lubiński W., Mozolewska-Piotrowska K., Krasodomska K., Penkala K., Kaźmierczak B., Karczewicz D. Evaluation of treatment efficacy of intravitrealranibizumab injections in patients with wet type of AMD // KlinOczna. 2012; 114(3): 187–93.
12. Lutty G.A., Hasegawa T., Baba T., Grebe R., Bhutto I., McLeod D.S. Development of the human choriocapillaris // Eye (Lond). 2010 Mar; 24(3): 408–15.
13. Machalińska A., Safranow K., Mozolewska-Piotrowska K., Dziedziejko V., Karczewicz D. PEDF and VEGF plasma level alterations in patients with dry form of age-related degenerationa possible link to the development of the disease // KlinOczna. 2012; 114(2): 115–20.
14. Oh H., Takagi H., Takagi C., Suzuma K., Otani A., Ishida K., Matsumura M., Ogura Y., Honda Y. The potential angiogenic role of macrophages in the formation of choroidalneovascular membranes // Invest Ophthalmol Vis Sci. 1999 Aug; 40(9): 1891–8.
15. Sayanagi K., Sharma S., Kaiser P.K. Photoreceptor status after antivascular endothelial growth factor therapy in exudative age-related macular degeneration // Br J Ophthalmol. 2009 May; 93(5): 622–6.

Согласно результатам эпидемиологических исследований, возрастная макулярная дегенерация (ВМД) является ведущей причиной слепоты и слабовидения у лиц старшей возрастной группы [1, 6]. Более 90 % случаев слепоты от ВМД связано с развитием так называемой «влажной» или экссудативной формы заболевания, которая характеризуется аномальным, патологическим ростом новообразованных сосудов [14]. Анализ доступной литературы по структуре органа зрения человека за 2010–2013 годы показал практическое отсутствие морфологических данных на фоне публикаций многочисленных результатов физиологических и молекулярно-генетических исследований глаза [3]. Проблема неоваскуляризации при ВМД и диабетической ретинопатии могла бы быть решена с помощью изучения механизмов физиологической регенерации ключевых структур сосудистой оболочки, определения источников развития её структур, получения полного представления о механизмах васкуляризации и меланогенеза в сосудах и строме хориоидеи в онтогенезе человека, т.к. репаративные процессы в основе своих механизмов имеют те же аспекты, что и при физиологической регенерации [4, 7]. Всё это определяет уровень актуальности выполненного исследования.

Целью нашего исследования является изучение хориоидального ангиогенеза глаза человека в пренатальном онтогенезе.

Задачами исследования послужили проведение мониторинга ангиогенеза и меланогенеза от периода закладки до обособления структур сосудистой оболочки глаза человека: радужки, цилиарного тела, собственно сосудистой оболочки, а также выявление роли иммунофагоцитарных эффекторных клеток в индукции ангиогенеза.

Материалы и методы исследования

Изучены 191 глаз эмбрионов и плодов человека. Использованы классические гистологические методы исследования с окрашиванием г/э; Victoriablue и импрегнация серебром, а также иммуногистохимические методы на выявление NADFH-диафоразы, CD4, CD8, CD 68, CD163, CD 204, TUNEL-метод на выявление апоптозирующих клеток, Ki67 для выявления пролиферативной активности, Ironhematoxilin. Анализ материала проведён с помощью микроскопа Olympus – Bx51 и цифровой камеры CD25 с фирменным программным обеспечением.

Результаты исследований и их обсуждение

Нами установлено, что в эмбриональный период сосудистая оболочка представляет собой общий с наружной соединительно-тканной оболочкой мезенхимный зачаток как на переднем полюсе, так и на заднем (рис. 1, а). Сосудистая оболочка и фиброзная на переднем полюсе и на заднем представлены мезенхимной тканью из звёздчатых клеток, образующих сеть с ячейками, по которым диффузно осуществляется трофическое обеспечение структур глаза человека. В плодный период, начиная с 10 недели, реализуется обособление сосудистой оболочки и её структуризация, формирование особенностей на переднем, заднем полюсе и в зоне прилегания к хрусталику. К 11 неделе пренатального онтогенеза идентифицируются радужка (рис. 1, б), цилиарное тело в виде петель из пигментных клеток (рис. 1, в) и собственно сосудистая оболочка заднего полюса глаза, в которой появляются многочисленные клетки с выраженной базофилией, придающие хориоидее более яркий цвет при окрашивании гематоксилин-эозином (рис. 1, е).

Начиная с 12 недели слабо развитая сосудистая оболочка плотно прилегает к склере, цилиарное тело (ЦТ) и радужка (Р) представляют собой листки пигментного эпителия, образующие полости, мышечных волокон практически нет, цилиарное тело формирует длинные и тонкие отростки (рис. 2).

а pic_51.tif б pic_52.tif в pic_53.tif

Рис. 1. Структуры средней оболочки глаза человека в дососудистый период развития: а – эмбриональный период; б, в – 11 недель пренатального развития; в – радужка (р); в – цилиарное тело глаза плода человека. Сосудистая оболочка (1а) идентифицируется в виде более ярко окрашенной полоски по сравнению с наружной фиброзной оболочкой. Окраска б, в – импрегнация серебром; а – гематоксилин-эозином. х – хрусталик; р – радужка; цт – цилиарное тело; с – сетчатка; со – сосудистая оболочка. Микрофото. Ув. х400

а pic_54.tif б pic_55.tif в pic_56.tif г pic_57.tif

Рис. 2. Цилиарное тело глаза плода человека:а ‒ глаз плода 12 недель пренатального периода развития; б – ЦТ плода 14 недель; в – плод 16 недель; г – 18 недель; окраска гематоксилин-эозином. а–б–окраска гематоксилин-эозином; в, г – иммунная гистохимия на выявление CD68. С – строма отростков цилиарного тела глаза человека; э – эпителий. Микрофото. Ув. а–в х400; г – 200

Беспигментный эпителий отростков цилиарного тела в первую половину плодного периода не окрашивается гематоксилин-эозином, как и клетки Мюллеровской глии в сетчатке, стекловидном теле и собственном веществе роговицы. С 14-й недели плодного периода покрывающий отростки цилиарного тела беспигментный эпителий окрашивается гематоксилин-эозином (рис. 2, б). Это служит косвенным подтверждением происхождения беспигментного эпителия из радиальных глиоцитов в результате миграции астроцитарной нейроглии из нейральной сетчатки глазного бокала в дососудистый период, которая также проявляет хромофобные свойства при окрашивании красителями. Как только процесс дифференцировки заканчивается, беспигментный эпителий приобретает свойства клеток с другой специализацией, клетки становятся хромофильными. Дополнительное подтверждение происхождения пула беспигментных эпителиоцитов к нейроглии получено с помощью иммунной гистохимии при взаимодействии эпителия с маркёрами на белок S100 (рис. 3). При этом нами отмечено, что сначала появляется пигментный эпителий, а затем беспигментный (рис. 3, а,б). В строме цилиарного тела идентифицируются иммуноциты CD68, что свидетельствует об их участии в перестройке структуры и процессах васкуляризации стромы хориоидеи.

На 14–15 неделе пренатального развития сначала в собственно хориоидее, а затем последовательно в цилиарном теле и в радужке начинает формироваться хориоидальная сосудистая система.

а pic_58.tif б pic_59.tif

Рис. 3. Пигментный и беспигментный эпителий цилиарного тела глаза плода человека. Иммунная гистохимия на выявление белка S100: Пэ – пигментный эпителий; м – макрофаг; цэ – цилиарный эпителий. Микрофото. Ув. х800

Ангиогенез протекает в классическом варианте:

1. Появление сосудистых лакун на месте кровяных островков (рис. 4, а).

2. Образование синусоидных капилляров (рис. 4, б).

3. Период наступления функциональной зрелости хориоидальных сосудов, которая проявляется возникновением всех структурных элементов, типичных для стенки артерий и вен – плоского эндотелия, эластических волокон и перицитов (рис. 4, в).

4. Дифференцировка сосудистого бассейна с образованием артериол и венул.

5. Окончательное формирование хориоидального сосудистого бассейна(рис. 4, г).

Формирование сосуда в строме развиваещейся сосудистой оболочки сопровождаются утратой внутренними клетками ангиогенного островка контактов на периферии островка. Происходит уплощение клеток с высоких призматических до плоских на периферии островка. Уплощение клеток соответствует началу гистогенеза мембраны на люминальной поверхности стенки формирующегося сосуда. Люминальная мембрана характеризуется прерывистостью, на светооптическом уровне идентифицируется как однослойная. Часть внутренних клеток островка контактирует с люминальной мембраной. Также в этот период идентифицируются лейкоциты в просвете сосудов хориоидеи глаза плода человека 32 недели плодного периода пренатального онтогенеза. Появляются слабо пигментированные меланоциты в строме хориоидеи. Стенка сосуда в этот период лишена пигментоцитов. На люминальной поверхности кровеносного сосуда хориоидеи методом VictoriaBlue на выявление эластических волокон идентифицируется мощный каркас в стенке сосуда. Это может быть связано с особыми физиологическими тканевыми запросами формирующихся структур и условиями функционирования.

а pic_60.tif б pic_61.tif в pic_62.tif г pic_63.tif

Рис. 4. Кровеносные сосуды сосудистой оболочки глаза человека второй половины плодного периода пренатального онтогенеза. Окраска а, б, в – гематоксилин-эозином; г – Victoriablue. С – строма; сс – сосуды стромы; мб – мембрана Бруха; пэ – пигментный эпителий; п – пигментная клетка наружной оболочки сосуда. Микрофото. Ув. х400.

Хориоидея глаза плода человека с 16 недели не только васкуляризуется, но и приобретает пигмент сначала вокруг кровеносных сосудов, а затем в строме оболочки количество пигмента увеличивается(рис. 5, а–в).

а pic_64.tif б pic_65.tifв pic_66.tif

Рис. 5. Сосуды глаза человека в разные сроки пренатального периода:а – окраска гематоксилин-эозином; б–в – иммуннаягистохимия на выявление CD163. Стрелками указаны макрофаги. Микрофото. Ув. х600

В наших исследованиях во всех растущих капиллярах почки роста имели макрофаги, которые также идентифицировались и вокруг более крупных сосудов (рис. 5, б, в). Анализ исследуемого материала с помощью иммуногистохимических методов показал, что иммунофагоциты представлены фенотипами CD163.

Наличие макрофагов CD 163 в структурах сосудистой оболочки свидетельствует о том, что они принимают активное участие не только в васкуляризации, но и в меланогенезе сосудов и стромы хориоидальных структур, т.к. по имеющимся литературным данным именно макрофаги стимулируют ангиогенез, секретируя фактор роста эндотелия, а также выделяют цитокины, индуцирующие меланогенез.

Следует отметить, что в наших исследованиях приоритет в развитии хориоидеи получают те структуры, которые в дальнейшем являются непреодолимым препятствием для разрастающихся сосудов. Мы считаем, что мембрана Бруха, пигментные эпителиоциты наружного листка глазного бокала являются мощными ингибиторами прорастания сосудов в фоторецепторный слой. Морфологическая характеристика структуры фибробластов даёт основания предполагать, что они имеют отношение по своему происхождению к нейроглиальным мигрантам из внутреннего листка глазного бокала. Это очень важный факт, который может способствовать разработке терапевтических методов лечения макулодистрофии, т.к. терапию ингибирования ангиогенеза при ВМД необходимо разрабатывать не с учётом мезенхимных фибробластов, а искать ключ к лечению необходимо на основе знания свойств клеток предшественников нейроглии. Калибр сосудов от мелких до крупных размеров, поэтому наши данные противоречат некоторым данным об отсутствии отличий диаметра сосудов в разных слоях сетчатки.

У плода 19–20 недель идентифицируются мышцы (рис. 6), расширяющие и суживающие зрачок (сфинктер и дилататор). При этом нами отмечено, что часть мышц морфологически идентична гладкомышечным клеткам, а часть, несмотря на форму гладкомышечных клеток, имеет ярко выраженную поперечную исчерченность и периферическое расположение ядра. Утолщается строма радужки и цилиарного тела. Появляется щелевидное пространство между склерой и сосудистой оболочкой. Также нами получены доказательства, что различные отделы сосудистой оболочки развиваются не одновременно на всём протяжении. В тот период, когда сосуды хориоидеи уже идентифицируются, в её участках, соответствующих височному и назальному секторам, кровеносные сосуды отсутствуют (рис. 7, а и б).

а pic_67.tif б pic_68.tif в pic_69.tif г pic_70.tif

Рис. 6. Мышцы сосудистой оболочки. Окраска гематоксилин-эозином: гмк – гладко-мышечные клетки; ппк – поперечно-полосатые мышечные волокна. Микрофото. Ув. х 400

а pic_71.tif б pic_72.tif

Рис. 7. Хориоидея глаза плода человека 16 недель. Окраска гематоксилин-эозином. Ст – стекловидное тело; с – сетчатка; пэ – пигментный эпителий; со – сосудистая оболочка; кс – кровеносый сосуд; мб – мембрана Бруха; м – меланоциты. Микрофото. Ув. х 400

В периоде формирования сосудистого бассейна в хориоидее в просвете кровеносных сосудов выявляются эритроциты, часть из которых имеет ядра. С 14 недели в крови, кроме безъядерных эритроцитов, обнаруживаются веретеновидные, овальные и круглые лейкоциты, причём в некоторых можно наблюдать пролиферативную активность. Иммуногистохимический анализ показал, что в крови сосудистой системы плода преобладают лейкоциты с фенотипом CD163. Этот факт позволяет сделать предположение о том, что на данном этапе перестройка ткани сосудистой оболочки нуждается в большей степени в антигенпрезентирующих клетках (CD68) и макрофагах (CD163), участвующих в физиологической регенерации системы кровоснабжения сосудистой оболочки глаза плода человека. По нашему мнению, роль макрофагов должна заключаться не только в секреции факторов роста эндотелия, но и в утилизации клеток, вступивших в апоптоз. Ещё одной потенциальной функцией может быть создание микрокружения для прогениторных стволовых нейроглиальных клеток, стимулирующее их дифференцировку и специализацию в нужном направлении.

Заключение

Таким образом, источником развития сосудистой оболочки глаза служит не только нейромезенхима, окружающая глазной бокал, по нашим данным, с 6 недели в зачаток сосудистой оболочки происходит миграция нейроглиальных клеток, являющихся стволовыми прекурсорными клетками для структур хориоидеи. В наших результатах новым является установление дополнительного источника развития сосудистой оболочки в отличие от данных других авторов [12]. Ангиогенез характеризуется подобной для других структур морфологической картиной развития сосудов [5]. Закономерности васкулогенеза укладываются в рамках классической концепции развития сосудистого бассейна Куприянова В.В. (1998). Последовательно происходит образование кровяных островков из мезенхимных клеток, уплощение и дифференцировка нейромезенхимоцитов в эндотелиоциты капилляров [5]. Роль антигенпрезентирующих и фагоцитирующих иммуноцитов в апоптозе структур, являющихся временными в развитии хориоидеи глаза человека, выполняют иммуноциты CD68 и CD163, что отмечали и другие авторы [4, 15]. Установлено, что в развитии сосудистой системы участвуют митотически делящиеся эндотелиальные клетки, являющиеся местными камбиальными, расположенные непосредственно в стенке растущих капилляров, а формирование стромы радужки, хориоидеи и цилиарного тела происходит за счёт клеток–мигрантов из внутренней стенки глазного бокала. Вопросы механизмов индукции и ингибирования хориокапилляров во многом противоречивы, на современном этапе они являются предметом многочисленных исследований [9–11]. Эмбриональные механизмы ангиогенеза могут проявиться при патологических процессах, развивающихся в глазу, поэтому требуют дальнейшего глубокого изучения [2]. Клинические доказательства о потенциальной перспективности применения современных препаратов в лечении глазной патологии требуют дальнейших исследований. Открытие Рева Г.В. (2011) участия прогениторных нейроглиальных клеток–мигрантов из внутренней стенки глазного бокала в развитии структур прозрачных сред глаза человека привело к изменению концепций структуры не только хрусталика, стекловидного тела, роговицы, но и концепции развития мембраны Бруха, которую многие авторы считают более ранней по сравнению с сосудистой развивающейся структурой [12]. Согласно нашим исследованиям, мембрана Бруха формируется раньше других структур хориоидеи, имеет ярко выраженное клеточное строение. Уплощаясь, клетки приобретают веретеновидную форму, длинные отростки, контактирующие между собой. Как и прозрачные среды глаза, мембрана Бруха обладает свойствами барьера для неоваскуляризации и служит препятствием для прорастания сосудов из хориоидеи в фоторецепторный слой сетчатки не только в пренатальном онтогенезе, но и в постнатальном.

Механизмы ангиогенеза рассматривались многими авторами [8, 13], но так и не был решён вопрос о распределении индукторов и ингибиторов ангиогенеза в хориоидее. Часть авторов приводят данные о том, что пигментный эпителий имеет специфическое распределение ингибиторов на базальной поверхности, и на основании этого был сделан вывод о том, что именно пигментные эпителиоциты вырабатывают вещества, подавляющие ангиогенез. Учитывая роль мембраны Бруха, можно сделать вывод о том, что клетки пигментного эпителия получают путём диффузии его от структур, прилежащих к пигментоцитам. Наличие в почках роста капилляров макрофагов, фенотипированных как CD68, сделан вывод о том, что главным поставщиком фактора роста эндотелия в хориоидее являются макрофаги, что не противоречит имеющимся данным о том, что при неоваскуляризации хориоидеи при патологии, макрофаги и пигментный эпителий экспрессируют ангиогенные цитокины [7].

Меланизирующиеся клетки в строме и стенке сосудов имеют контакты с макрофагами фенотипов CD68 и CD163, что позволяет сделать вывод о роли макрофагов АПК и моноцитарных в хориоидальном меланогенезе. Меланогенез стромальных пигментоцитов предшествует этим процессам у меланоцитов сосудистой стенки, что подтверждает раннее заселение меланобластами стромы сосудистой оболочки, дифференцировку и специализацию.

Рецензенты:

Храмова И.А., д.м.н., профессор, врач акушер-гинеколог, Приморский краевой диагностический центр, г. Владивосток;

Шульгина Л.В., д.б.н., профессор, заведующая лабораторией микробиологии ФГУП «ТИНРО-Центр», г. Владивосток.

Работа поступила в редакцию 07.05.2013.